高考生物大一轮复习 第十二单元 生物技术实践 第43讲 微生物的培养与应用讲义.docx
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高考生物大一轮复习第十二单元生物技术实践第43讲微生物的培养与应用讲义
第43讲 微生物的培养与应用
1.微生物的分离和培养 2.培养基对微生物的选择作用 3.利用微生物进行发酵来生产特定的产物
[学生用书P295]）
一、微生物的实验室培养
1．培养基
（1）概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
（2）营养构成：
一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。
此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
（3）种类：
按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。
2．无菌技术
（1）含义：
指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
（2）关键：
防止外来杂菌的入侵。
（3）方法
3．大肠杆菌的纯化培养
（1）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。
（2）纯化大肠杆菌
①关键的步骤是接种。
②纯化培养方法：
平板划线法和稀释涂布平板法。
③纯化培养原理：
在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。
二、土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1．分离原理：
土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起催化作用。
以尿素为唯一氮源的培养基能促进分解尿素的细菌的生长和繁殖，并抑制或阻止其他微生物的生长，从而将目的菌分离。
2．统计菌落数目：
统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。
3．实验流程：
土壤取样→制备培养基→微生物的培养与观察→细菌的计数。
三、分解纤维素的微生物的分离
1．纤维素酶
（1）组成：
纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
（2）作用
2．菌种筛选
（1）方法：
刚果红染色法。
（2）原理
纤维素分解菌
↓
→红色复合物
红色消失、出现透明圈。
即：
使用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
3．筛选流程
土壤取样：
富含纤维素的环境
↓
选择培养：
用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量
↓
梯度稀释
↓
涂布平板：
将样品涂布于含CR的鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
挑选产生透明圈的菌落：
产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈
1．（2016·北京海淀区期末）培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种成分。
（√）
2．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上分离分解尿素的细菌，是否无菌操作影响较小。
（√）
3．培养基分装到培养皿后进行灭菌。
（×）
4．从有机废水中分离微生物用于废水处理时，接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养。
（×）
5．外植体消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害。
（√）
6．（2015·高考四川卷T3D）用稀释涂布平板法培养计数，应选择有30～300菌落数的平板。
（√）
7．（2016·山东青岛市期末）筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。
（√）
8．分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低。
（×）
9．土壤中纤维素分解菌的筛选流程中的“选择培养”是必不可少的。
（×）
10．在富含纤维素的培养基中加入刚果红染色剂，若出现周围存在透明圈的菌落，则说明筛选到了分解纤维素的微生物。
（√）
考点一 培养基及微生物的纯化培养技术[学生用书P296]
1．培养基的种类
（1）按物理状态分类
培养基种类
特点
用途
液体培养基
不加凝固剂
工业生产
固体培养基
加凝固剂
（如琼脂）
微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏
半固体培养基
观察微生物的运动、分类、鉴定
（2）按功能分类
种类
制备方法
原理
用途
举例
选择
培养
基
培养基中加入某些化学物质
依据某些微生物对某些物质的特殊需求或抗性而设计
从众多微生物中分离所需的微生物
加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别
培养
基
培养基中加入某种指示剂或化学药品
产生特定的颜色或其他变化
鉴别不同种类的微生物
用伊红—美蓝培养基鉴别大肠杆菌
2.培养基的配制原则
（1）目的要明确：
配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
（2）营养要协调：
注意各种营养物质的浓度和比例。
（3）pH要适宜：
细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需pH不同。
3．消毒与灭菌
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消
毒法
不耐高温的液体
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭
菌法
接种工具
干热灭
菌法
玻璃器皿、金属工具
高压蒸汽灭菌法
培养基及容器
4.大肠杆菌的纯化
（1）原理：
在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是纯化的细菌菌落。
（2）纯化微生物的接种方法
比较项目
平板划线法
稀释涂布平板法
关键操作
接种环在固体平板培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释；
②涂布平板法操作
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度
菌体获取
在具有显著的菌落特征的菌落中挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点
可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
1.认清不同生物需要的营养物质不同
（1）微生物需要的营养成分有水、无机盐、碳源、氮源，有些微生物还需要特殊营养物质，如生长因子。
（2）在人和动物中，营养物质包括水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。
（3）在植物中，营养物质包括矿质元素、水、二氧化碳三类。
2．平板划线操作的注意事项
（1）操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要对接种环进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：
第一次操作
每次划线之间
划线结束
目的
杀死接种环上原有的微生物
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
（2）灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
（3）第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
（4）划线时最后一区不要与第一区相连。
（5）划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
（2016·山东烟台市统考）为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。
回答下列问题：
（1）该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。
在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是________________________________________________________________________。
（2）该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过________灭菌。
在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。
这样做的目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
（3）示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
（4）该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。
结果发现：
振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。
分析其原因是：
振荡培养能提高培养液中________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高________的利用率。
（5）该小组从（3）B培养基中获得甲、乙、丙三种微生物，并分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种培养基来培养。
甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖，甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。
培养基的成分如下：
成分
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
粉状硫10g
＋
＋
＋
KH2PO44g
＋
＋
＋
FeSO40.5g
＋
＋
＋
蔗糖10g
＋
－
＋
（NH4）2SO40.4g
－
＋
＋
H2O100mL
＋
＋
＋
MgSO49.25g
＋
＋
＋
CaCl20.5g
＋
＋
＋
则甲是________微生物，乙是________微生物，丙是________微生物。
解析：
（1）为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取灭菌后的空白平板先行培养一段时间。
（2）接种环、接种针等金属用具可直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，以达到迅速彻底灭菌的目的。
在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。
（3）比较A和B可以看出：
A培养基中细菌的分布呈线性，是用平板划线法接种培养后得到的结果；B培养基中细菌均匀分布，是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
（4）振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高了营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。
（5）从表格中可看出，Ⅰ培养基中无氮源，Ⅱ中无碳源，Ⅲ中为完全培养基。
由此可知能在Ⅰ中生存的甲只能是固氮微生物，能在Ⅱ中生存的乙是自养微生物，丙只在Ⅲ中存活，为异养微生物。
答案：
（1）检测培养基平板灭菌是否合格
（2）灼烧 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落
（3）B （4）溶解氧 营养物质 （5）固氮 自养 异养
考点二 微生物的计数方法[学生用书P298]
1．两种计数方法的比较
比较
项目
间接计数法
（稀释涂布平板法）
直接计数法
（显微计数法）
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌落数＝（C÷V）×M
C：
某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：
涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）；M：
稀释倍数
每毫升原液所含细菌数：
每小格平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点
当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏小
比实际值偏大
2.设置对照和重复
比较项目
对照
重复
目的
排除非测试因素对实验结果的影响
排除偶然因素对实验结果的影响
实例
空白对照：
确定培养基制作是否合格
同一稀释度涂布至少3个平板
“选择菌落数在30～300的平板”的两个提醒
用稀释涂布平板法计数微生物时，要求选择菌落数在30～300的平板进行计数。
解题时易出现以下误解：
（1）只得到1个菌落数在30～300的平板是错误的。
错误的原因是不符合实验的重复原则，易受到偶然因素的影响。
（2）得到3个或3个以上菌落数在30～300的平板，也不一定正确，这可能有两种情况：
①不同平板间差异较大，如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30～300”，这也是不正确的，因为“34”与“230”“240”差异太大，应重新实验找出原因。
②不同平板之间差异不大，是符合要求的，用其平均值作为估算的最终结果。
可见，并不是只要得到3个“菌落数在30～300的平板”即可，而应该是涂布的同一稀释度的平板均符合“菌落数在30～300的平板”且无较大差异，说明实验操作合格，才能按照计算公式进行计算。
牛奶是微生物生长的良好培养基。
牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物。
为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图所示操作。
用无菌吸管从锥形瓶中吸取1mL生牛奶稀释液至盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次。
请回答下列有关问题：
（1）巴氏消毒的方法是________，使用这种方法对生鲜牛奶进行消毒的好处是________。
（2）取最终的牛奶稀释液0.1mL滴在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是下图中的________。
（3）图中所示方法为稀释培养法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。
若用该方法培养设置了3个培养皿，菌落数分别为35个、33个、34个，则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为________个，运用这种方法统计的结果往往较实际值________（填“偏大”或“偏小”），原因是________________。
（4）从生牛奶取样培养得到的菌落中，混有各种杂菌，从中检测大肠杆菌的方法是在培养基中加入________，菌落具有______________________特征的可以认定为大肠杆菌。
答案：
（1）70～75℃煮30分钟（或80℃煮15分钟） 牛奶的营养成分不被破坏
（2）B （3）3.4×106 偏小 个别菌落可能是由2个或多个细菌形成的 （4）伊红—美蓝
（金属光泽的紫）黑色
考点三 微生物的筛选与鉴别[学生用书P299]
1．微生物的鉴别方法
（1）菌落特征鉴别法：
根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别。
（2）指示剂鉴别法：
如以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素。
（3）染色鉴别法：
如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物。
2．筛选微生物的三种方法
（1）单菌落挑取法：
利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。
（2）选择培养法：
利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物。
（3）鉴定培养法：
利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物。
3．筛选微生物的两个实例比较
比较
项目
土壤中分解尿素
的细菌的分离
分解纤维素的
微生物的分离
方法
利用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行选择培养
利用富含纤维素的选择培养基进行选择培养
原理
只有分解尿素的细菌能够合成脲酶，才能在以尿素为唯一氮源的培养基上生长
因为培养基中含有丰富的纤维素，因此能够分解纤维素的微生物具有更多的生存机会而大量繁殖
鉴别
在培养基中加入酚红指示剂，指示剂变红说明菌落中的菌体为分解尿素的细菌
刚果红染色法，周围出现透明圈的菌落为分解纤维素的微生物的菌落
（2016·陕西长安一中等五校一模）研究者初步筛选到能合成纤维素酶的菌株MC 1，回答以下问题：
（1）为了获得能合成纤维素酶的单菌落，可采用________法将初筛菌液接种在以纤维素为唯一碳源的固体培养基上，这种培养基属于________培养基。
（2）下列关于制备固体培养基的叙述，错误的是________。
A．制备固体培养基时可以加入琼脂
B．操作的顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
C．待培养基冷却至50℃左右时进行倒平板
D．待平板冷却凝固约5～10min后将平板倒过来放置
（3）实验过程中如何防止其他微生物的污染？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
（4）下表的培养液pH均为4.8，若对MC 1中纤维素酶的活力进行测定，则不能选择表中的________培养液。
（多选）
培养液
A
B
C
D
纤维素
25g/L
－
25g/L
25g/L
纤维素酶
－
－
1μg/L
－
NaNO3
－
3g/L
－
3g/L
牛肉膏
－
－
3g/L
－
K2HPO4
1g/L
1g/L
1g/L
1g/L
KCl
0.5g/L
0.5g/L
0.5g/L
0.5g/L
MgSO4·
7H2O
1g/L
1g/L
1g/L
1g/L
FeSO4
0.01g/L
0.01g/L
0.01g/L
0.01g/L
（5）分离获得了具有较高纤维素酶活性的菌株MC 1，为了在此基础上获得纤维素酶活性更高的菌株，最可行的做法是
________________________________________________________________________。
（6）某同学在培养过程中发现培养基上感染了几种细菌。
若在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂培养几种菌后，指示剂变红就可以鉴定其中含有能够分解尿素的细菌；若在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入________染料，培养后，培养基中出现透明圈，就可以鉴定其中含有纤维素分解菌。
答案：
（1）涂布平板 选择
（2）B （3）培养基灭菌、接种过程中进行无菌操作 （4）A、B、C （5）人工诱变（紫外线照射等）处理菌株，再进行筛选 （6）酚红 刚果红
[学生用书P300]）
1．（2015·高考全国卷Ⅰ）已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。
脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。
回答有关问题：
（1）显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用________染色。
微生物A产生的油脂不易挥发，可选用________（填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”）从菌体中提取。
（2）为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以________为碳源的固体培养基进行培养。
（3）若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用________直接计数；若要测定其活菌数量，可选用________法进行计数。
（4）为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35℃、40℃、45℃温度下降解10g油脂所需酶量依次为4mg、1mg、6mg，则上述三个温度中，________℃条件下该酶活力最小。
为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕________℃设计后续实验。
解析：
（1）油脂可被苏丹Ⅲ染液染成橘黄色，被苏丹Ⅳ染液染成红色，因此油脂通常用苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染色。
不易挥发的物质大多采用萃取法进行提取，水蒸气蒸馏法一般用来提取易挥发的物质。
（2）能产生脂肪酶的微生物B能利用脂肪（油脂）作为碳源，所以在制备选择微生物B的培养基时，应将油脂作为唯一的碳源。
（3）用显微镜直接对微生物进行计数，需要用血细胞计数板。
如果对活菌进行计数，则要用稀释涂布平板法涂布平板，培养后统计菌落数目，然后计算出活菌数量。
（4）降解等量的油脂，需要的酶量越多，说明此温度下的酶的活力越小。
所以三种温度中45℃下酶的活力最小。
从三种温度下的实验结果可知，40℃下酶的活力最大，所以要想测定该酶的最适温度，应围绕该温度设计不同温度梯度，进行后续实验。
答案：
（1）苏丹Ⅲ（或苏丹Ⅳ） 萃取法
（2）油脂
（3）血细胞计数板 稀释涂布平板 （4）45 40
2．（2015·高考江苏卷，31，8分）人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秆，提高秸秆的营养价值。
为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究。
请回答下列问题：
（1）在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是________（填序号）。
①酒精灯 ②培养皿 ③显微镜 ④无菌水
（2）在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
（3）向试管内分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净的原因是________________________________________________________________________
____________________。
（4）刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
研究人员在刚果红培养基平板上，筛到了几株有透明降解圈的菌落（见下图）。
图中降解圈大小与纤维素酶的________有关。
图中降解纤维素能力最强的菌株是________（填图中序号）。
（5）研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4，在不同温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果见下图，推测菌株________更适合用于人工瘤胃发酵，理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：
（1）在样品稀释和涂布平板过程中，需要在酒精灯火焰附近进行操作，培养皿用于盛放培养基并培养细菌，无菌水做稀释的溶剂，此处唯一用不到的是显微镜。
（2）在涂布平板时，要取少量菌悬液滴加到培养基表面，因为如果滴加菌悬液过多，菌悬液就会堆积在培养基表面影响分离效果。
（3）在向试管内分装含琼脂的培养基时，如果试管口粘附有培养基，就很容易使棉塞受到污染，因此，需要用无菌的酒精棉球将试管口擦拭干净。
（4）因为刚果红可以与纤维素形成红色复合物，且不与纤维素降解产物反应。
所以在刚果红培养基平板上，菌落周围有透明降解圈是纤维素被降解的结果，降解圈大小由纤维素酶的活性和量决定。
图中菌落①周围的降解圈最大，因此其降解纤维素的能力最强。
（5）考虑到人工瘤胃的发酵过程会使发酵液酸性增加，温度升高，在这个前提下观察在不同温度和pH条件下测得的发酵液中酶活性的结果图，从图中可以看出，在高温和低pH条件下都是J4菌株中的纤维素酶的活性较高，因而该菌株更适合用于人工瘤胃发酵。
答案：
（1）③
（2）培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果 （3）避免培养基污染棉塞 （4）量与活性 ① （5）J4 发酵过程会产热和产酸，J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高
3．（2014·高考四川卷，10，11分）有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境
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