聚合酶链反映实验报告doc.docx

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聚合酶链反映实验报告doc

聚合酶链反映实验报告

篇一：

PCR实验报告　　普通生物学实验报告　　实验名称：

用PCR扩增的方式辨别不同物种来源的肌肉　　一、特异性目的片段DNA的扩增　　

（一）实验原理　　聚合酶链式反映（PolymeraseChainReaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方式，其大体原理为DNA的半保留复制。

PCR技术由①高温变性模板；②引物与模板退火；③引物沿模板延伸这3步反映组成一个循环，通过量次循环反映，目的DNA得以迅速扩增。

其主要步骤是：

将模板DNA置于高温下（一般为93℃-94℃），使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其适合的复性温度下别离与目的基因的两条单链互补结合；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板按5’→3’的方向延伸，合成互补链。

　　本实验采用物种特异性引物扩增的方式来鉴定3种不同物种来源的肌肉。

以不同物种来源的动物DNA为模板，用物种特异性的引物进行PCR扩增，只有在模板和引物的物种相对应的情况下才会有特异性条带的出现。

应用此方式，可以特异性地检测样品中痕量的特定DNA成份。

（二）实验步骤　　1.不同反映体系的配制　　按下表将各成份别离加入一做好标记的无菌PCR管中，配制50μl的PCR反映体系，注意酶要最后加，加完后将PCR管放置在冰上。

　　2.将上述混合液略加离心，约10s左右。

取下后当即置于PCR仪中，盖紧热盖，定好PCR仪的反映程序，执行扩增程序。

　　反映程序为：

　　预变性94℃5min　　变性94℃5s　　退火50℃5s　　延伸72℃20s　　后延伸72℃5min　　3.反映结束后，终止程序，将PCR管掏出，放置于4℃，待电泳检测。

循环30次　　二、水平式琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物　　

（一）实验原理　　核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液（pH8.0-8.3）中，其碱基不解离，而磷酸集团全数解离，核酸分子因此带负电荷，电泳时向正极迁移。

琼脂糖主如果从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子。

利用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大不同，从而达到分离的目的。

（二）实验步骤　　1.制胶　　称取2.4g琼脂糖，放入250ml的锥形瓶中，加入120ml1×TAE缓冲液，微波炉高火加热约40s直至沸腾，摇动，使琼脂糖分散，在重复煮沸2次，直至溶液澄清透明。

待琼脂糖温度降到60℃左右时，按1:

XX0的浓度加入GoldenView,混匀后倒入已插上适合齿孔梳子的模具中，静置，约30-45min后凝胶完全凝固。

轻轻的垂直拔出梳子，将凝胶掏出，放入电泳槽中，添加1×TAE缓冲液至恰好没过凝胶（有样品孔的一端靠近负极）。

　　2.加样　　取15μlPCR产物与3μl的6×上样缓冲液混匀，加入到凝胶样品孔中。

每加完一个样品应改换一个吸头。

加样前，要记下加样的顺序。

在每排样品孔中留出一个位置加入5μl的marker。

　　3.电泳　　加样后的凝胶板当即通电进行电泳，电压100V，样品由负极向正极移动。

当溴酚蓝移动到距离凝胶下缘约1/3时，停止电泳。

　　4.拍照　　电泳完毕后，掏出凝胶，采用凝胶成像系统拍照保留。

　　三、实验小结　　

（一）实验结果　　PCR产物电泳结果　　由上图可以看出，样品1和样品6出现了目的条带（大小约200bp），所以DNA模板1为猪肉DNA，DNA模板3为牛肉DNA,DNA模板2为兔肉DNA。

（二）实验讨论　　1.在加入Taq酶时，应始终维持酶在冰浴中，不可握在手中。

　　2.每加完一次酶，都应改换吸头。

因为在加酶时，吸头会插入液面以下，为避免污染，应改换吸头。

　　3.拔出梳子时，应两头一路使劲，垂直，缓慢地拔出，以避免破坏胶孔。

　　4.将样品与上样缓冲液混合时，要反复吸进，挤出溶液。

为避免出现较多气泡，在每次挤出溶液时，可在吸头中残留少量溶液。

　　5.在加样时，吸头要垂直于凝胶板且不要插入太深，以避免破坏样品孔。

　　6.咱们组的电泳图中，条带不是很明显，应该是加样时样品的量不够充沛，以后应注意。

篇二：

实验三聚合酶链式反映　　聚合酶链式反映　　实验原理　　PCR是在试管中进行DNA复制反映，大体原理与体内相似，不同的地方是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热（变性）、冷却（退火、保温（延伸）等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无穷扩增。

PCR的具体进程如下：

　　1.将PCR反映体系升温至95℃左右，双链的DNA模板就解开成两条单链，此进程为变性。

　　2.将温度降至引物的Tm值以下，3'端与5'端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合，此进程称为退火。

　　3.将反映体系的温度升至72℃时，耐热的TaqDNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸依照模板DNA的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的3'端，形成新生的DNA链。

　　每一次循环使反映体系中的DNA分子数增加约一倍。

理论上循环几回，就增加为2^n倍。

当经30次循环后，DNA产量达2^30拷贝，约为10^9个拷贝。

　　实验目的　　1.掌握PCR的原理和操作方式　　2.利用PCR方式扩增大肠杆菌的16SrRNA基因　　实验材料　　1.TaqDNA聚合酶（MBI），10×Taq缓冲液　　2.10mMdNTPs（上海生工公司合成）　　3.DNA：

大肠杆菌Dh5a基因组DNA　　4.引物：

27F（5'-AGAGTTTGATCC/ATGGCTCAG-3'）,　　1541R（5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'）上海生工生物公司合成　　5.0.8%琼脂糖凝胶　　实验仪器　　PCR仪（德国Biometra），核酸电泳仪，凝胶成像仪　　实验步骤　　1.设定PCR反映程序　　1）95℃:

5min　　2）95℃:

45sec　　3）56℃:

45sec　　4）72℃:

1.5min　　2）-4）循环30次　　5）72℃:

10min　　6）4℃:

pause　　3.PCR循环结束后琼脂糖凝胶电泳检测结果。

篇三：

临床诊断中聚合酶链反映（PCR）技术的应用　　WS/T230-XX临床诊断中聚合酶链反映（PCR）技术的应用　　Guidelinesforuseofpolymerasechainreaction　　（PCR）techniqueinclinicaldiagnosis　　1范围　　本标准规定了临床诊断中聚合酶链反映（PCR）技术的应用准则。

　　本标准适用于各级，各类的医疗、卫生、保健机构应用PCR技术进行临床诊断。

2概念　　本标准采用下列概念。

　　2.1引物primer　　与待扩增靶DNA片段两头互补的寡核昔酸，其本质是单链DNA（ssDNA），在DNA聚合酶的作用下能进行延伸，从而合成新的互补链。

　　2.2模板template　　待扩增的靶DNA或RNA链，包括人类基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、eDNA和mRNA、扩增后的DNA产物等几乎所有形式的DNA或RNA。

　　2.3变性denaturation　　DNA或RNA由双链转变成单链状态，加热、提高pH或加入甲酰胺、脲等试剂都可使双链DNA或RNA发生变性。

　　2.4退火annealing　　引物与互补的核苷酸序列在适合的温度下通过氢键形式彼此结合的进程。

　　2.5延伸extension　　在适合的条件下，由DNA聚合酶（如：

Taq酶）催化引导引物DNA链延伸的合成进程。

　　2.6污染contamination　　由来源子非待测样品的核酸所引发的一个样品、一系列样品或试剂的非特异性扩增或扩增后在产物分析进程中造成的样品之间的污染，污染通常引发假阳性结果。

　　2.7遗留污染carry-overcontamination　　同一类靶序列上一次PCR扩增产物对以后扩增反映的后续污染。

　　2.8内对照internalcontrol　　在同一反映混合物体系中与待测靶核酸同时进行扩增反映的已知对照物。

　　2.9TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase　　一种耐热的DNA聚合酶，最初是从美国黄石国家公园温泉中存在的水生栖热菌　　（Thermu$aquati-cus）中分离取得，Taq酶最适活性温度在70℃～80℃，能耐受PCR变性进程中的高温，是目前PCR扩增反映中常常利用的DNA聚合酶。

　　2.10抑制物／干扰物inhibition/interference　　临床样品中能致使假阳性或假阴性扩增的内源性物质（如血液中的某些成份，痰液中的酸性多糖、尿液、体液等）和外源性物质（如滑石粉、抗凝剂等）。

　　2.11dNTPdeoxynueleotidetriphosphate　　三磷酸脱氧核苷，包括dATP、dUTP、dCTP、dGTP、dTTP等。

在PCR扩增反映中，作为反映底物聚合形成新的DNA链。

　　2.12热循环仪thermocycler　　在PCR或其他需要在反映进程中转换温度的体系顶用来保证温度准确快速转换的设备。

3用途　　对目前已有稳定、靠得住的微生物学和免疫学方式检测的疾病或病原体，不推荐应用PCR进行检测。

例如，大多数的细菌感染通过细菌培育3～4天即可报告并明确药敏结果；对甲型肝炎病毒等的感染。

通过对其抗原或／和抗体的检测也可明确诊断。

对于目前尚无其他实验室诊断技术或现有的诊断技术不成熟、敏感性太低、不能及时准确地反映感染情况的疾病，可推荐应用PCR技术进行检测。

如丙型肝炎病毒的感染，检测其抗体不能做到初期诊断、也不能表明血清中有无病毒的存在，又如结核杆菌的感染，培育需2～3个月，耗时太长，影响诊断，对此类病原体，PCR检测有其独到的长处。

　　PCR临床实验按照其应用的不同可分为三个彼此交叉的类型t“过筛实验”，“诊断实验”、“验证明验”。

　　3.1过筛实验　　过筛实验适用于数量较大的群体，可能大部份元症状（疾病的流行性可能很低）。

一个阳性结果并非能肯定病原微生物的流行或反映某种疾病状态，它只能提示有必要作进一步的检测。

较高的诊断敏感性和阴性可信度是过筛实验最重要的特性。

　　3.2诊断实验　　诊断实验用于本地某种疾病流行率很高、疑诊患有某种疾病（或特异性感染）的群体，特异性靶基因（或病原体）的有无对诊断和医治有重要意义。

因此，要求在保证明验特异性的情况下-敏感性尽可能地高。

　　3.3验证明验　　对于过筛实验或诊断实验为阳性的情况，验证明验可作为其补充实验，用于确诊。

特异性和阳性可信度是验证明验最重要的特性。

　　4方式　　4.1引物序列的选择　　引物的设计是在模板序列中挑选出两段寡核苷酸片段，使其能有效地扩增模板。

模板序列的选择随着检测的不同而不同，但也有一些一路的地方，如：

1）模板序列应是特异的-即不存在和其他序列同源的序列（尤其是在引物部份），模板序列的选择应避免核苷酸重复片段区I2）模板序列在某些情况下需要的是种属内部的保守区、非保守区（尤其是引物部份）或属内特异区。

　　选择适合的引物是保证PCR扩增特异性和敏感性的关键。

首先，对应用于临床诊断的PCR。

在设计引物时，其靶核酸的序列必然是已知的，这些基因序列信息可从基因数据库（如GenBank）中取得。

虽然引物的设计在必然程度上依托经验，尤其是目前已有多种计算机软件可应用于核苷酸的序列分析和PCR引物的设计，但引物的适用性尚需通过实验性研究加以肯定。

PCR引物设计一般遵循以下大体原则：

　　a）引物的长度一般为15～30个碱基；　　b）两引物相距的距离以100～300核背酸为最优，这样可取得较佳的扩增效果；　　c）引物内碱基应尽可能随机散布，避免出现嘌呤或嘧啶堆集现象，引物中G@C含量宜在40%～60%左右；　　d）引物内部不该有二级结构，两个引物之间、尤其在3’端的序列不该互补；e）引物3’端与模板必然要互补，结尾碱基不要出现多个A。

　　4.2常规PCR实验方案　　4.2.1材料　　模板DNA（102～105拷贝）　　上游引物　　下游引物　　TaqDNA聚合酶和浓缩反映缓冲液　　氯化镁（MgCl2）　　无DNA酶（DNase）的水　　无DNase矿物油　　dNTP混合物（含dATP、dCTP、dGTP、dTTP）　　4.2.2扩增反映（一般情况下，每50μL反映体积所含组分如下）：

　　成份终浓度　　无DNase的水将反映体积补足至50μL　　浓缩反映缓冲液1×工作浓度　　dNTP混合物各0.2mmol/L　　TaqDNA聚合酶0.5～1.0U/50μL　　氯化镁（MgCI2）1.5mmol/L　　上游引物1μmol/L　　下游引物1μmol/L　　模板102～105拷贝/50μL。

　　每一个反映管加1～2滴（20μL～40μL）无DNase的矿物油，按照适合各个PCR反映的扩增参数，按变性、退火、延伸三步骤的热循环程序进行扩增反映。

　　4.3PCR扩增产物的分析　　扩增产物的分析，按照研究对象和目的的不同可采用不同的分析方式，琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳等可帮忙判断扩增产物的大小，有助于扩增产物的鉴定{点杂交还有助于对扩增产物进行基因分型（如HLA-DQ分型）；Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异性产物的大小，因此，可增加检测的特异性和敏感性。

其他一些方式，如微孔板杂交、PCR-酶联免疫吸附实验（ELISA）等均有助于产物的精准分析。

　　4.3.1凝胶电泳　　这种方式是按照带负电的DNA可以在pH中性的缓冲液巾向阳极迁移的原理而成立的，凝胶基质可以是琼脂糖或聚丙烯酰胺等，核酸的迁移率与琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶的浓度、电流、离子强度和温度等因素有关。

电泳后，通过溴化乙啶（EB）染色，在紫外下可以清楚地观察到PCR扩增产物条带，但扩增产物的特异性必需用探针杂交等方式加以鉴定。

　　4.3.2点杂交法　　点杂交法的大体进程是t首先将扩增产物固定到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再用核素或非核索标记的探针进行杂交，由于核素有较大的放射危害性，此刻多用非核索进行探针标记，如生物寨、荧光素、酶及化学发光剂等州玉可在反映时直接掺入地高辛或生物素标记的单核替酸，然后将扩增产物固定，再用抗地高辛抗体或亲合索进行反映来检设4靶序列。

　　4.3.3微孔板夹心杂交法　　该方式是通过固定子微孔板的捕捉探针与PCR产物的某一区域进行特异性杂交，使扩增产物间接地固定于微孔板上，然后，再用生物泵等非核紊标记的检测探针与扩增产物的另一区域杂交，漂洗、显色后即可判断结果。

　　4.3.4PCR-ELISA　　将引物的5端用生物素或异硫氰酸荧光素（FITC）等修饰后并非影响其扩增特异性靶核酸的特性，因此，可以通过修饰其中一个引物的5’端使其携带便于PCR产物被捕捉、固定的功能基团（如生物紊）。

而通过另一引物5，端的修饰（如FITC）使产物便于检测，这样避免了电泳和杂交等步骤，适于常规检测。

　　4.3.5其他　　如限制性内切酶长度多态性分析（Restriction-fragment-length-polymorphism，RFLP）、核苷酸序列分析等。

　　5样品的搜集、运输、处置和寄存　　正确的样品搜集、输送和保留是十分重要的。

虽然PCR检测对上述环节的要求与传统的微生物培育和血清学检测大体相同，但在许多情况下仍有其特殊性。

即无论在什么情况下都至少应维持靶核酸的完整性，样品中的干扰物应能被充分稀释，使其不致于干扰检测。

　　5.1样品的搜集　　实验室对每项特定的PCR检测都应制定并为临床提供详细的样品搜集规则。

，　　5.1.1样品搜集的时间　　在某一疾病的病程中，样品搜集过早或过迟都会致使假阳性或假阴性结果，因此。

要注意样品搜集的时限性或时效性。

　　5.1.2搜集场所的准备　　样品的搜集场所应要求避免细菌污染并去除可能造成污染的物质，样品的搜集需由通过专门培训的工作人员来完成。

　　5.1.3样品的类型和数量　　样品的类型、数量应是必然的，它们可能与常规微生物学、血清学实验的要求相同或不同，这是由疾病病原体的不同特性决定的。

一般而亩，若是所搜集的样品可以进行培育，那么提取核酸进行扩增分析也是可行的。

　　5.1.4样品的质量　　样品的质量可按照以下一种或几种方式进行评估：

肉眼观察、显微镜检查或化学分析。

评估其细胞组成、细胞数量、核酸总量等。

　　5.1.5样品的搜集／运输装置　　样品的搜集需采用一次性材料，样品的搜集材料（如拭子、试纸）或试剂（如防腐荆、抗凝剂或其他常规添加剂）必需不会干扰扩增或检测进程，抗凝剂一般采用乙二胺四乙酸盐（EDTA）或枸橼酸盐，肝索对扩增反映有必然的抑制作用而且在以后的靶核酸提取中不易除去，应尽可能避免利用l对游离的核酸，需灭活核酸酶使其稳定。

靶核酸（如DNA）应能从搜集装置中释放出来，另外，搜集、运输进程中某些介质可能会稀释样品，因此，必需考虑稀释对测定结果的影响。

　　5.1.6样品的查对　　收到样品后，应对病人姓名、样品类型、搜集时间等进行详细查对。

　　5.2样品的运输　　样品搜集后应尽快送至实验室进行检测，运输进程中，特别是在需要维持细胞的完整性时，应注意避免样品的过冷或过热，并尽可能减少细菌等污染物的生长，而且必需保证样品巾的靶核酸免受内源性或外源性核酸酶的破坏与降解；游离核酸需经稳定化处置，靶核酸为RNA时要求更为严格（如对靶核酸为RNA的样品可加入异硫氰酸胍盐灭活其中的核酸酶），不同的实验对运输方式都有其特殊要求，应明确加以规定。

　　5.3样品的处置　　样品中的许多杂质能抑制TaqDNA聚合酶的活性，从而干扰扩增反映，样品的处置可去除这些干扰杂质，增加PCR扩增的成功率和可重复性，有利于检测的标准化，纯化样品中的核酸（DNA或RNA），可使待测核酸暴露，有利于与引物的退火。

　　5.3.1靶核酸的释放　　待扩增的靶核酸可能来源于不同的临床样品，如血液、体液、尿液、粪便、游离的细胞或组织块等。

靶核酸可有不同的存在形式和存在部位。

如病原微生物的靶核酸可存在于宿主细胞内与宿主DNA整合在一路、游离子宿主细胞核中或以各类形式存在于宿主细胞质中。

而