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FISH技术

原位杂交技术

原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸（即探针）与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。

为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：

组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列（即探针）、有与探针结合的标记物（曾呈奎等2000）。

RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。

该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。

其基本原理是：

在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体 （Hybrids）经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。

RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。

尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。

1.基因组原位杂交技术

基因组原位杂交（Genomeinsituhybridization，GISH）技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。

它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。

GISH技术最初应用于动物方面的研究（Pinkeletal.,1986），在植物上最早应用于小麦杂种和栽培种的鉴定（余舜武等2001；王文奎等2000）。

2.荧光原位杂交技术

荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）技术是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。

它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切片上的特异fl-N：

~行杂交，通过荧光检测系统（荧光显微镜）检测信号DNA序列在染色体或DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂交位点。

FISH技术检测时间短，检测灵敏度高，无污染，已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。

FISH是原位杂交技术大家族中的一员，因其所用探针被荧光物质标记（间接或直接）而得名，该方法在80年代末被发明，现已从实验室逐步进入临床诊断领域。

基本原理是荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性；通过荧光显微镜观察荧光信号可在不改变被分析对象（即维持其原位）的前提下对靶核酸进行分析。

DNA荧光标记探针是其中最常用的一类核酸探针。

利用此探针可对组织、细胞或染色体中的DNA进行染色体及基因水平的分析。

荧光标记控针不对环境构成污染，灵敏度能得到保障，可进行多色观察分析，因而可同时使用多个探针，缩短因单个探针分开使用导致的周期过程和技术障碍。

3.多彩色荧光原位杂交技术

多彩色荧光原位杂交（Multicolorfluorescenceinsituhybridization，mFISH）是在荧光原位杂交技术的基础上发展起来的一种新技术，它用几种不同颜色的荧光素单独或混合标记的探针进行原位杂交，能同时检测多个靶位，各靶位在荧光显微镜下和照片上的颜色不同，呈现多种色彩，因而被称为多彩色荧光原位杂交。

它克服了FISH技术的局限，能同时检测多个基因，在检测遗传物质的突变和染色体上基因定位等方面得到了广泛的应用（杨明杰等1998）。

4.原位PCR

原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。

原位PCR技术大大提高了原位杂交技术的灵敏度和专一性，可用于低拷贝甚至单拷贝的基因定位，为原位杂交技术的发展提供了更广阔的发展前景。

原位杂交技术因其高度的灵敏性和准确性而日益受到许多科研工作者的欢迎，并广泛应用到基因定位、性别鉴定和基因图谱的构建等研究领域。

目前原位杂交技术在植物中的应用比较广泛，例如在棉花、麦类和树木等的遗传育种方面取得了显著的成就，在畜牧上原位杂交技术主要用于基因定位和基因图谱的构建以及转基因的检测和性别鉴定等方面。

在水产方面，原位杂交技术则主要应用于基因定位（多见于对鱼类和贝类等水生物的研究）和病毒的检测（多见于虾类）。

此外，原位杂交技术做为染色体高分辨显带技术的补充和发展，在水生物的细胞遗传学的研究领域将发挥更重要的作用。

同其他的生物技术一样，原位杂交技术在其发展与应用的过程中会出现一些问题，但随着原位杂交技术的不断改进与完善以及检测手段的改进，原位杂交技术的优越性越来越突出，其应用也会更加广泛。

FISH技术：

荧光标记的原位杂交技术

1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。

20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。

1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。

20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。

1．原理

将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

2．实验流程

FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。

3．特点

原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。

用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。

缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。

采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。

FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:

1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

缺点：

不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。

4．应用

该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。

在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。

荧光原位杂交（FISH）技术的发展和进步

FISH技术显示核酸是在同位素标记探针的基础上改进而来的。

早期的同位素标记没有专门的标记方法，如将随机同位素标记的碱基添加到生长的细胞中之后再进行放射自显影。

同位素杂交的诸多缺点必然要求用更好的技术来取而代之。

首先，放射性材料决定了探针的不稳定性，特别是半衰期较短的同位素随着时间推移不断衰退而造成探针的活性不能持久。

其次，虽然放射显影的灵敏度极高，但是分辨率（清晰度）有限。

第三，为了在放射显影底片上获得可检测到的信号往往需要延长曝光时间，使检测周期变长。

第四，放射性标记探针相对比较昂贵，并且必须按照严格的程序转运、贮存、处理带有放射性的材料。

而FISH技术在分辨率、检测周期、安全性等方面明显得到了改进，并为以后的多位点检测、高质量分析、活细胞绘图等打下了基础。

1980年，Bauman首次将荧光原位杂交用于核酸检测，直接将RNA-3’端用荧光素标记作为特异DNA序列的探针。

嵌入整个探针的酶结合荧光素标记碱基方法已经广泛用于荧光探针的制备；一次可以标记一种颜色。

氨基-烯丙基标记碱基技术可以与任何半抗原或者荧光素结合，这对于原位杂交是至关重要的，因为氨基-烯丙基标记的碱基技术可以仅通过简单的化学反应就可以获得一系列的低背景信号探针，通过杂交探针的二级检测系统使得杂交信号被放大。

早在19世纪80年代，缺口平移法检测、生物素标记探针，二级荧光标记抗体检测等方法已经用于DNA和mRNA检测。

约十年后，单链DNA探针的合成、标记方法的不断改进可以使合成的杂交探针携带大量的荧光素分子用于直接检测。

在这些方法基础上，有许多关于不同的检测范围、特异性，灵敏度以及分辨率等直接的或间接的改进技术方面的报道。

1FISH技术检测位点数目及检测目标的发展

在FISH技术基本确立之后，FISH不仅用于单基因或核酸检测，FISH技术的进一步发展扩展到多色FISH多基因位点同时检测，从基因检测发展到基因组、染色体、活细胞中转录产物mRNAs原位检测以及组织水平的核酸检测，并且在今后的研究中还有可能应用到整个生物体的检测。

早期的探针较大，是通过载体的增殖、缺口平移法、体外转录法和随机引物DNA合成法来制备以获得特异性杂交克隆。

然而大片断的探针通常带有重复序列造成高荧光背景，采用未标记的核酸进行预处理使其与非特异性位点结合用于抑制非特异性杂交可以克服上述问题，同时也使得研究者扩大了检测目标，实现了整条染色体染色。

在细胞遗传学上FISH技术在染色体分析方面也因此得到了显著的提高。

如通过比较基因组杂交（Comparativegenomichybridization）用于检测染色体区域的缺失和重复。

大片段探针一旦和样品非特异性结合就会形成一个信号，混淆染色体上基因的检测，就需要剪切成小片段<200核苷酸。

现在检测手段的提高以及检测软件的不断发展使得FISH技术的检测要求越来越低，灵敏度越来越高。

精确的计算机图片处理算法的不断改进形成了亚显微水平的探针高分辨技术。

随着检测目标越来越小，FISH技术已用于隐蔽的亚端粒核型基因重排和精确的染色体作图及单拷贝mRNA的检测。

FISH检测范围的扩大，使得FISH技术的应用在20世纪90年代急速增长。

由FISH技术应用而形成的分支技术实现了越来越多的不同类型位点同时检测。

首先是采用不同的荧光素来检测多位点，如双色荧光用于检测特异的核酸序列，每一条染色体、基因或者转录产物分别由一种可以分辨的荧光信号来表示。

之后是采用两种色彩译码方案进一步扩大了FISH应用范围。

译码方案主要是针对色彩比例，即每一种颜色在总颜色中所占的比例来描绘多位点。

前述的每一种方法，或是两种方法的结合都已经将可检测位点多达12个。

采用计算机翻译的五色方案可同时检测出人类所有染色体代表着FISH技术多位点检测的里程碑。

尽管可以采用多种方法观测到mRNAs，但是FISH对整个转录产物的原位分析似乎更有应用前景。

色彩译码技术已经实现了对整个组织的检测。

2FISH 技术的定量分析阶段[1]

Pinkel等（1986）首次将荧光图像定量分析用于基本细胞遗传检测，采用双色激发块装置照相机检测荧光信号，而且定量分析技术很快用于了mRNA检测。

荧光检测的关键是信号的重现性、无规律性及背景的自发荧光。

不仅不同的样品之间荧光不同，而且同一载玻片上的材料或者同样的细胞都有可能显示出不均衡的荧光。

目前已有多种方法用于消除一些组织中的自发荧光：

如样品制备过程中，采用的消除自发荧光试剂包括硼氢化钠或者采用光照辐射进行预处理以消除非特异性背景信号。

这些消除自发荧光的方法并不完全有效，通常在进行图像分析时通过计算机算术除去自发荧光信号。

荧光图像的光谱数据包括真正的信号和许多杂噪，分别进行分析并且通过单独的光谱组分分析除掉杂噪数据。

多色FISH有自身的限制，包括不同的荧光强度和颜色重叠。

但是通过计算机算法分析平衡了多色图像，包括强度变化和自动纠正信号重叠。

FISH图像自身的限制并没有影响到自动破译算法的发展。

采用序列较大探针进行DNA位点检测和多色荧光计数算法辅助病理学家实现了自动化分析。

此外，检测探针试剂盒和点计数方法的应用为便捷的检测结果提供了一个平台。

尽管多种方法已经用于分析或优化自动细胞检测系统，人工的细胞病理检测仍是可信度高的组织分析方法。

然而，细胞制备、鉴别、固定介质上细胞样品计算机化检测在未来的医学诊断中的高效益性不容忽视，快速检测细胞内的分子信号只有通过计算机辅助方法进行检测。

现在，自动化检测程序已经扩展到采用多基因转录模型检测特异的DNA簇和转录位点以确定功能细胞的状态。

鉴于FISH起始阶段的发展主要是探针类型和检测位点的扩展，荧光检测技术将来的发展可能包括检测领域的扩展。

荧光图像临床诊断应用需要在检测体系上进一步提高，如探针的结合，照相和分析的自动化，因此避免了不同操作间的误差。

样品厚度是荧光显微镜检测样品类型的一个限制因素。

近来的激光共聚焦显微镜和光学X射线断层摄影技术要求样品厚度达到1~2mm。

一种改进的光学投射X显微断层摄影技术可以获取到15mm厚样品的图像扩大了生物学和诊断样品的检测范围。

活细胞的RNAsFISH技术检测也有报道。

既可以采用体内释放的荧光集团也可以采用杂交后探针的荧光素进行检测。

这两种新方法都可以降低非特异性标记探针存在时的高背景（如活细胞），可以用于追踪mRNA的合成和转移途径。

这些方法较绿色荧光蛋白（Greenfluorescenceprotein,GFP）更易于检测不同靶分子。

相对于GFP活细胞原位杂交检测，FISH易受到细胞内合成探针的影响。

FISH需要进一步的改进以降低活体基因表达检测时的干扰背景，避免细胞内自身杂交物的干扰。

其实完全可以不必考虑FISH检测和荧光检测蛋白技术的差异，将FISH技术和荧光蛋白技术结合起来可以同时检测目的核酸和蛋白。

多光子显微技术的应用进一步扩大了荧光图像的应用范围。

采用多光子显微镜，激光块可以发射光子聚焦于显微镜两到三次激发目的荧光素。

采用近红外激发光可以更深层次穿透生物样品，比可见光对活体样品造成的毒性低。

这种新方法的应用已将荧光图像用于活体系统的检测，甚至整个动物体。

由于还不能合成生物体标记探针，因此目前生物体内荧光图像的应用只限于检测荧光分子或生物体自发荧光。

生物组织在正常的生理或者病理生理过程中产生的自发荧光信号可以作为一种重要的诊断信号。

一旦生物体探针成为可能，将会成为鉴别特异核酸序列，进行非入侵诊断，获取诊断图像的一种有力辅助手段。

FISH简介

荧光原位杂交（FluorescenceInSituHybridization,简称FISH）由于其直观,快速,敏感性高和方便灵活越来越得到广泛应用,尤其是在血液学领域中.因为白血病标本比较容易取得和制备,不同类型的白血病又往往有其特异的染色体异常,FISH在白血病诊断,治疗监测,预后估计和微小残留病检测等诸方面都正成为不可缺少的重要手段.

　　FISH的基本原理很简单,就是标记了荧光的单链DNA（探针）和与其互补的DNA（玻片上的标本）退火杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况.

　　FISH探针按标记方法可分为直接标记和间接标记:

用生物素（biotin）或地高辛（digoxingenin）标记称为间接标记,杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号,因而步骤较多,操作麻烦,其优点是在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大;直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标记.由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号,省去了烦琐的免疫荧光反应,不再需要购买荧光抗体,也由于近年来荧光互的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高,直接标记的荧光探针越来越成为首选,采用多种不同颜色的荧光,方便在同一标本上同时检测多钟异常.其荧光强度和信号大小都易于在普通荧光显微镜下观察,操作过程中也不需要严格避光,使FISH过程变得简便而易于操作.

FISH并不能取代传统的白血病MCI诊断,但它却能使MIC分型更为准确和深入.MIC即细胞形态学（M）,免疫学（I）和细胞遗传学（C）,三者结合对白血病进行分型诊断,对不同类型的白血病采用不同治疗方案手段.随着人们对白血病的不断认识,仅进行MIC分型不够全面,还要加上对白血病的分子（M）诊断,成为MICM分型.FISH就是连接细胞遗传学和分子生物学的桥梁.

FISH流程

仪器设备

1、医用微波炉；

2、水浴锅；

3、OLYMPUSBX51荧光显微镜；

4、OLYMPUSDP11数字显微照相机。

FISH试剂

（1）1×PBS：

由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；

（2）20×SSC（pH7.0）；

（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；

（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。

（5）变性液（70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0）：

4ml20×SSC；

8ml蒸馏水；

28ml甲酰胺。

每次新鲜配制。

（6）杂交后洗涤液：

20×SSC4ml；

蒸馏水16ml；

甲酰胺20ml。

每次新鲜配制。

调节pH前升至室温。

实验步骤

1、脱蜡：

1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；

2）100％酒精两次，每次2min；

3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

2、蛋白酶处理:

1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：

2×SSC40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。

将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。

37℃孵育20min。

3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。

4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。

3、变性：

1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；

2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；

3）78℃孵育8min；

4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；

5）空气干燥。

4、杂交：

1）准备探针；

2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；

3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；

4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。

（杂交后的水洗）

5）镊子小心去除盖玻片；

6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；

7）2×SSC（37℃）洗两次，每次10min；

8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。

（检测）

9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。

把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。

10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；

11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。

1×PBS室温下洗3次，每次2min。

（扩增）

12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；

14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。

1×PBS室温下洗3次，每次2min；

15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；

17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。

5、细胞核染色：

1）张切片加10μl～20μlDAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；

2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。

切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。

实验流程

第一天

缺口平移标记探针

1.1试剂准备

（1）0.1mmol/LdNTP

0.3mmol/LdATP、0.3mmol/LdCTP和0.3mmol/LdGTP等体积混合。

（2）0.1mmol/LdTTP

1倍体积的0.3mmol/LdTTP和2倍体积的三蒸水混合。

1.2缺口平移体系和反应条件

0.1mmol/LdTTP6.5μl

0.1mmol/LdNTP10μl

10×NickTranslationbuffer5μl

1mmol/LDIG-11-dUTP/Biotin-16-dUTP0.5μl

NickTranslationEnzyme10μl

DNA（1μg）Xμl

H2O18-Xμl

intotal50μl

以上为标记1μgDNA的缺口平移体系，若标记更多量的DNA，则试剂量和反应体系相应等倍扩大。

各成分混匀后短时离心。

对于≤10kb的质粒，于15℃反应3.5小时；对于BAC/PAC，于15℃反应9小时。

1.3凝胶电泳判断探针大小

将EP管置于冰上，取其中5μl于70℃加热5分钟后行2％琼脂糖凝胶电泳以观察所标记探针的大小，单一序列探针合适大小为200～600bp；如片段大小偏大，则于15℃延长反应10～30分钟，再重复进行凝胶电泳，直至得到合适大小的探针。

1.4终止反应

向反应体系中加入1μl0.5MEDTA和（或）70℃加热5分钟，以灭活酶。

探针于-20℃保存备用。

第二天

1.探针的沉淀和变性

1.1探针混合物的组成

（1）对BAC/PAC探针

DNA探针5ul

HumanCot-1DNA3ul

SalmonSpermDNA0.5ul

H2O1.5ul

intotal10ul

（2）对着丝粒探针：

DNA探针5ul

SalmonSpermDNA0.5ul

H2O4.5ul

intotal10ul

1.2DNA的沉淀

将探针混合物与1ul（V/10）3M醋酸钠（PH5.2）和27.5ul（2.5V）无水乙醇（-20℃冻存）混合，-80℃沉淀30min（或-20℃沉淀过夜），以14000g在4℃离心30min，以沉淀DNA。

1.3清洗沉淀

小心弃去上清，用70％乙醇洗涤一次，再次以14000g在4℃离心15min；小心弃去上清，在45～50℃的中温水浴中风干DNA沉淀10～15min。

注：

当大部分乙醇蒸发时，白色的DNA沉淀变为半透明状；一定要彻底清除乙醇，否则会在加入MasterMix后产生微小的沉淀，导致高背景。

1.4溶解探针

加入5μl预热至37℃的去离子甲酰胺（PH7.0），短时离心后在37℃振摇30min以充分溶解DNA；再加入预热至37℃的MasterMix5μl，短时离心后在37℃振摇15～30min。

注：

振摇时间尽可能延长；DNA沉淀亦可以TE缓冲液1.1μl溶解后加入Vysis探针缓冲液4.4μl稀释，混匀后瞬时离心，37℃振摇15～30min。

1.5探针的变性和预杂交

短时离心后于80℃水浴中变性探针10min，冰浴5分钟；短时离心，于37℃水浴中预杂交30～60min；独特序列探针（如cDNA）和重复序列探针（如α-卫星DNA）探针，无需预杂交。

2.标本（染色体靶DNA）的处理和变性

2.1滴片和老化

取出储存于-20℃的细胞悬液标本，以1100rpm.离心10min沉淀细胞，换用适量体积的新鲜甲醇:

冰乙醇（v/v）＝3:

1固定液重悬细胞并调整细胞密度，滴片，划出杂交区域，晾干；在预热到37℃的2×SSC中老化30min（也可实验前夜室温过夜老化再以2×SSC浸泡2分钟）；依次于70%、90%和100%的梯度乙醇中依次脱