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论文

密级：

NANCHANGUNIVERSITY

学士学位论文

THESISOFBACHELOR

（2010—2014年）

题目蒲氏钩蝠蛾海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆

学院：

生命科学与食品工程学院系：

生物系

专业班级：

生物科学101班

学生姓名：

阮传洋学号：

5601110022

指导教师辛天蓉职称：

讲师

起讫日期：

2014.02-2014.06

南昌大学

学士学位论文原创性申明

本人郑重申明：

所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。

除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果。

对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。

本人完全意识到本申明的法律后果由本人承担。

作者签名：

日期：

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。

本人授权南昌大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。

保密□，在年解密后适用本授权书。

本学位论文属于

不保密□。

（请在以上相应方框内打“√”）

作者签名：

日期：

导师签名：

日期：

蒲氏钩蝠蛾海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆

专业：

生物科学学号：

5601110022

学生姓名：

阮传洋指导教师：

辛天蓉

摘要

蒲氏钩蝠蛾是冬虫夏草的寄主昆虫种类之一,分布在西藏色季拉山海拔4100～4650m的高寒灌丛草甸和高寒草甸。

海藻糖-6-磷酸合成酶是植物海藻糖合成途径的关键酶。

本文通过RT-PCR技术获得cDNA，经巢式PCR等步骤获得几丁质合成酶基因。

运用软件对其结构、功能、基本性质进一步分析，并进行克隆。

关键词：

海藻糖-6-磷酸合成酶；分析；克隆

Abstract

Thitarodespui isoneofthe host insectspecies ofCordycepssinensis, distributedinTibet SejilaMountain elevation4100 ~4650m alpineshrub meadowandalpinemeadow. Trehalose-6-phosphatesynthse isthekeyenzymeoftrehalosesynthesis

Pathway.Inthispaper, accesstocDNAvia RT-PCRtechnology, thenestedPCR stepstoobtain chitinsynthase gene. Usingthesoftware andfurtheranalysis ofthestructure, function, basicproperties, andclone.

KeyWords:

Trehalose-6-phosphatesynthse ；analysis ;clone.

目录

摘要I

AbstractII

目录III

第一章文献综述1

1.1蒲氏钩蝠蛾1

1.2海藻糖1

1.3海藻糖-6-磷酸合成酶基因2

1.4本论文研究的目的和意义2

第二章材料与方法3

2.1材料与试剂3

2.1.1材料3

2.1.2分子生物学用酶及试剂盒和各种试剂3

2.1.3仪器设备3

2.2研究方法3

2.2.1总RNA提取3

2.2.2所抽提的RNA的质量检测3

2.2.3扩增保守区之间的cDNA序列3

2.3cDNA序列分析4

2.4蛋白质功能预测4

第三章结果5

3.1蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶的RNA提取5

3.2RT-PCR得到的海藻糖合成酶A基因特异性片段及序列分析5

3.3核苷酸序列的特征5

3.4海藻糖合成酶A基因序列及推导的氨基酸序列6

3.5氨基酸序列的特征6

3.5.1氨基酸序列组成分析6

3.5.2氨基酸序列疏水性分析6

3.6序列同源性比较7

3.6.1蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶A基因与其它昆虫同源性比较7

3.5.2蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶A基因序列与其它昆虫进化分析8

第四章讨论9

4.1海藻糖合成酶A基因序列及推导的氨基酸序列结构及基本性质9

4.2蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶A基因及氨基序列同源性分析9

4.3海藻糖合成酶A基因的用途探讨9

参考文献10

致谢12

第一章文献综述

1.1蒲氏钩蝠蛾

冬虫夏草Ophiocordycepssinensis是我国特产名贵中药，仅分布在西藏、青海、四川、云南和甘肃。

它是麦角菌科真菌冬虫夏草O.sinensis寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上形成的子座及幼虫尸体的一种复合体[1]，是一种名贵的药用真菌，有多种药理功能，具有抗癌活性物质[2]。

冬虫夏草药效显著，但资源日益减少，价格节节攀升。

作为一种只生长在青藏高原的特有珍稀药材，冬虫夏草的生长条件非常苛刻，与海拔、植被、气候等关系都很密切[1]。

近几年来冬虫夏草市场需求持续而冬虫夏草资源却发生萎缩[3]。

有关冬虫夏草资源的可持续利用已成为热点而被广泛研究。

作为冬虫夏草发生的物质和营养基础，钩蝠蛾属昆虫的研究对解决冬虫夏草资源可持续利用问题至关重要。

蒲氏钩蝠蛾Thitarodespui（Lepidoptera:

Hepialidae）就是2007年中山大学发表的钩蝠蛾属的一个新种[4]，是冬虫夏草的寄主之一，主要分布在以29°37'N、94°37'E为中心的色季拉山海拔4100～4650m的高寒灌丛和高寒草甸[3]。

蒲氏钩蝠蛾的生物学特性与其他冬虫夏草寄主种类的生活习性相似，如幼虫食性和空间分布、成虫交配产卵等。

其发生地沟壑纵横，生境复杂多样，地理隔离障碍随处存在;气候条件严酷，其幼虫在每年的取食发育时间非常有限，需要多年才能积累完成发育所需营养物质;雌性个体负有完成种群繁衍的使命，平均产卵量768粒，因此蒲氏钩蝠蛾需要积累很多的营养物质才能满足种群繁衍的需要。

蒲氏钩蝠蛾完成一个世代需要3～4年，其中幼虫期漫长，经过7～9次蜕皮、历时990～1350d才能完成发育，环境条件变化及天敌因子等都蒲氏钩蝠蛾的种群稳定产生重要影响[3]。

由于冬虫夏草的经济及药用价值，蒲氏钩蝠蛾极具研究意义。

迄今为止，有关蒲氏钩蝠蛾的研究却并不多见，仅有李峻锋等人于2011及2012年对其进行初步的生物学研究，如生命表构建、空间分布分析等[4][5]。

有关于其功能基因的研究则集中于β-葡聚糖识别蛋白以及载脂蛋白apolipophorinIII上。

而在高原这一特殊环境下，蒲氏钩蝠蛾生存，生长以及发育相关分子机制的研究则少之又少，仅有Zou等人发现热激蛋白hsp90对温度产生响应，推测其增加昆虫低温耐受性。

因此有必要对蒲氏钩蝠蛾进行深入的研究。

1.2海藻糖

海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，有3种异构体即海藻糖（α，α）、异海藻糖（β，β）和新海藻糖（α，β），并对多种生物活性物质具有非特异性保护作用。

科学家们发现，沙漠植物卷叶柏在干旱时几近枯死，遇水后却又可以奇迹般复活；高山植物复活草能够耐过冰雪严寒；一些昆虫在高寒、高温和干燥失水等条件下不冻结、不干死，就是它们体内的海藻糖创造的生命奇迹。

海藻糖因此在科学界素有“生命之糖”的美誉。

国际权威的《自然》杂志曾在2000年7月发表了对海藻糖进行评价的专文，文中指出：

“对许多生命体而言，海藻糖的有与无，意味着生命或者死亡”。

海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等。

海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。

许多对外界恶劣环境表现出非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。

而自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。

这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料，大大拓展了海藻糖作为天然食用甜味糖的功能。

1.3海藻糖-6-磷酸合成酶基因

海藻糖-6-磷酸合成酶（Trehalose-6-phosphatesynthse,TPS）是植物海藻糖合成途径的关键酶,在旱生卷柏等复苏植物对逆境胁迫应答中起重要作用。

资料·

1.4本论文研究的目的和意义

海藻糖对生物体具有神奇的保护作用,能有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。

研究海藻糖合成相关基因对昆虫的生长发育有重要意义，而蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶基因尚未有人研究。

本研究以海藻糖合成为核心，以海藻糖合成酶A基因为重点研究内容，以蒲氏钩蝠蛾的总RNA为材料，克隆海藻糖合成酶基因的cDNA序列，以期为进一步了解该基因在蒲氏钩蝠蛾高原环境下生存、生长发育机制中的作用，同时为以合成酶为靶位点的昆虫生长调节因子的开发奠定基础。

第二章材料与方法

2.1材料与试剂

2.1.1材料

蒲氏钩蝠蛾：

2012年7月至8月采于西藏灵芝县色季拉山海拔4500-6000米的高山草甸。

2.1.2分子生物学用酶及试剂盒和各种试剂

RNA提取试剂盒TRIzol购自Invitrogen公司；反转录酶M-MLvReverse

Transcriptase；DL2000DNAMarker、PCR中的dNTPMIX购自上海生工生物工程公司。

1×TAE:

0.04MTris，乙酸0.001MEDTA（PH8.0）；50×TAE:

242gTris

碱，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA（PH8.0）溶1L蒸馏水中，室温保存；

2.1.3仪器设备

灭菌锅:

YXQ·SG41·280型手提式压力蒸汽灭菌锅；涡旋仪:

WH一微型涡旋混合仪；水浴锅:

YLE-2000型数显式电热恒温水浴锅；搅拌器:

H97恒温磁力搅拌器，；移液枪:

0.1-2.5μL、0.5-10μL、10-100μL，5-50μL、20-200μL、100-1000μL（Eppendorf）；天平:

AL104型电子天平；离心机:

Centrifuge5417R冷冻离心机，EppendorfLX-100手掌型离心机；PCR仪:

2720ThermalCyeler；电泳仪:

DYY-6B型稳压稳流电泳仪；凝胶成像分析系统:

EDAS290

2.2研究方法

2.2.1总RNA提取

RNA提取方法参照RNA提取试剂盒说明，试管、枪头都要事先经过DEPC水处理除去RNase。

先取取蒲氏钩蝠蛾的脂肪体，液氮研磨。

研磨充分，后加入lmLTRIzol，上下翻转使其均匀混合，室温放置5min；每管加0.2mL氯仿，用力振荡15秒，室温放置5min，离心（4oC，12000g，15min）；离心后，将上清液吸入新的1.5mLEP管中，加0.5mL异丙醇，颠倒混匀，静置10min；离心（4oC，12000g，10min）；再去除上清，收集RNA沉淀，加1mL预冷75%乙醇洗涤沉淀l-2

次（离心4oC，12000g，2min，弃上清，收集RNA沉淀）；沉淀室温下干燥5-10

min；溶于适量（30-50μL）RNase-freewater中；放于-80oC冰箱保存备用。

2.2.2所抽提的RNA的质量检测

RNA检测采用琼脂糖凝胶电泳法检测浓度及纯度。

先配制2%琼脂糖凝胶（0.44g琼脂糖，1×TAE缓冲液27mL），中低火加热三分钟左右，冷却至不烫手，放好梳齿，倒入制胶槽，待凝胶充分凝固后，放入电泳槽，取干净无RNase

酶的枪头将1μLLoadingBuffer与5μL样品混匀点好样，170V15min，再倒入EB液中染色15分钟，紫外检测中若能看到两条清晰可区分的主带（28S和18S）的RNA，则表明RNA完整无降解。

若无条带，可在做完逆转录后，根据蒲氏钩蝠蛾β-actin基因设计引物扩增，用以检验是否成功获得cDNA。

2.2.3扩增保守区之间的cDNA序列

先将RNA通过逆转录PCR逆转录为cDNA。

再登录NCBI，在Genbank中找出烟草天蛾、草地夜蛾、果蝇、蚊子、线虫等的昆虫海藻糖合成酶基因序列，设计三个上游间并引物与两个下游简并引物（见表2-1）并进行组合做巢式PCR，对桔全爪螨海藻糖合成酶基因的目标片段进行扩增，得出目标片段，经检验后送入公司测序。

表2-1巢式PCR所用简并引物（从5，-3，依次为F1、F2、F3、R1、R2）

先将总RNA进行逆转录得到cDNA，再通过设好的引物进行PCR得到自己想要的目标基因

（1）RT-PCR：

在200μL的EP管中加入组织总RNA3μL，Oligo（dT）181μL，40U/μLRNaseInhibitor0.5μL，5×reactionbuffer4μL，2.5mmol/LdNTP

4μL，200U/μLRTaseM-MLV1μL，然后加DEPC水至20μL；42oC水浴1h，

然后70oC灭活10min，此即为cDNA产物。

（2）巢式PCR反应程序及体系：

cDNA产物经稀释100倍后再进巢式PCR，模板为5.25μL，上下游引物各1μL，再加入dNTPMIX12.5μL，加双蒸水至25μL。

94oC预变性3min，1个循环，94oC变性30s、45oC退火45s、72oC延伸1min，10个循环，94oC变性30s、50oC退火45s、72oC延伸1min，24个循环，4oC保存，先选取两个外围引物进行PCR，再选两个内侧引物进行PCR，以减少非特异性扩增。

（3）琼脂糖凝胶电泳检测：

称取0.30g琼脂糖放入三角瓶，加27mLl×TAE用微波炉加热3min，待稍冷却后，插梳，倒入胶板，冷却凝固，点样，179V，30min。

EB染色，凝胶成像系统检测DNA，拍照保存，送入公司测序。

2.3cDNA序列分析

首先，联网到NCBI调用Blast服务器对克隆获得的序列进行序列相似性分

析，以判断该序列是否对应于己知序列。

其次，通过一些常用软件如BioEdit、

DNAMAN等获得核酸序列的碱基组成、碱基分布以及疏水性分析等基本特征。

本试验采用BioEdit软件进行核酸序列基本性质分析，输出结果包括Composition（组成）、pereentage（百分比）等。

最后，基于生物信息学的原理对核酸序列进行功能预测。

采用NCBI/Blast软件对数据库进行查询，看核酸序列与已知序列同源性的高低。

多个核酸序列之间进行比对分析对于了解核酸序列的

保守区以及绘制基因的分子进化树十分重要。

可用DNAMAN软件对核酸序列和蛋白质序列进行多重序列比对分析，其分析结果用来绘制分子进化树。

2.4蛋白质功能预测

蛋白质的功能预测最为可靠的方法是进行数据库相似性检索，至少80个氨

基酸长度范围内具有25%以上的序列一致性才可能存在意义。

有多种不同的工具软件可用于蛋白质序列的对库检索。

可直接将待分析的蛋白序列输入NCBI/Blast软件的序列输入框内，选择程序Blastp就可联网进行同源性的分析，再利用软对其氨基组成、疏水性等进行分析以及同源树构建分析以及同源树构建。

第三章结果

3.1蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶的RNA提取

通过电泳图片可以看出TRIzol法提取蒲氏钩蝠蛾的总RNA中，28sRNA与18sRNA条带清晰，大小分别为1500bp，900bp左右，5sRNA条带模糊难以分辨。

可用于后续目的基因的提取步骤。

电泳结果如图3-1。

图3-1蒲氏钩蝠蛾总RNA的提取电泳图图3-2蒲氏钩蝠蛾总RNA的PCR结果图

3.2RT-PCR得到的海藻糖合成酶A基因特异性片段及序列分析

通过逆转录PCR，将总RNA逆转录为cDNA，再根据设计的简并引物组合做巢式PCR，经试验，发现F1与R2，F2与R1这两对引物作巢式PCR效果最佳，片段大小为600bp左右。

目标基因片段的送入上海生工进行测序。

得出的序列长度为621bp，经NCBI/Blast比对后，发现同源性较高的序列均为海藻糖合成酶A基因序列。

可确定为海藻糖合成酶A基因片段的一部分。

PCR结果如图3-2。

3.3核苷酸序列的特征

用BioEdit软件对蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶A基因cDNA部分序列进行了分

析，结果见图3-3。

图3-3蒲氏钩蝠蛾核苷酸组成分析图

由图3-3可以得出由蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶A基因的核苷酸序列当中，A有177个，含量为32.30%；C有101个，含量为18.43%；G有112个，含量为20.44%；T有158个，含量为28.83%。

3.4海藻糖合成酶A基因序列及推导的氨基酸序列

利用软件BioEdit对548bp大小的海藻糖合成酶A基因部分序列进行翻译

得出了182个氨基酸的序列，结果如图3-4所示，蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶部分氨基酸分子量为21.109KD，等电点偏碱性，为9.14。

图3-4蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶A基因部分序列及推导的氨基酸序列

3.5氨基酸序列的特征

3.5.1氨基酸序列组成分析

用BioEdit软件对蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶A基因cDNA部分序列进行了分析，结果见图3-5。

图3-5蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶氨基酸组成比较图

由图3-5可以得出由蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶A基因部分序列推导出来的氨基酸序列当中，亮氨酸含量最高，为9.89%，赖氨酸其次，为8.79%，最少的是半胱氨酸，含量仅占1.65%。

3.5.2氨基酸序列疏水性分析

用BioEdit软件对蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶氨基酸序列分别进行疏水性和亲水性分析，以Kyte&DoolittleMeanHydrophabicityprofile（平均疏水性）的方式输出，对应氨基酸残基的亲和指数的正数代表亲脂性，负数代表亲水性，结果如图3-6表明，氨基酸序列10-25、35-58、70-92处明显亲水。

图3-6蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶氨基酸序列疏水性分析

3.6序列同源性比较

3.6.1蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶A基因与其它昆虫同源性比较

将推导出来的蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶氨基酸序列在NCBI上进行Blastp搜索，所得结果大部分为海藻糖合成酶氨基酸序列，利用软件DNAMAN对这些

序列进行比较，结果如表3-1，参加对比的序列分别为：

玉米夜蛾（Helicoverpazea）、甜菜夜蛾（Spodopteraexigua）、茄黄斑螟蛾（Leucinodesorbonalis）、斜纹夜蛾（Spodopteralitura）、善飞狭颊寄蝇（Hyblaeapuera）、大头金蝇（Chrysomyabezziana）、猫栉首蚤（C-tenocephalidesfelis）、小菜蛾（Plutellaxylostella）、西方角蝇（Haemat-obiairritans）、达林按蚊（Anophelesdarlingi）、甘蓝夜蛾（Mamestrabrassicae）、Eariasvitella

表3-1蒲氏钩蝠蛾与其它昆虫同源性比较

注：

Hz：

玉米夜蛾、Se：

甜菜夜蛾、Lo：

茄黄斑螟蛾、Sl：

斜纹夜蛾、Tp：

蒲氏沟蝠蛾、Hp：

善飞狭颊寄蝇、Cb：

大头金蝇、Cf：

猫栉首蚤、Px：

小菜蛾、Hi：

西方角蝇、Ad：

达林按蚊、Mb：

甘蓝夜蛾、Ev：

由表3-1可看出与蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶部分氨基酸序列同源性最高的是甜菜夜蛾，达到94.7%，结果附合亲缘关系，与其同源性较高的还有玉米夜蛾、斜纹夜蛾、小菜蛾，都为94.2%，同源性较低的有Ev、西方角蝇，分别为为85.4%，86.5%。

通过视图窗口可见C端同源性要高源N端，蒲氏蝠钩蛾与其它几种昆虫的中间序列片段完全不相似，是特有的。

3.5.2蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶A基因序列与其它昆虫进化分析

将蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶A基因推导的氨基酸序列于NCBI中进行Blastp

搜索，获得同源性高的几种昆虫海藻糖合成酶氨基酸序列，利用软件DNAMAN

对这几条序列进行进化分析结果如图3-6，参加比对的序列有：

玉米夜蛾、甜菜夜蛾、茄黄斑螟蛾、斜纹夜蛾、蒲氏沟蝠蛾、善飞狭颊寄蝇、大头金蝇、猫栉首蚤、小菜蛾、西方角蝇、达林按蚊、甘蓝夜蛾、Ev结果显示从图中我们

可以看出蒲氏钩蝠蛾与甜菜夜蛾亲缘关系最近

图3-6蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶氨基序列与其它昆虫氨基序列进化树

第四章讨论

4.1海藻糖合成酶A基因序列及推导的氨基酸序列结构及基本性质

随着真菌中首次鉴定得到海藻糖合成酶以来，基因组计划的实施大大推动

了其他生物中海藻糖合成酶的鉴定和克隆，并最终为充分了解海藻糖合成酶的

表达调控及功能研究创造了条件。

通过NCBI上对海藻糖合成酶A基因序列同

源对比，我们找出了海藻糖合成酶A基因的保守区，运用primerpremier5.0设

计多对简并引物，利用巢式PCR扩增获得部分蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶A基因

序列，长度为548bp。

NCBI/Blastn结果显示，对比结果同源性高的均为A类几

丁质合成酶基因，得分最高的为甜菜夜蛾海藻糖合成酶A基因序列，少数同源

性低的是B类海藻糖合成酶基因序列。

开放阅读框（openreadingframe，ORF），

信号肽等均未预测出来，推导氨基酸序列大小为182，等电点为9.14，偏碱性，

分子量为21.109KD，多处亲水。

经预测出一个功能区，并且只有一个跨膜螺旋区，

与甜菜夜蛾相比，甜菜夜蛾海藻糖合成酶A基因cDNA全长为5207bp，ORF大小为4698bp，氨基序列长度为1565，分子量为172KD有17个跨膜结构[32]。

与之相比，发现所得的cDNA序列太过短小，有许多的结构功能难以预测，比如ORF，信号肽等。

4.2蒲氏钩蝠蛾海藻糖合成酶A基因及氨基序列同源性分析

昆虫中大量关于海藻糖合成酶的研究发现昆虫中一般具有两个拷贝的海藻糖合成酶，一个负责表皮，气管及头中海藻糖的合成，而另外一个则负责中肠中海藻糖的合成[22]。

由于引物设计是根据海藻糖合成酶A基因序列来设计的因此获得的也为A类基因序列，经cDNA序列及推导的氨基酸序列通过Blast检测，同源性较高的都为A类基因序列，可确定该序列为A类海藻糖合成酶基因，负责表皮，气管等的合成。

通过与其他昆虫海藻糖合成酶A基因序列比对、氨基酸序列同源性分析可知，蒲氏钩蝠蛾与甜菜夜蛾同源性最高，达到94.7%，符合两者亲缘关系，与其同源性较高的还有玉米夜蛾、斜纹夜蛾、小菜蛾，都为94.2%。

4.3海藻糖合成酶A基因的用途探讨

海藻糖是昆虫表皮和围