链霉素的制备2.docx

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链霉素的制备2

链

霉

素

的

生

产

组别：

第二组

编制时间：

2012.10.24

总页数：

13

组员：

***

文庆

丁梦瑶

向莉

卢媛

一、抗生素

抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。

现临床常用的抗生素有微生物培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。

抗生素以前被称为抗菌素，事实上它不仅能杀灭细菌而且对霉菌、支原体、衣原体等其它致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用，近年来通常将抗菌素改称为抗生素。

抗生素可以是某些微生物生长繁殖过程中产生的一种物质，用于治病的抗生素除由此直接提取外；还有完全用人工合成或部分人工合成的。

通俗地讲，抗生素就是用于治疗各种细菌感染或抑制致病微生物感染的药物。

二、抗生素分类

β-内酰胺类：

青霉素类和头孢菌素类的分子结构中含有β-内酰胺环。

氨基糖苷类：

包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿斯霉素等。

1.四环素类：

包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等。

2.氯霉素类：

包括氯霉素、甲砜霉素等。

3.大环内脂类：

临床常用的有红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素等、阿奇霉素。

4.糖肽类抗生素：

万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁，后者在抗菌活性、药代特性及安全性方面均优于前两者。

5.喹诺酮类：

包括诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、加替沙星等。

6..硝基咪唑类：

包括甲硝唑、替硝唑、奥硝唑等。

7.作用于G-菌的其它抗生素，如多粘菌素、磷霉素、卷霉素、环丝氨酸、利福平等。

8.作用于G+细菌的其它抗生素，如林可霉素、氯林可霉素、杆菌肽等.

9.抗真菌抗生素：

分为棘白菌素类、多烯类、嘧啶类、作用于真菌细胞膜上麦角甾醇的抗真菌药物、烯丙胺类、氮唑类。

10.抗肿瘤抗生素：

如丝裂霉素、放线菌素D、博莱霉素、阿霉素等。

11.抗结核菌类：

利福平、异烟肼、吡嗪酰胺等。

12.具有免疫抑制作用的抗生素如环孢霉素。

三、链霉素概述

链霉素（streptomycin）是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12，分子量：

581.59。

毒性LD50（mg/kg）：

对许多革兰氏染色阴性或阳性细菌有效，鼷鼠急性经口9000。

对人低毒。

溶解情况：

易溶于水，微溶于乙醇，不溶于甲醇、氯仿和丙酮。

制备或来源：

由灰色链霉菌的发酵液提取得的一种抗生素

用途：

抗菌范围比较广。

对革兰阴性细菌、结核杆菌和某些革兰阳性细菌都有抑制作用。

主要用于结核杆菌感染，也可用于布氏杆菌病、鼠疫等。

用于肌肉注射的，除硫酸盐外，还有盐酸盐、磷酸盐等。

本品能被植物植株吸收，对革兰氏阴性菌和阳性菌杀伤力强，预防效果明显，低温时持效期一般为7天左右，晴天3～4天。

本品适用于防治蔬菜软腐病，柑桔溃疡病，烟草野火病，黄瓜霜霉病、角斑病，辣椒炭疽病，番茄疮痂病，桃叶细菌性穿孔病，水稻拜叶枯病及其他植物细菌性病害。

使用方法：

1、可喷雾（每袋加水50～100kg）、灌根或浸种；2、用于预防，每袋加水50kg（相当于200r），根据病害程度每亩用2～3袋；施药时间最好在上午10点前、下午3点后，喷药8小时内遇雨应补喷。

使用间隔期为7～10天。

本品对柑桔溃疡病、疮痂病、花叶病均有防治效果，可与抗生素农药、有机磷农药混用。

备注：

常用其硫酸盐，有引湿性。

在空气或日光中稳定。

醛基还原成醇，即得双氢链霉素，其抗菌活性与链霉素相似。

包装及贮运：

贮存于阴凉干燥处，严防潮湿，现用现配、农药不宜久放，避免与碱性农药、污水混用。

四、链霉素的作用机理

链霉素主要与原核细胞（如细菌）核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质（酶）的合成,使细菌不能正常生长或者代谢而死亡。

链霉素的结构：

链霉素是由链霉胍、链霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺组成的三糖苷，属于氨基糖苷类抗生素。

链霉胍是在l，3-位置上带有2个孤基的l，3-去氧青蟹肌醇，去掉2个脒基后称为链霉胺。

链霉糖是带有支链的5’-脱氧五碳糖，在第3碳上有一个醛基。

N-甲基-L-葡萄糖胺是在第2碳上的-NH2被甲基化（-CH3NH）的L-葡萄糖胺。

这三糖连接的糖苷键都是α型的糖苷键。

五、工艺合成方法

1、传统工艺

一般采用蒸汽加热（70～75℃）方法使蛋白质凝固变性。

添加磷酸或一些络合剂如三聚磷酸等使高价离子草酸、磷酸生成不溶性沉淀物，然后通过板框过滤或离心分离将这些沉淀物除去。

这一预处理将导致10%以上的链霉素所添加的草酸、磷酸或络合剂，既增加了链霉素提炼成本，又会降低产品纯度、污染环境。

同时所得的发酵滤液中仍存在许多蛋白、多肽和其它各种杂质，将会减少树脂的吸附容量或污染树脂，造成树脂的沉降和堵塞，进而缩短树脂的寿命，增加抗生素提炼的成本。

链霉素早期的提取方法还有活性炭吸附法、带溶法、沉淀法、离子交换法。

2、国外工艺

目前国内外多采用离子交换法提取链霉素，其工艺流程如图:

操作流程图：

六、操作步骤

本品生产主要采用离子交换法。

发酵生产过程分为两大步骤：

①菌种发酵，将冷干管或沙土管保存的链霉菌孢子接种到斜面培养基上，于27℃下培养7天。

待斜面长满孢子后,制成悬浮液接入装有培养基的摇瓶中，于27℃下培养45～48小时待菌丝生长旺盛后，取若干个摇瓶，合并其中的培养液将其接种于种子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气搅拌，在罐温27℃下培养62～63小时，然后接入发酵罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气，搅拌培养，在罐温为27℃下，发酵约7～8天。

②提取精制，发酵液经酸化、过滤，除去菌丝及固体物，然后中和，通过弱酸型阳离子交换树脂进行离子交换，再用稀硫酸洗脱,收集高浓度洗脱液──链霉素硫酸盐溶液。

洗脱液再经磺酸型离子交换树脂脱盐，此时溶液呈酸性，用阴离子树脂中和后，再经活性炭脱色得到精制液。

精制液经薄膜浓缩成浓缩液，再经喷雾干燥得到无菌粉状产品，或者将浓缩液直接做成水针剂。

发酵工艺流程图：

七、链霉素生产知识介绍

1.链霉素的生物合成途径

1.由D-葡萄糖和NH3合成链霉素的大致途径如图1所示[2]

从图l可看出，每生成1个链霉素分子都需消耗3个葡萄糖分子、7个HN3分子、2个CO2分子和l个甲硫氨酸分子。

其中，有3个NH3分子是通过转氨基反应，分别把氨基供体—谷氨酰氨、丙氨酸和谷氨酸的氨基结合到链霉胍上和L-葡萄糖胺的氨基上，另外4个NH3分子是通过鸟氨酸环供给的，其中2个分子又由氨甲酰磷酸酯，另外2分子由天冬氨酸引入，最后转变为精氨酸的脒基，再转移到链霉胺衍生物上。

2个CO2也是通过鸟氨酸循环固定的。

在灰色链霉素的发酵过程中，与链霉素同时产生的还有甘露糖链霉素（链霉素B），其化学结构为N-甲基-L-葡萄糖胺的C4与D-甘露糖的C4以D-糖苷键相连接的糖苷，经过甘露糖苷酶作用，可水解为链霉素和甘露糖。

2.链霉素生物合成的调节机制

在链霉素生物合成中的调节机制主要有发酵阶段的转变、分解产物的调节以及无机磷的反馈抑制等方面。

2.1发酵阶段的转变

催化链霉胍的2个转脒基反应的酶，在合成阶段开始时的突然出现是由于新的蛋白质的合成，而不是蛋白质的激活。

2.2分解代谢产物的调节

在发酵过程中，除形成链霉素外，还形成一种支路产物—甘露糖链霉素（又叫链霉素B）。

对大多数微生物来说，甘露糖链霉素的生物活性只有链霉素的20%-25%。

直到发酵后期才产生水解甘露糖链霉素的α-D-甘露糖苷酶，能迅速把甘露糖链霉素水解成链霉素和甘露糖，反应如下：

甘露糖苷酶

链霉素-甘露糖链霉素+甘露糖

2.3无机磷的反馈抑制

正常生长所需的无机磷浓度抑制链霉素的形成。

磷酸盐与链霉素的生物合成过程有密切关系，在链霉素生物合成中有几步磷酸酯酶所催化的去磷酸化反应。

过量的磷酸盐会产生反馈抑制，阻抑这几步的一个或多个磷酸酯酶的活性或形成，因而抑制链霉素的合成，因此磷酸酯酶的活力与链霉素的形成有密切关系。

此外磷酸盐还能调节链霉胍合成的关键酶——脒基转移酶的形成，高浓度磷酸盐严重阻遏该酶的形成。

2代谢控制发酵育种的基本思想[4]

代谢控制发酵（Metaboliccontrolfermentation）就是利用遗传学的方法或其它生物化学的方法，人为地在脱氧核糖核酸（NDA）的分子水平上，改变和控制微生物的代谢，使有用产物大量生成、积累的发酵。

微生物细胞具有高度适应环境和繁殖的能力，这种调节控制作用主要靠两个因素，即参与调节的有关酶的活性和酶量，也就是反馈抑制和反馈阻遏。

代谢调控发酵能否获得成功，目的产物的产量高低与否，关键在r微生物细胞自我调节控制机制是否能够被解除，能否打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。

根据代谢控制机制的研究表明，酶的生物合成受基因和代谢物的双重控制。

一方面，从DNA的分子水平上阐明了酶生物合成的控制机制，酶的合成受基因的控制，有基因决定形成酶的分子化学结构；另一方面，从酶学的角度探讨，仅仅有某种基因，并不能保证大量产生某种酶。

酶的合成还受代谢物（酶反应的底物、产物及其类似物）的控制和调节。

最有效的方法就是造就从遗传角度解除了微生物正常代谢控制机制的突变株。

突破微生物的自我调节控制机制，而使代谢产物大量积累的有效措施如下：

（1）应用营养缺陷型菌株。

在这些缺陷型菌株中，由于合成途径中某一步骤发生缺陷，终产物不能积累，这样就解除了终产物的反馈调节，使之间产物积累或另一分支途径的末端产物得以积累。

（2）选育抗反馈调节的突变株。

由于这样的突变株不再手正常反馈调节作用的影响，使终产物得以积累。

（3）选育细胞膜通透性突变株，以便使终产物在细胞内不能积累到引起反馈调节的浓度。

（4）利用营养缺陷型回复突变株或条件突变株的方法，解除终产物对关键酶的调节。

（5）应用遗传工程技术，创造理想的超微生物（即构建目的工程菌株）。

此外，发酵的环境条件，如pH值、NH的供应、溶氧水平、营养浓度控制表面活性剂的使用等也都非常重要。

3链霉素生产菌的育种思路

根据链霉素生物合成途径及代谢调节机制，选育链霉素生产菌应从如下几个方面着于：

3.1出发菌株的选择

出发菌株多采用灰色链霉菌（Streptomycesgriseus）、比基尼链霉菌和灰色链霉菌等。

灰色链霉菌的孢子梗直而短，不呈螺旋彤，孢子数量很多，孢了乃断裂而成，呈椭圆形，气生菌丝和孢子均呈白色，单菌落生长丰满，呈梅花型或馒头型，直径为3-4mm，基质菌丝透明，在斜面背后产生淡色色素。

3.2切断支路代谢

当初级代谢和次级代谢处于分路途径时，通过选育需要初级代谢产物的营养缺陷菌株可使相应的次级代谢产物增加。

据报道，采用诱变的方法获得L一丙氨酸缺陷株，或选育苏氨酸缺陷、芳香族氨基

4链霉素传统工艺流程

然而链霉素发酵液中绝大部分是菌丝体和未用完的培养基，以及各种各样的代谢产物，如：

蛋白质、多肽、色素和Ca2＋、Mg2＋离子等等，链霉素浓度远较各种杂质的低，仅为5000单位/毫升左右。

大量蛋白、多肽和高价离子（Ca2＋、Mg2＋）的存在对离子交换吸附影响很大。

在离子交换处理前，一般采用蒸汽加热（70～75℃）方法使蛋白质凝固变性。

添加磷酸或一些络合剂如三聚磷酸等使高价离子草酸、磷酸生成不溶性沉淀物，然后通过板框过滤或离心分离将这些沉淀物除去。

这一预处理将导致10%以上的链霉素所添加的草酸、磷酸或络合剂，既增加了链霉素提炼成本，又会降低产品纯度、污染环境。

同时所得的发酵滤液中仍存在许多蛋白、多肽和其它各种杂质，将会减少树脂的吸附容量或污染树脂，造成树脂的沉降和堵塞，进而缩短树脂的寿命，增加抗生素提炼的成本。

此外采用离子交换法提炼链霉素，总收率不高，只达72%。

同时需大量解吸液。

解吸液中链霉素浓度低，各种杂质如色素、金属离子等含量较高，造成下游工艺处理困难，产品纯度不高。

5链霉菌遗传育种进展【5】

开发新抗生素

通过在产生化学结构类似的抗生素的链霉素之间进行抗生素生物合成基因的提外转移、不同菌株的杂交、原生质体融合等都可得到新的抗生素的产生菌。

Hopwood等将天蓝色链霉素中放线紫红素物合成的全套基因克隆到榴菌素W美达霉素产生菌中，由于来源于不同链霉素的基因及其产物之间的相互作用，而获得新的抗生素双氢榴紫红素和美达紫红素A，表明有基因工程可能找到新的抗生素。

注意事项：

菌种发酵，将冷干管或沙土管保存的链霉菌孢子接种到斜面培养基上，于27℃下培养7天。

待斜面长满孢子后,制成悬浮液接入装有培养基的摇瓶中，于27℃下培养45～48小时待菌丝生长旺盛后，取若干个摇瓶，合并其中的培养液将其接种于种子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气搅拌，在罐温27℃下培养62～63小时，然后接入发酵罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气，搅拌培养，在罐温为27℃下，发酵约7～8天。

提取精制，发酵液经酸化、过滤，除去菌丝及固体物，然后中和，通过弱酸型阳离子交换树脂进行离子交换，再用稀硫酸洗脱,收集高浓度洗脱液──链霉素硫酸盐溶液。

洗脱液再经磺酸型离子交换树脂脱盐，此时溶液呈酸性，用阴离子树脂中和后，再经活性炭脱色得到精制液。

精制液经薄膜浓缩成浓缩液，再经喷雾干燥得到无菌粉状产品，或者将浓缩液直接做成水针剂。

链霉素药物使用不良反应

1、链霉素容易损害听觉神经，可以引起眩晕，运动时失去协调（我们称共济失调）；可以引起耳鸣，听力下降，严重时出现耳聋。

上面提到不能用于孕妇的主要原因就在于它可以影响胎儿的听觉神经，以后产生听觉障碍。

因为，由于医疗单位不够认真负责，或者由于不懂药理知识乱用链霉素，引起所谓“先天性”耳聋，在过去由于人为的原因造成儿童听力障碍残疾的教训也是较多的。

2、产生链霉素过敏反应的人很少，但还是有的。

轻的出现发热、药物性皮疹，严重的会发生剥脱性皮炎（是一种全身性的严重的皮肤病），甚至过敏性休克。

所以，有链霉素和其他药物过敏史者不用或慎用。

3、前面已介绍过链霉素属氨基糖甙类抗菌素（其他如庆大霉素、小诺霉素、妥布霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素等等均属此类抗菌素）对肾脏的毒性较多，肾功能有损害的病人应该少用和不用，即使一定要用，必需经常查验肾功能和尿常规，老年人因药物血浓度维持时间比年轻者长，所以，应用链霉素要减量和谨慎使用，并进行严密观察。

4、有的病人可以出现口唇周围和面部的麻木感。

轻者不须停药，重者必需在专门医师的指导下减量或停药。

八、制备后三废处理

链霉素生产废水是一类含硫酸盐的高浓度有机废水，水质情况见表１，ＣＯＤ／ＳＯ２－比值一般为５～７，碳氮比偏低，ＢＯＤ５／Ｎ在４左右，同时废水中含有较多生化抑制物质，如甲醛、草酸、链霉素单位及其降解物等。

较高浓度硫酸盐的存在对正常的厌氧消化可能会造成严重影响。

九、效价：

（1）随着链霉素发酵培养中糖的消耗，链霉素的效价也是降低的。

说明一次性投料，糖源供应不够。

（2）PH值在5.2时，链霉素效价达到最高，将近4500U/ml。

由此确定链霉素发酵培养的最适PH值最好控制在这一值上。

（3）链霉菌是好氧菌，菌体的生产及发酵产物的积累都要消耗氧。

因此发酵过程当中需保证必须的供氧量。

（4）生物量与链霉素产物的量是此消彼长的关系。

根据参数的变化，我们以单位体积功率相等的原则改变搅拌转速及空气流量来进行发酵容积从7升到50升发酵罐的扩大设计，结果放大后的转速由300r/min变为228r/min。

试验中，我们用阳离子交换法和膜分离两种方法对链霉素发酵液的分离提取进行对比。

结果发现用膜分离法进行提取后产物的效价以及产品的纯度远远高于用阳离子交换法的

十、质量标准：

性状：

白色或类白色粉末，无臭或微臭，有苦味。

酸度：

取本品，加水制成每1ml中含20万单位的溶液，依法测定pH值应为4.5～7.0。

溶液的澄清度与颜色：

取本品5份，分别加水5ml，溶解后,溶液应澄清无色；如显浑浊，与2号浊度标准液比较，均不得更浓；如显色，与各色5号标准比色液比较，均不得更深。

干燥失重：

取本品，以五氧化二磷为干燥剂，在60℃减压干燥4小时，减失重量不得过6.0％

异常毒性：

取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含2600单位的溶液，依法检查按静脉注射法给药，观察24小时，应符合规定。

热原：

取本品，加灭菌注射用水制成每1ml中含2万单位的溶液，依法检查

剂量按家兔体重每1kg注射0.5ml，应符合规定。

降压物质：

取本品，依法检查（附录ⅪG），剂量按猫体重每1kg注射3000单位，应符合规定。

无菌：

取本品，分别加入100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，使溶解，用薄膜过滤法处理后，依法检查应符合规定。

另取装量10ml的0.5％葡萄糖肉汤培养基6管，分别加入每1ml中含2万单位的溶液0.25～0.5ml，3管在30～35℃培养，另3管在20～25℃培养，应符合规定。

十一、生产组织

向莉、卢媛、丁梦瑶、陈镪、文庆

十二、EHS

对患者应注意监测：

①听电图，对老年患者需在用药前，用药过程中定期及长期用药后进行听电图检测高频听力损害；②温度刺激试验，在用药前、用药过程中定期及长期用药后用以检测前庭毒性；③肾功能测定，在用药前、用药过程中定期测定肾功能，以防止严重肾毒性反应。

（1）应监测血药浓度、血药峰浓度超过50μg/ml时引起毒性反应的可能性增加，对肾功能不全的患者应经常监测血药峰浓度，以不超过20—25μg/ml为宜。

（2）不能测定血药浓度时，应根据肌酐清除率调整剂量，肌酐清除率可由本章氨基糖苷类所附公式计算而得。

（3）给予首次饱和剂量后，有肾功能不全、前庭或听力减退的患者应减量或停用，由于链霉素在体内不被代谢，主要由尿液排出，肾功能不全的患者体内可能积聚而达到中毒浓度。

（4）患者应给予充足的水分，以减少肾小管损害的程度。

（5）当用药数日或数周（结核病）后患者感觉病情有所好转时，仍需继续完成规定的疗程。

这一点极为重要，尤其是结核病治疗过程中。

治疗结核病必须持续用药1一2年，有时甚至需用数年或长期持续应用。

但在已出现或即将出现中毒症状时或细菌已产生耐药性时，应即停用链霉素。

（6）肌注应经常更换注射部位，药液浓度一般为200—250mg/ml，不宜超过500mg/ml。

（7）长期用药可能导致不敏感细菌过度生长。

参考文献：

[1]徐浩．工业微物生学基础及其应用，北京：

科学出版社

[2]徐亲民主编．抗生素工艺学．北京：

中国建材工、业出版社

[3]俞俊棠，唐孝宣．乍物工艺学．上海：

华东化工学院出版

[4]山根恒犬著，周斌译．生化反应工程．西安：

两北火学出社

[5]陶文沂主编．工业微生物生理与遗传育种学．北京：

中国轻工业版社