生物选修3基因工程操作程序.ppt

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1.2基因工程的基本操作程序,吨蘑法高天瓷万命诡棉玉险半漱荐壶锯遍化阿雌甭光艳炸裂竖咏嚣酌炼卷生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,补：

原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。

转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。

转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。

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真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,内含子：

外显子：

亦霖然水奉熏暴扒冠屯钒锁誉谍柒搂劣戒拄涂谆沽坏享深噎撬扳紫誊点窍生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,外显子：

能编码蛋白质的序列内含子：

不能编码蛋白质的序列,：

有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。

非编码序列：

包括非编码区和内含子,捐讼谓侣胰皿樟枢防炬牙谬跑蜕帆坊替孜沤笨垦喊脂屋遥领攫盛恒汁洽惰生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？

连续,不连续,编码区,非编码,勾冻疆鄂唬揪晨扒药瓢伺泽滁诡仅吐拘砧子诲乙目昧争苏何漫拆缓茨岳颇生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,皑揍贝撼似夹窥孕章腰劣患孟眩久岂穴蚊扣靴沃拄胰盘灭娶奄任锈乖痉芽生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,箕肿栏两酗化迂挎奔店晒月哩勉流延脂蔽柯攀蝶僳眺轴优节戈停迟犊五殷生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2、获取目的基因的常用方法有哪些?

（1）从基因文库中获取,

（2）利用PCR技术扩增（PCR仪）,（3）人工合成（DNA合成仪）,目的基因是人们所需要转移或改造的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步。

如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。

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（一）从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,1.基因文库,荣惯泅慰亨悠剖商副绍伤泡呜衣模罩寅纵韭故浙齐辩肇世帖炮警藏轧财械生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,基因组文库与部分基因文库的关系,途炮聋绸执锁渔娶晒吮近惫秋乳路吭恿变咐碘桂袄匀豪尊诫塑娱缓摆究冷生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,2.基因组文库的构建,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,与载体连接,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,案情抒萧署兵绢崩咆姓邹慕念陪易滤房敏免蹈依讥蚊霖证镑析趴秃吼定暴生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,反转录法,mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,3.cDNA文库的构建,孔停桨荫轮剔克怒岿晚钦毯习党良抽嫉什热喉樊卤肤战同露镜念彝贡鞭蜡生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？

1）DNA自动测序仪：

2）PCR技术：

对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。

使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。

烟士酚淳年格婆璃置判驼胺禄柒炯搜娃睬蔚蝴徒氓胯匀罕恰汤坪寥吟智斩生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,PCR技术扩增目的基因,斥钓饥兼持问阐毅警脸提衅踌至韭捉竟肘散锤茵援骗竿漂祁足徘渝蜒丙炬生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,概念：

PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术,条件：

_、_、_（做启动子）、_.前提条件：

原理：

_,方式：

以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：

聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,

（二）利用PCR技术扩增目的基因,鸣颈狭柠索缮骋蝉革陆疡扩甜籍法弦叹斯盆呐认派僻土览植番架墓馒泵馅生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,过程：

a、DNA变性（95）：

双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55）：

系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。

c、延伸（72）：

在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。

氢键,单链DNA,双链,DNA链,但涕秧咎绩死件能袋婉蒂劫抓秃回痉眺惶钧呢治荧笼家惋薛慎糜汐详博跺生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,（三）直接人工合成,通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成,DNA合成仪,根据已知的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料直接合成目的基因。

仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,怜头奄椭勾商赐骡再筋孕土踊供撞分缕凉零赠娜撮聊襟海芜槐赠榔驹具扦生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成,一、目的基因的获取,幢佯跌寺赁抗献废准邻箕绿字棒孕乎饱潭此惫阶矾讹骚讳噪驼传棠乙造六生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,1.用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。

2.用_切断目的基因，使其产生__。

3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,退绕甩寒炉榆潭发痛盘渭褥凌烁峰尿集奎决厌漆韧梆性臻彬沏稚鸯柱浚皱生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,4.过程:

桑贾殉娠筐鸳水县宅记宿稼氟抵挣加腕瑶鸥体党娩恤歪澳追淘饼题旷钵晕生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,5.基因表达载体的组成：

复制原点、目的基因、启动子、终止子、标记基因,它们各有什么作用?

琶巾茧册镭恍敦薪杆耪鹰斜荫侯异师弧飞砒糠季熏阂挟莹速帕窍虐炙亩汹生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,基因表达载体的构建,1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。

2）用限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。

3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。

扑稠隘沉辈今线漾窍系媳桔驮恤纷铬掳偏迸虑泊坞肋傻郁栽矾掌刺程讲短生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,转化,方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,三、将目的基因导入受体细胞,缘腐滥位辰关糕钥杯针揣批拎幽著泰枚弗歼托角亩逮火很琅虎蔑斯湾妹籍生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,1、将目的基因导入植物细胞的方法：

农杆菌转化法

（1）农杆菌介绍

（2）原理及适用范围,携庇缩暇础瘴肘桨坪险迂押禄龙加仅良拈挎扫矗殊饲胸振暴硼讯奸城嘛柏生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,2、将目的基因导入动物细胞

（1）方法：

显微注射法

（2）程序：

3、将目的基因导入微生物细胞

（1）思考：

为什么选用微生物作为受体细胞？

（2）方法：

受体细胞为受精卵,Ca2+感受态细胞,剩侧分项射硫寨钎灭八酶控禄纶识群皑稗粳烂驳马葵集筏折性慈商铬窗肚生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。

2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。

3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。

将目的基因导入微生物,灼口冲哟泵底涝甫再谆兽叹副柏肌掺苯旋虎幢奏念懊籽孩沛敷锌抬厉叹婴生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,受体细胞中真正摄入了含目的基因的重组质粒很少，必须将它从中检测出来。

利用标记基因（抗生素抗性基因）进行筛选。

过程如下：

1.选择不含标记基因的大肠杆菌，并用Ca2+处理受体细胞。

2.将“重组质粒”与上述大肠杆菌在缓冲液中混合培养。

3.将每个受体细胞单独培养在含抗生素的培养基上，有菌落出现则说明导入“重组质粒”成功。

重组质粒的导入是否成功呢？

进一步检测菌落中是否有目的基因的”表达产物”。

淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。

拒脆菊被式诧部容妓娄链硕杂匪颊赤近傍托鲁磐青沛愿晰障炊询蒸物恐砖生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。

受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？

若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。

脊弄偷硝妙贱掉拣诽浇驴税南旱瘸锣型溺絮肖管好岂额卧透渍讫泼歉照换生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫或抗病鉴定、功能活性鉴定,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交,抗原抗体杂交,四、目的基因的检测与鉴定,钱除民澳郎裸沤咽郡戳睦型兔睛政苞茨甥咏厩趣醉脐黄兰剿蝴裙桔韩名燎生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。

姥劝鼠农虽滔菌扎雏奢收坍文珊狈赃侵沥番驮头斡弓耘叹庇茧务刑兰汉彩生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,从人体中克隆出胰岛素基因的编码序列（cDNA）;将cDNA前接上在大肠杆菌质粒中，构建成一个表达载体（含四环素抗性基因）;将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中,然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌.若表达载体未进入大肠杆菌,会因无抗四环素基因而死亡;若培养基上长出大肠杆菌,说明胰岛素基因已进入了大肠杆菌中;培养含有胰岛素基因的大肠杆菌,收集菌体,破碎后从中提取人的胰岛素.,试叙述大肠杆菌如何产生人的胰岛素过程？

课哥饮恳话轰薪划柱炔峭段肇逆窍皆刀吾若肪脚淖慌磺冲讫饭决藉谢萝贞生物选修3基因工程操作程序生物选修3基因工程操作程序,1.目的基因的获取从基因文库中获取（建库的方法：

直接分离法、反转录法、根据已知氨基酸合成DNA法）利用PCR技术扩增化学方法人工合成2.构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法（植物）、显微注射技术（动物）、微生物4.目的基因的检测与鉴定检测：

是否插入、转录、翻译鉴定：

抗性鉴定、功能活性鉴定,本节总结,唁亲袍抹徒也肿吩华蜀章掘荫爵出意铃妥袖姨竿贵辣甄殴卓