山楂的药理作用及临床应用.docx
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山楂的药理作用及临床应用
山楂的降血脂有效部位提取及其滴丸制备工艺研究
中文摘要
本文采用大孔树脂处理、酸碱处理等技术手段，提取了山楂果中的三萜酸类成分和山楂叶中的黄酮类成分。
同时使用山楂总黄酮类和山楂总三萜酸类有效部位作为原料，将其制备为中药滴丸。
主要研究工作包括：
对山楂总黄酮提取部位和山楂总三萜酸提取部位的溶解性能、粉体基本性质进行了研究。
分别进行了初步稳定性研究，两种有效部位和制备滴丸用辅料的相互作用研究。
对药物在滴丸基质中可能的分散状态进行了初步考察。
最后选择了滴丸用聚乙二醇的种类，进行了整个处方配伍组成的研究。
进行了滴制制备工艺条件的优选，对确定的工艺进行了验证。
以上研究有效利用了山楂资源，提高了山楂类制剂的技术水平。
关键词：
山楂；制备工艺
ABSTRACT
Inthispaper,thetridecidacidcomponentsandflavonoidsinhawthornleaveswereextractedbymeansofmacroporousresintreatmentandacid-basetreatment.Atthesametime,theeffectivepartsofhawthorntotalflavonoidsandhawthorntotaltriterpeneacidswereusedasrawmaterialstoprepareChinesemedicinedroppills.Themainresearchworkincludes:
Solubilityandbasicpropertiesofpowderwerestudiedintheextractionoftotalflavonoidsfromhawthornandtotaltriterpenateacidfromhawthorn.Preliminarystabilitystudieswerecarriedout,andtheinteractionbetweenthetwoeffectivepartsandtheauxiliarymaterialsforthepreparationofdroppillswasstudied.Thepossibledispersionofthedruginthedroppillmatrixwasinvestigated.
Finally,thetypeofpolyethyleneglycolfordroppingpillswasselected,andthecompositionofthewholeprescriptionwasstudied.Optimizationofthepreparationconditionsofdrippreparationwascarriedout,andthedeterminationprocesswasverified.
Theaboveresearchhasmadeeffectiveuseofhawthornresourcesandimprovedthetechnicallevelofhawthornpreparations.
Keywords：
hawthorn；preparation；qualitystandard；droppingpill；macroporous
resin
前言1
第一章综述2
1.1山楂的研究概述2
1.1.1山楂来源2
1.1.2山楂的化学成分3
1.1.3山楂的药理作用4
1.1.4山楂总黄酮类研究7
1.2滴丸研究的概述8
1.3高脂血症的药物研究概述和研究展望10
1.3.1高脂血症概述10
1.3.2目前临床上常用的药物简述如下：
10
1.3.3中药的研究展望：
12
1.4本文主要研究工作和创新点12
第二章指标性成分测定方法的研究14
2.1山楂叶黄酮的薄层色谱法鉴别14
2.1.1试验仪器和药品14
2.1.2溶液的制备14
2.1.3薄层层析14
2.2比色法测定山楂叶总黄酮的含量15
2.2.1实验仪器和药品16
2.2.2实验方法16
2.2.3实验条件的优选16
2.2.4结论21
2.3反相高效液相色谱法测定山楂叶黄酮中的有效成分含量21
2.3.1仪器与试药21
2.3.2色谱条件21
2.3.3对照品溶液的制备23
2.3.4线性关系的考察23
2.3.5供试品溶液的制备24
2.3.6方法学考察24
2.3.7讨论26
2.4比色法测定山楂果中总三萜酸提取物的含量27
2.4.1实验仪器和药品27
2.4.2对照品溶液的配制27
2.4.3供试品溶液的配制27
2.4.4测定波长选择27
2.4.5显色剂用量及条件优选27
2.4.6样品的测定方法29
2.4.7线性关系的考察29
2.4.8精密度试验：
29
2.4.9重复性试验：
30
2.4.10稳定性考察30
2.4.11回收率试验31
2.4.12结论32
2.5薄层色谱扫描法测定山楂三萜酸提取部位中熊果酸的含量32
2.5.1试验仪器与药品32
2.5.2对照品溶液的制备32
2.5.3展开剂的选择32
2.5.4提取条件的优选32
2.5.5扫描条件的选择33
2.5.6供试品的测定方法33
2.5.7方法学的考察34
2.5.8讨论37
2.6本章结论37
第三章有效部位的提取精制工艺研究39
3.1山楂叶中总黄酮的提取精制工艺研究39
3.1.1试验仪器和药品39
3.1.2山楂叶药材中总黄酮含量的测定。
39
3.1.3山楂叶总黄酮提取精制工艺的初步选择39
3.1.4山楂总黄酮乙醇提取工艺影响因素的考察39
3.1.5山楂总黄酮提取工艺优化41
3.1.6树脂吸附性能的考察44
3.1.7工艺的验证50
3.1.8讨论50
3.2山楂果中总三萜酸部位提取工艺的研究50
3.2.1提取工艺优选51
3.2.2提取工艺的验证54
3.2.3讨论54
3.3本章结论55
第四章制剂处方前的研究56
4.1材料和仪器56
4.2方法与结果56
4.2.1山楂黄酮提取物和山楂三萜酸提取物表观溶解度测定56
4.2.2粉体学基本性质的测定57
4.2.3指标性成分化学稳定性考察61
4.2.4药物在基质中的分散程度考察64
4.3讨论65
第五章滴丸制备工艺的研究66
5.1试验仪器和药品66
5.2聚乙二醇基质的初步优选66
5.3滴丸的处方设计67
5.3.1因素水平设计67
5.3.2数据处理方式67
5.3.3正交试验结果68
5.4滴制条件的优化69
5.5结果71
5.6验证71
5.7讨论71
第六章结论与展望72
6.1结论72
6.2展望73
参考文献74
前言
心血管疾病是目前威胁我国人民健康的重大疾病之一目前用于高血脂治疗的药物主要有他汀类、贝丁酸类、多烯脂肪酸类、绞股蓝、山楂、刺玫果等。
降血脂药物需要长期服用，患者对药物的副作用敏感，均有一定的副作用，如他汀类影响肝功能、还可能引起横纹肌溶解症、严重时导致急性肾功能衰竭；贝丁酸类有胃肠道反应、皮疹等副作用。
当使用两种有效部位组方时，需要考察为何选择这两种有效部位组方和两种有效部位的搭配比例等问题，这就需要做大量的药理药效和处方优选工作，为了减小处方优选时的困难，本文拟按中药山楂中的山楂黄酮和三萜酸的比例3:
3：
5组方[2]，制成单方制剂。
山楂中黄酮类成分和三萜酸类成分均为脂溶性成分，在水中溶解度低。
目前山楂制剂多集中于片剂、胶囊等传统剂型，影响了药物疗效的发挥，所以，本文将上述山楂提取物制成现代剂型－中药滴丸。
第一章综述
1.1山楂的研究概述
山楂属植物为蔷薇科，分布于北温带，世界有该属植物1000余种近年来，国内外学者对其原植物、化学、炮制、药理及临床研究都有较大发展。
1.1.1山楂来源
山楂在我国供药用者8种[3]。
其名称和分布，见表1-1。
表1-1
序号品种
1山楂（Crataeguspinnatifids），山海关以南称山楂，主产东北、河北、内蒙、河南、山东、山西、陕西等省。
朝鲜和苏联西伯利亚亦有分布。
2山里红（C.pinnatifidavarMajor），产地同山楂。
3野山楂（C.cuneatasiebetzuse），产于河南、湖南、湖北、江西等省。
4云南山楂（C.seabrifolia），产于云、贵、川等省。
5湖北山楂（C.hupehensis），产于湖北、湖南、江苏、浙江、江西、四川、陕西等省。
6甘肃山楂（C.kansuensis），产于甘肃、山西、河北、陕西、贵州、四川各地。
7华中山楂（C.wilsonii），产地同甘肃山楂.
8桔红山楂（C.aurantia），产于东北、河北、内蒙、新疆等地，苏联西伯利亚及蒙古也有分布。
1.1.2山楂的化学成分
对山楂化学成分的研究始于上世纪20年代。
50年代后，随着对黄酮类物质研究的迅速发展，发现山楂所含黄酮类成分对心血管系统有显著的药理学作用后，重点转向山楂中的黄酮类成分的研究。
关于山楂化学成分有儿茶酚精、胡萝卜素鞣酸，及三萜类成分山楂酸、熊果酸、齐墩果酸等，山楂不同炮制品水煎液含有21种微量无素
山楂中黄酮类成分主要有金丝桃苷、芦丁等。
三萜酸类成分主要有熊果酸、齐墩果酸、山楂酸。
研究表明山楂果实中总黄酮与果实大小、果肉薄厚呈正相关，山里红及云南山楂果实大，含量高。
1.1.3山楂的药理作用
1.1.3.1山楂的心血管作用
（1）降血脂作用：
学者对山楂黄酮调节脂质代谢作用进行了大量研究[3]，山楂及山楂黄酮能显著升高大鼠肝脏LDLR蛋白水平，显著增加了大鼠肝脏LDLR数目。
而对亲和力影响不明显。
说明山楂及山楂黄酮通过调节大鼠肝脏LDLR转录水平和提高抗氧化能力抑制脂质过氧化物预防脂质代谢紊乱[22]。
山楂叶制剂益心酮有降血清胆固醇作用，山楂黄酮，使动物廓清速度加快，廓清时间缩短。
（2）降压作用：
较小剂量注射对麻醉兔、小鼠有降压作用。
山楂乙醇浸出物静脉给药，能使麻醉兔血压缓缓下降，持续3h。
。
（3）舒张血管作用：
山楂总黄酮可增加冠脉流量抗实验性心肌缺氧，抗心率失常等作用，这对冠心病等心血管疾病的防治显然是有益的[30]。
（4）抗心率失常作用：
山楂浸膏对垂体后叶素引起的心率不齐，有一定的抑制作用。
（5）抗氧化作用：
山楂叶乙醇提取物对羟自由基和超氧阴离子的生成有清除和抑制作用。
1.1.3.2三萜酸类的药理作用
多数的研究表明山楂黄酮类成分具有降压、增加冠脉血流量、降血脂、强
心和抗心律失常的药理作用。
1.1.3.3助消化作用
山楂中脂肪酸可促进脂肪分解，山楂酸等可提高蛋白分解酶的活性，有助消化[18]。
1.1.3.4抗癌作用
河南医科大学药理室以大鼠实验表明，山楂提取物对人胚肺2BS细胞及诱癌细胞的抑制作用。
这些显示山楂有抗癌作用[2]。
1.1.3.5提高机体免疫力
将新鲜山楂果实进行切块加水煮沸后用酒精沉淀法得100%山楂注射液，实验山楂注射液对家兔体液免疫和细胞免疫功能的影响。
结果证实，对家兔血清溶菌酶的含量，血清血凝抗体滴度，心血Ｔ淋巴细胞，Ｅ玫瑰花环形成率及心血Ｔ淋巴细胞转化率均有显著增强作用，说明山楂对体液免疫和细胞免疫有促进作用[19～20][34]。
1.1.3.6抗菌作用
山楂煎剂和乙醇提取液对福氏痢疾杆菌、宋内氏痢疾杆菌、变形杆菌、大肠杆菌有抗菌作用[35]。
1.1.3.7止痛作用
山楂能使血管舒张，有助于解除局部瘀血状态，并有收缩子宫、促进子宫复原的作用[3]。
1.1.4山楂总黄酮类研究
1.1.4.1总黄酮的提取分离
其中常用的提取方法概述如下[13]：
（1）水煮浸提法：
流程为：
山楂叶→水浸煮（2次）→滤液浓缩→沉淀→过滤→干燥。
（2）溶剂萃取法：
流程为：
山楂叶→用70%乙醇提取→减压回收乙醇→水分散→用正丁醇萃取→回收正丁醇→总黄酮。
（3）聚酰胺分离法：
流程为：
山楂叶→用70%乙醇提取→回收乙醇→加入聚酰胺粉→用乙醇梯度洗脱→收集各级洗脱液→合并浓缩。
（4）树脂吸附法：
流程为：
山楂叶→浸渍→回收乙醇→过滤→树脂分离→回收乙醇→干燥
1.1.4.2单成分的分离
山楂叶乙醇提取物经聚酰胺柱层析分离即可得到牡荆素[13]。
其中丙酮提取物经硅胶柱层析，氯仿—甲醇—水梯度洗脱，薄层层析检控，相同部分合并，分别得到槲皮素、金丝桃苷、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷、盐酸二乙胺等化合物。
1.1.4.3成分的测定
研究人员利用高效液相色谱和薄层色谱测定山楂叶黄酮[39]。
而且利用此法检测出山楂叶中含有少量的如斯多苷。
1.2滴丸研究的概述
滴丸作为一种固体分散体，能够提高难溶性药物的生物利用度。
根据Nernst－Noyes—Whitney方程可说明主要原因：
dC=DS（C
-
C）
公式（1-1）
dtVδst
dC/dt为溶出速率，V为溶出介质的体积，δ为扩散层厚度，S为药物的表面积，Cs为固体药物的溶解度，Ct为t时间药物在溶液中的浓度
对难溶性药物Ct较小，Cs>>Ct，且对某一药物来说，D/Vδ＝k所以dC/dt＝kSCs公式（1-2）
Cs对于难溶性药物来说极小，所以溶出速率也必然很小。
k为常数。
这些亚稳态分子扩散能量高，溶出快。
由于滴丸剂具有溶出快、生物利用度高、疗效好、药物稳定性好及制备简便、质量易控等优点，因此受到医药界广泛的重视。
1.3高脂血症的药物研究概述和研究展望
1.3.1高脂血症概述
心血管疾病是目前威胁我国人民健康的重大疾病之一，而由脂质代谢紊乱所致的高脂血症是动脉粥样硬化及冠心病的重要致病因素。
调脂治疗是心血管病药物防治的重要内容之一。
临床上常用的药物，有如下几种：
1.3.2.1他汀类
他汀类药物分子结构中部分侧链与HGM-CoA结构十分相似，能竞争性抑制HGM-CoA还原酶（胆固醇合成限速酶）的活性而导致机体内源性胆固醇合成减少。
1.3.2.2贝丁酸类
临床常用的有非诺贝特、苯扎贝特、吉非罗齐等。
1.3.2.3其他常用药物
（1）多烯脂肪酸类[45]
常用的有月见草油胶丸、鱼油烯康丸等，为不饱和脂肪酸制剂。
（2）烟酸类[45]
临床制剂有烟酸及其衍生物烟酸肌醇酯等。
（3）在降脂治疗中可配合使用抗氧化维生素等[45]。
1.3.2.4常用降血脂中药
降胆固醇的中药有生姜、人参、大黄、短毛五加、葛根、麻仁、徐长卿等；降甘油三酯的中药有赤阳子、银杏叶等；中药的研究展望：
随着近年来深入的研究,认为中药制剂具有疗效肯定,毒副作用少,药物食品化等一系列优点。
研究表明有降脂作用的中草药有几十种，其中山楂是其中研究较多，效果较为显著的品种。
山楂具有降低总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白
（LDL）等多种作用。
1.4本文主要研究工作和创新点
本文选择山楂作为原料，使用大孔树脂精制、酸碱精制等手段提取了其中的有效成分，并使用比色法、高效液相色谱法、薄层色谱扫描法等方法控制原料、工艺过程和制剂的质量。
主要创新点如下：
1.首次同时使用山楂三萜酸类和山楂黄酮类这两种能调节脂质代谢的有效成分进行组方。
2.本文研究了山楂黄酮提取部位和大孔树脂的吸附规律，确保了山楂黄酮提取部位的质量。
3.减少了有机溶剂对药品的污染，提高了有效部位的含量。
本文进行的其它研究工作如下：
1.建立了山楂中黄酮类成分的薄层色谱鉴别方法。
2.建立了冰醋酸－香草醛比色法测定山楂中三萜酸提取部位的总三萜酸含量。
3.选择乙醇提取的工艺条件。
4.研究有效成分和辅料的相互作用及对药物在基质中的分散状态的初步研究。
5.优选滴丸的处方组成和制剂过程中的工艺条件。
第二章指标性成分测定方法的研究
2.1山楂叶黄酮的薄层色谱法鉴别
中芦丁、金丝桃苷的TLC鉴别方法。
2.1.1试验仪器和药品
硅胶G薄层板，烟台化工研究所；甲醇、甲酸，丁酮，乙酸乙酯均为分析
纯
2.1.2溶液的制备
2.1.2.1对照品溶液的制备：
精密称取芦丁对照品，制取芦丁对照品溶液。
精密称取金丝桃苷对照品，制取金丝桃苷对照品溶液。
2.1.2.2供试品溶液的制备：
取山楂总黄酮提取物，制取作为供试液。
2.1.2.3阴性对照溶液制备：
按山楂滴丸制备方法，除山楂总黄酮外，制取阴性对照溶液。
2.1.3薄层层析
吸取上述溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以无水甲酸－水－丁酮－乙酸乙酯为展开剂，展开，取出晾干，喷以1％AlCl3乙醇溶液显色，于365nm下检识。
色谱图见图2－1
图2－1山楂叶黄酮薄层色谱图
溶液显示特征：
一个黄绿色荧光斑点与芦丁斑点相对应；亮蓝色的荧光斑点，可能为绿原酸的斑点。
2.2比色法测定山楂叶总黄酮的含量
建立测定山楂叶黄酮提取部位中总黄酮含量的方法。
实验仪器和药品
岛津2401紫外分光光度计；容量瓶；秒表
芦丁标准品：
购自中国药品生物制品检定所，批号：
0080-9705；乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯；聚酰胺，100目
2.2.1实验方法
2.2.1.1聚酰胺的处理
取适量聚酰胺，装柱，使用适量乙醇冲洗后，改用60％乙醇处理，即以60％乙醇充分洗涤后，烘干，备用。
2.2.1.2对照品溶液的配制
精密称取105℃干燥至恒重的芦丁标准品40mg，加60％乙醇适量，置水浴中加热溶解，放冷，以60％乙醇定容至50mL，摇匀，精密吸取25mL置50mL容量瓶中加60％乙醇定容至刻度，摇匀备用，作为对照品溶液（每1mL含芦丁0.4mg）。
2.2.1.3供试品溶液的制备
精密称取山楂总黄酮提取物0.02g，加入10mL60％乙醇分散溶解，加入0.3g聚酰胺粉，搅匀，转移至装有0.3g聚酰胺的小柱中，用100mL乙醇分次洗脱，收集洗脱液，置水浴上浓缩至干，使用60％乙醇溶解转移至50mL容量瓶中，定容，作为供试品溶液。
2.2.2实验条件的优选
2.2.2.1测定波长选择
吸取芦丁标准品溶液，按下述的标准曲线制备方法显色，用紫外-可见分光光度法在300～600nm波长范围内测定吸收曲线，在510nm处呈现最大吸收。
吸收图谱见图2－2。
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
400450500550600
波长（nm）
图2－2
2.2.2.2显色剂用量的选择
精密吸取浓度为0.412mg/mL的芦丁标准品溶液5mL，分别加入5％NaNO2、10％Al（NO3）3各0.4、0.4mL；0.8、0.8mL；1.2、1.2mL；1.6、1.6mL；2.0、
2.0mL显色测定。
其它按下述的标准曲线制备方法显色。
结果见表2-1
表2-1
加入量（mL）
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
吸收度
0.341
0.622
0.765
0764
0.768
2.2.2.3显色后时间的选择
取芦丁标准品溶液和供试品溶液适量，按下述的标准曲线制备方法和供试品溶液测定方法操作，分别在加入1mol/LNaOH溶液后2min、5min、10min、15min、20min、25min、40min、60min、90min测定吸收度。
结果见表2-2
表2-2
时间（min）
2
5
10
15
20
25
40
60
90
芦丁
0.340
0.319
0.308
0.303
0.303
0.302
0.302
0.301
0.301
样品
0.376
0.353
0.341
0.338
0.337
0.337
0.337
0.336
0.335
2.2.2.4供试品的测定工艺
供试品测定工艺为：
精密称取山楂总黄酮提取物0.02g，加入10mL60％乙醇分散溶解，加入0.3g聚酰胺粉，搅匀，转移至装有0.3g聚酰胺的小柱中，用100mL乙醇分次洗脱，收集洗脱液，置水浴上浓缩至干，使用60％乙醇溶解转移至50mL容量瓶中，定容，作为供试品溶液。
精密吸取供试品溶液3mL，置于25mL容量瓶中，加60％乙醇适量使成5mL，加5％NaNO2溶液1.2mL，摇匀，放置6min，加10％Al（NO3）3溶液1.2mL，摇匀，放置6min，加1mol/LNaOH溶液16mL，加水1.6mL，摇匀，放置15min，于510nm波长处测定吸收度值，并使用标准曲线法计算样品中山楂总黄酮相当于芦丁的量。
2.2.2.5线性关系的考察
精密吸取芦丁对照品液（0.412mg/mL）0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，置于25mL容量瓶中，各加60％乙醇适量使成5mL，加5％NaNO2溶液1.2mL，摇匀，放置6min，加10％Al（NO3）3溶液1.2mL，摇匀，放置6min，加1mol/LNaOH溶液16mL，加水1.6mL，摇匀，放置15min，于510nm波长处测定吸收度值。
以芦丁标准品的毫克数为横坐标，吸收度测定值为纵坐标，作图得到标准曲线，其回归方程为：
y=0.3853x-0.0022（r=0.9999）表明芦丁在0～2.06mg范围内呈良好线性关系。
见图2－3。
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
00.511.522.5
标准品量（mg）
图2－3
2.2.3.6精密度试验
精密称取供试品0.02mg，按供试品溶液制备方法制作供试品溶液，连续测定6次，根据所得吸收度值计算，RSD％值为0.505％。
结果见表2－3。
表2－3
序号
吸收度
平均值
RSD（％）
1
0.353
2
0.352
3
4
0.353
0.354
0.354
0.505
5
0.357
6
0.355
2.2.3.7重复性试验
取同一批样品，分别称取6份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，测定总黄酮含量，其RSD％值为0.86％。
结果见表2－4。
序号
含量（％）
平均值（％）
RSD（％）
1
73.5
2
72.1
3
4
73.1
72.6
73.0
0.86
5
73.8
6
72.7
表2－4
2.2.3.8
升级会员 