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酶讲义
第五章酶化学
要求掌握：
酶的概念，酶的化学本质。
酶的特性，米氏方程和Km的意义。
酶活力的概念，酶活性的调节方式。
熟悉：
酶的国际系统分类与命名法。
酶的基本动力学。
酶的分离纯化技术。
了解：
酶催化的机理，酶的应用及酶工程。
重点内容：
酶的概念，酶的特性，酶活性的别构调节和共价修饰调节，米氏方程和Km的意义。
难点内容：
酶促反应动力学，酶活性的调节，酶催化的机理。
关于酶的研究
1、1857年，Pasteur等提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果。
2、1897年，Büchner兄弟证明发酵与细胞活动无关，说明了酶活动的化学本质。
3、1878年，Kühne提出“Enzyme”---原意为“在酵母中”
4、1894年，Fisher提出了酶作用专一性的“锁与钥匙”学说。
5、1903年，Henri提出酶作用的中间复合物学说。
6、1913年，Michaelis和Menten推导出酶作用的动力学方程—米氏方程
7、1926年，美国Sumner首次获得脲酶结晶，证明酶的化学本质是蛋白质
8、1965年，Phillips首次用X-射线衍射测定出鸡蛋清溶菌酶的三维空间结构。
9、1982-1983，TCech和Altman发现有催化活性的RNA----核酶（ribozyme）。
10、1986年，Schultz与Lerner研制出有催化作用的抗体---抗体酶（abzyme）
第一节概述
一、酶（Enzyme）的概念
---酶是生物催化剂
酶是活细胞产生的具有催化功能的生物大分子。
二、酶的命名
三、酶的分类和系统编号
（一）酶的分类
国际系统分类根据酶催化反应的性质分为六大类：
1、氧化还原酶类2、转移酶类
3、水解酶类4、裂合酶类
5、异构酶类6、合成酶类
（三）酶的分类编号
第二节酶的化学本质和结构
一、酶的化学本质
（1）绝大多数酶是蛋白质
（2）Ribozyme
核酶：
指具有催化活性的RNA
Ribozyme的发现：
•1982年，TCech发现四膜虫的26SrRNA前体加工生成的L19RNA具有催化活性。
•1983年，SAltman等发现核糖核酸酶P（RNaseP）的RNA具有催化活性。
二、酶的组成
（一）根据酶分子化学组成分为：
1、单纯酶
2、结合酶
全酶：
酶蛋白
辅助因子辅酶：
与酶蛋白结合
不牢固
辅基：
与酶蛋白结合很牢固
•酶蛋白决定酶的作用的专一性；
•辅助因子决定酶反应的性质，主要起传递氢、电子、化学基团等作用。
（二）根据酶分子结构特点
分为：
1、单体酶
2、寡聚酶：
酶分子具有多个亚基，具有四级结构。
3、多酶体系：
多个酶分子形成催化链状反应体系。
多酶体系分类：
•可溶性的多酶体系
•结构化的多酶复合体
•在细胞结构上定位的多酶体系
三、维生素和辅酶----见P254
•维生素是机体维持正常生命活动所必不可少的一类有机物质。
•维生素一般习惯分为脂溶性和水溶性两大类。
其中脂溶性维生素在体内可直接参与代谢的调节作用，而水溶性维生素是通过转变成辅酶对代谢起调节作用。
（一）水溶性维生素与辅酶
•某些小分子有机化合物与酶蛋白结合在一起并协同实施催化作用，这类分子被称为辅酶（或辅基）。
•辅酶是一类具有特殊化学结构和功能的化合物。
参与的酶促反应主要为氧化-还原反应或基团转移反应。
•大多数辅酶的前体主要是水溶性B族维生素。
许多维生素的生理功能与辅酶的作用密切相关。
1、维生素PP和NAD和NADP
•菸酸和菸酰胺，在体内转变为辅酶I和辅酶II。
•能维持神经组织的健康。
缺乏时表现出神经营养障碍，出现皮炎。
•NAD（烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸，又称为辅酶I）和NADP（烟酰胺-腺嘌呤磷酸二核苷酸,又称为辅酶II）是维生素烟酰胺的衍生物，
2、核黄素（VB2）和FAD和FMN
•核黄素（维生素B2）由核糖醇和6，7-二甲基异咯嗪两部分组成。
•缺乏时组织呼吸减弱，代谢强度降低。
主要症状为口腔发炎，舌炎、角膜炎、皮炎等。
FAD和FMN
•FAD（黄素-腺嘌呤二核苷酸）和FMN（黄素单核苷酸）是核黄素（维生素B2）的衍生物，
3、泛酸和辅酶A（CoA）
•维生素（B3）-泛酸是由，-二羟基--二甲基丁酸和一分子-丙氨酸缩合而成。
辅酶A（CoA）
•辅酶A是生物体内代谢反应中乙酰化酶的辅酶，它的前体是维生素（B3）泛酸。
4、叶酸和四氢叶酸（FH4或THFA）
•四氢叶酸是合成酶的辅酶，其前体是叶酸（又称为蝶酰谷氨酸，维生素B11）。
5、维生素B12辅酶
•维生素B12又称为钴胺素。
维生素B12分子中与Co+相连的CN基被5’-脱氧腺苷所取代，形成维生素B12辅酶。
•维生素B12辅酶的主要功能是作为变位酶的辅酶，催化底物分子内基团（主要为甲基）的变位反应。
结构
6、硫胺素
•硫胺素（维生素B1）在体内以焦磷酸硫胺素（TPP）形式存在。
缺乏时表现出多发性神经炎、皮肤麻木、心力衰竭、四肢无力、下肢水肿。
焦磷酸硫胺素（TPP）
•焦磷酸硫胺素是脱羧酶的辅酶，它的前体是硫胺素（维生素B1）。
7、硫辛酸
•硫辛酸是少数不属于维生素的辅酶。
硫辛酸是6,8-二硫辛酸，有两种形式，即硫辛酸（氧化型）和二氢硫辛酸（还原型）.
8、吡哆素
•吡多素（维生素B6，包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺）。
磷酸吡哆素
•磷酸吡哆素主要包括磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺。
它的
9、生物素
•生物素是羧化酶的辅酶，它本身就是一种B族维生素B7。
10、辅酶Q（CoQ）
•辅酶Q又称为泛醌，广泛存在与动物和细菌的线粒体中，其结构为：
11、维生素C
•在体内参与氧化还原反应，羟化反应。
人体不能合成。
（二）脂溶性维生素
•维生素A,D,E,K均溶于脂类溶剂，不溶于水，在食物中通常与脂肪一起存在，吸收它们，需要脂肪和胆汁酸。
1、维生素A
•维生素A分A1,A2两种，是不饱和一元醇类。
维生素A1又称为视黄醇，A2称为脱氢视黄醇。
2、维生素D
•维生素D是固醇类化合物，主要有D2,D3,D4,D5。
其中D2,D3活性最高。
维生素D的结构
•在生物体内，D2和D3本身不具有生物活性。
它们在肝脏和肾脏中进行羟化后，形成1，25-二羟基维生素D。
其中1，25-二羟基维生素D3是生物活性最强的。
3、维生素E
•又叫做生育酚，目前发现的有6种，其中，，，四种有生理活性。
4、维生素K
•维生素K有3种，K1,K2,K3。
其中K3是人工合成的。
维生素K是2-甲基萘醌的衍生物。
（三）辅酶在酶促反应中的作用特点
•辅酶在催化反应过程中，直接参加了反应。
•每一种辅酶都具有特殊的功能，可以特定地催化某一类型的反应。
•同一种辅酶可以和多种不同的酶蛋白结合形成不同的全酶。
•一般来说，全酶中的辅酶决定了酶所催化的类型（反应专一性），而酶蛋白则决定了所催化的底物类型（底物专一性）。
（四）酶分子中的金属离子
•根据金属离子与酶蛋白结合程度，可分为两类：
金属酶和金属激酶。
•在金属酶中,酶蛋白与金属离子结合紧密。
如Fe2+/Fe3+、Cu+/Cu3、Zn2+、Mn2+、Co2等。
•金属酶中的金属离子作为酶的辅助因子，在酶促反应中传递电子，原子或功能团。
金属激酶中的金属离子
•激酶是一种磷酸化酶类，在ATP存在下催化葡萄糖，甘油等磷酸化。
•其中的金属离子与酶的结合一般较松散。
在溶液中，酶与这类离子结合而被激活。
•如Na+、K+、Mg2+、Ca2+等。
金属离子对酶有一定的选择性,某种金属只对某一种或几种酶有激活作用。
第三节酶的催化特性
一、酶促反应的本质
1、酶是催化剂
•用量少，效率高
•只影响反应速率，不改变反应平衡点
2、酶加速反应的本质
----降低反应的活化能
3、酶作用的中间产物假说
----见P268
S+EESE+P
S:
substrateE:
enzyme
P:
product
二、酶的作用特点
（一）催化效率高
酶的转换数（turnovernumber）:
每秒钟每个酶分子能催化底物的µmol数。
多数酶为1000，有的可达几十万甚至百万以上。
（二）高度的专一性
酶对底物的专一性类型
1、绝对专一性：
只作用于一种底物。
如脲酶
2、相对专一性：
键专一性/基团专一性。
如胰蛋白酶
3、立体异构专一性
（1）旋光异构专一性
如L-氨基酸氧化酶
（2）几何异构专一性
如延胡索酸酶只作用于顺丁烯二酸
（三）反应条件温和
常温、常压、中性PH
（四）酶分子易失活
高温、强酸、强碱等引起蛋白质变性的因素都可造成酶失去催化活性。
（五）酶活性受调节控制
第四节酶的结构和催化机制
一、酶的活性中心
（一）概念
酶分子上的几个必需基团，或许在一级结构上相距甚远，甚至位于不同的肽链上，但折叠后相互靠近并形成具有一定空间构象、与酶催化活性直接相关的结构区域，称为酶的活性中心。
1、酶活性中心的功能部位
酶活性中心
结合中心：
负责结合底物，决定酶的专一性
催化中心：
负责催化底物化学转变，决定化学反应的性质
有些酶的结合中心和催化中心是同一部位。
2、酶的必需基团
酶分子发挥催化功能所必须的化学基团。
包括两种：
一是维持空间构象的必需基团；如-SH。
二是酶活性中心的基团。
包括与底物结合的结合基团和直接参与酶催化作用的催化基团。
（二）酶活性部位的测定
-----见P271
1、切除法
2、化学修饰法
3、X-射线衍射法
•酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。
三、酶作用专一性的机制
•酶分子活性中心部位，一般都含有多个具有催化活性的手性中心，这些手性中心对底物分子构型取向起着诱导和定向的作用，使反应可以按单一方向进行。
•酶能够区分对称分子中等价的潜手性基团。
1.“三点结合”的催化理论
•认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。
只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。
2.锁钥学说：
•认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。
酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样
3.诱导契合学说
•该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.
•酶催化作用的本质是酶的活性中心与底物分子通过短程非共价力（如氢键,离子键和疏水键等）的作用，形成E-S反应中间物。
•其结果使底物的价键状态发生形变或极化，起到激活底物分子和降低过渡态活化能作用。
1.邻基效应和定向效应
•在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；
•另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。
2、共价催化
又称为亲核催化或亲电子催化。
催化时，酶的亲核基团或亲电子基团能分别放出电子或汲取电子，作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间物，降低反应活化能，使反应加速。
3、底物形变（张力学说）
在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成复合物的实际上是底物形成的过渡态，底物与反应基团之间产生一种立体排斥张力，从而使底物敏感键。
4、酸碱催化
•通过瞬时地向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速化学反应。
•狭义的酸碱催化-----H和OH
•广义的酸碱催化---质子供体和受体
酶分子中可以作为广义酸、碱的基团
•广义酸基团广义碱基团
•（质子供体）（质子受体）
•组氨酸的咪唑基pKa值约为6.0,在生理PH条件下既可以作为质子供体，又可以作为质子受体，在广义酸碱催化中起重要作用。
•咪唑基给出或接受质子的速度十分迅速。
五、酶原激活---见P274
•酶在生物体内首先合成的是无催化活性的前体形式，称为酶原。
•酶原在激活剂（通常也是酶）作用下切除分子中的部分肽段，转化为有活性的酶，此即酶原的激活。
•酶原的激活是不可逆的。
第五节酶促反应动力学
一、酶反应速率
酶促反应速率可以用单位时间内，单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
酶反应速率单位：
浓度/单位时间
二、影响酶促反应速率的因素
•酶浓度
•底物浓度
•pＨ
•温度
•激活剂
•抑制剂
（一）酶浓度对反应速度的影响
•在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应。
•当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。
1、米氏方程---推导见P277
米氏（Michaelis-Menten）方程
-----描述底物浓度和酶反应速率关系的公式
2.Km的意义
米氏常数Km的重要意义
（1）米氏常数是反应速度为1/2Vmax时的底物浓度，单位为mol/L
（2）Km值是酶的一个重要的特征物理常数
只与酶的结构、酶催化的底物和反应环境（如温度、pH、离子强度）有关，与酶的浓度无关在严格条件下，不同的酶具有不同Km值，它可以通过测定Km鉴定不同的酶。
3.米氏常数的求法
•双倒数作图法
•Hanes作图法
（三）pH对酶促反应速度的影响
•pH影响酶或底物的解离。
•pH影响底物的可解离基团。
•在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常称此pH为最适pH。
（四）温度的影响
•一方面是温度升高,酶促反应速度加快。
•另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。
•因此大多数酶都有一个最适温度。
在最适温度条件下,反应速度最大。
（五）激活剂对反应速度的影响
（六）抑制剂对酶活性的影响
•凡能使酶的催化活性降低或丧失而不引起酶蛋白变性的现象，称为酶的抑制作用。
•能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。
酶抑制作用分为两种类型
可逆性抑制作用
不可逆性抑制作用
可逆性抑制作用
（1）竞争性抑制作用
竞争性抑制使酶的表观Km增加，Vmax不变
（2）非竞争性抑制作用
非竞争性抑制使酶的Km不变，Vmax减小
（3）反竞争性抑制作用
（七）抑制作用的意义----见P282
第六节酶的活力测定和及纯化
一、酶的活性测定
（一）定性测定
（二）活力单位---定量测定
1、酶活力：
酶催化一定化学反应的能力。
通常以一定条件下，酶所催化的化学反应的速率来表示。
酶促反应速率可以用单位时间内，单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
酶反应速率单位：
浓度/单位时间
2、酶活力单位（activeunit,U）
•根据酶在最适条件下，单位时间内酶作用底物的减少量或产物的生成量规定的。
如：
á-淀粉酶的活力单位规定为：
在60℃，pH6.2条件下，每小时催化1g可溶性淀粉液化所需要的酶量规定为一个活力单位。
3、酶活力的国际单位
1961年，国际酶学委员会（EC）规定酶的国际单位（internationalunit,IU）:
在标准条件下：
1分钟内转化1μmol底物的酶量定义为1IU。
如果底物有一个以上可被作用的键，则1分钟内转化1μmol基团的酶量定义为1IU。
（三）酶的比活力与酶纯化的指标
1、酶的比活力
单位质量酶蛋白所含的酶活力单位数，通常以U/mg表示。
比活力是衡量酶纯度的指标，比活力越大，酶纯度越高。
当酶完全纯化时，酶比活力达到最大值，并且衡定。
2、酶纯化的两个指标
（1）酶总活力的回收率=
纯化部分酶的总活力单位数
粗提液中酶的总活力单位数
（2）酶的纯化倍数=
纯化部分酶的比活力
粗提液中酶的比活力
（四）酶的转换数（turnovernumber）
表示酶的催化中心活性，指每秒钟酶的每一催化中心所能转换的底物分子数。
单位：
个/催化中心；μmol/μmol催化中心
•酶的转换数数值上相当于米式方程推导中的K3
Vmax=K3[ES]=K3[E]
酶的转换数=Vmax/[E]
（五）酶活力的测定方法
测定酶活力必须测定酶反应的初速率。
酶反应开始不久的一段时间内产物生成量和反应时间成正比，此即酶反应的初速率。
能客观表示酶的活力。
1、化学分析法
酶反应一定时间后，终止反应，测定底物的减少量或产物的增加量。
2、分光光度法
根据产物和底物光吸收性质的不同测定吸收光谱的变化来直接反映酶活力。
如还原型辅酶NADH+H+和NADPH+H+
在340nm有光吸收
氧化型辅酶NAD+和NADP+
在340nm没有光吸收
几乎所有脱氢酶活力可通过测定340nm光吸收值的变化来测定。
3、量气法
4、PH测定法
用高灵敏度的PH计测定反应液的PH变化来测定酶活力。
也可用恒定PH测定法，引起的H+浓度变化，可不断加入碱或酸中和使PH恒定，用加入碱或酸的速率表示酶活力。
酯酶活力测定可用此法。
5、氧和过氧化氢的极谱测定
6、酶的偶联测定法
己糖激酶
葡萄糖+ATP葡萄糖-6-磷酸+ADP
NADP+
葡萄糖-6-脱氢酶磷酸
NADPH+H+
葡萄糖酸-6-磷酸
第七节酶的调节
一、酶活性的调节
1、酶原与酶原的激活
有些酶如消化系统中的各种蛋白酶以无活性的前体形式合成和分泌，然后，输送到特定的部位，当体内需要时，经特异性蛋白水解酶的作用转变为有活性的酶而发挥作用。
这些不具催化活性的酶的前体称为酶原（zymogen）。
如胃蛋白酶原（pepsinogen）、胰蛋白酶原（trypsinogen）和胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）等。
某种物质作用于酶原使之转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活。
使无活性的酶原转变为有活性的酶的物质称为活化素。
活化素对于酶原的激活作用具有一定的特异性。
2、别构酶
别构酶（allostericenzyme）往往是具有四级结构的多亚基的寡聚酶，酶分子中除有催化作用的活性中心也称催化位点（catalyticsite）外；还有别构位点（allostericsite）．后者是结合别构剂（allestericeffector）的位置，当它与别构剂结合时，酶的分子构象就会发生轻微变化，影响到催化位点对底物的亲和力和催化效率。
若别构剂结合使酶与底物亲和力或催化效率增高的称为别构激活剂（allostericactivator），反之使酶底物的r亲和力或催化效率降低的称为别构抑制剂（allostericinhibitor）。
酶活性受别构剂调节的作用称为别构调节（allostericregulation）作用．别构酶的催化位点与别构位点可共处一个亚基的不同部位，但更多的是分别处于不同亚基上．在后一种情况下具催化位点的亚基称催化亚基，而具别构位点的称调节亚基。
多数别构酶处于代谢途径的开端，而别构酶的别构剂往往是一些生理性小分子及该酶作用的底物或该代谢途径的中间产物或终产物。
故别构酶的催化活性受细胞内底物浓度、代谢中间物或终产物浓度的调节。
终产物抑制该途径中的别构酶称反馈抑制（feedbackinhibition）．说明一旦细胞内终产物增多，它作为别构抑制剂抑制处于代谢途径起始的酶，及时调整该代谢途径的速度，以适应细胞生理机能的需要。
别构酶在细胞物质代谢上的调节中发挥重要作用。
故别构酶又称调节酶。
（regulatoryenzyme）
3、酶的共价修饰调节
酶蛋白肽链上的一些基团可通过共价键与某种小的化学基团发生可逆结合，从而使酶在活性形式与非活性形式转变。
二、同工酶（isoenzme）
1.
2.
催化相同的化学反应,酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。
第八节酶的应用
一、个别酶
-------P287
二、酶在工业中的应用
--------见289
三、固定化酶（imoblisedenzyme）
1、什么是固定化酶
将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之束缚在固体介质上，成为水不溶性的固定化酶，既保持酶的催化特性，又具有易回收、可反复利用等优点，这种酶应用技术称为固定化酶。
2、固定化酶的制备方法
（1）吸附法
（2）载体偶联法（共价法）
（3）交联法
（4）包埋法
-------见P116图5-17
3、固定化酶的应用
四、酶工程
酶工业化应用的相关技术。
包括化学酶工程和生物酶工程。
1、化学酶工程
（1）天然酶应用
（2）化学修饰酶
（3）酶的固定化
（4）人工模拟酶
2、生物酶工程
（1）克隆酶
基因工程技术大量生产酶。
（2）突变酶
通过修饰酶的基因生产遗传修饰酶。
（3）创造新基因酶
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