DEAE 纤维素离子交换层析法.pptx

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实验十六DEAE纤维素离子交换层析法分离蛋白质指导教师：

夏洪生化教研室李晓梅生物化学和分子生物学实验中心DEAE-32纤维素处理称取DEAE-32纤维素5.0克先用40ml0.5mol/LHCL浸泡30分钟,倾弃上清液,加蒸馏水100m1,搅拌后倒入有100目尼龙滑布的漏斗中,用蒸馏水充分洗涤,直到流出液的pH4止，将上述纤维素放入烧杯中.再用40ml0.5mol/LNaOH浸泡30分钟,倾弃上清液,加蒸馏水100m1,搅拌后,倒入有细尼龙布的漏斗中,用蒸馏水充分洗涤,直到流出液的pH8时，滤去水分。

加入0.01MNa2HP04,搅动并充分洗涤，必要时再重复操作,直到溶液pH=8止.将上述纤维素放入烧杯中.转型平衡膨润【目的要求】掌握DEAE纤维素离子交换层析法的基本原理掌握紫外检测系统及其实际操作过程，包括装柱、洗脱、监测等步骤熟悉DEAE纤维素离子交换剂的结构及特点了解梯度洗脱的原理【实验器材】仪器与材料试管、烧杯、玻璃搅棒、层析柱、梯度洗脱仪等药品DEAE纤维素-32（纤维素DE32）、0.5mol/LHCL、0.5mol/LNaOH、0.01MNa2HP04、0.5MNa2HP04层析法（chromatography）背景层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。

他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography）。

后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。

英国生物学家Martin和Synge。

他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓识的预言。

1944年出现纸层析以后，层析法不断发展，相继出现薄层层析、亲和层析、凝胶层析、气相层析、高压液相层析（HPLC）等。

层析法的基本原理层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。

分类：

分子筛凝胶过滤层析-分子形状及大小分配层析-分配系数（溶解度）吸附层析-分子极性（亲水性，疏水性）离子交换层析-带电荷性质亲和层析-分子识别stationaryphasethesampleThemobilephasechromatographiccolumn离子交换层析离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。

离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。

定义：

离子交换层析法是利用离子交换剂对各种离子有不同亲和力，来分离混合物中各种离子的层析技术。

原理：

它基于所研究或所分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液的各组分分开。

组成：

固定相就是离子交换剂，流动相是一定pH值和一定离子强度的电解质溶液。

离子交换剂是一类具有酸性或碱性基团，能和溶液中阳离子或阴离子进行交换的不溶物质。

离子交换剂结构可以分为三部分：

高分子聚合物基质（母体）电荷基团平衡离子电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。

平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。

根据其不溶物质的化学本质分为三类：

1离子交换树脂2离子交换纤维素3离子交换葡聚糖凝胶平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂：

带有SO3或COO基团，通常以SO3Na或COOH形式出现的叫做阳离子交换基；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。

带有N（C2H5）基团通常以N（C2H5）Cl出现的叫做阴离子交换基。

离子交换体的种类阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨乙基纤维素阴离子交换层析分离机理H+H+H+H+H+H+H+H+H+DEAE（二乙基氨基乙基）在H+的攻击下产生SP2杂化，H从+而形成带H有+正电荷的H基+团OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OHOH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OHO-H-OHOH-OH-OHOH-OH-OHOH-OH-O-H-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OHOH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OHO-H-OHOH-OH-OHOH-OH-OHOH-OH-O-H-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OHOHOHOH-OHOH-4HPO42-HPO444HPO2-4HPO2-4HPO2-4HPO2-HPO2-OH4HPO-2-OH4HPO2-HPOOH42-OH42-HPO2-HPO2-OH4HPO2-HPOOH42-OH4HPO-2-OH4HPO2-HPO4-2-OH4HPO-2-OHPHO4-2-HPO42-OHHPO-4-2-OH4HPO2-HPO42-HPOOH42-O4HHPO2-HPO42-HPOOH42-HPOOH42-OH4HPO-2-HPO42-OH4HPO2-HPO4-2-HPO4-2-OH4HPO-2-OH4HPO-2-44HPO2-4HPO2-HPO2-44HPO2-4HPO2-4HPO2-HPO2-44HPO2-HPO42-4HPO2-44HPO2-HPO2-4HPO2-HPO2-HPO2-4HPO2-4HPO2-HPO2-44HPO2-4HPO2-4HPO2-HPO44HPO2-4HPO2-4HPO2-24HPO4H4PO2-2-蛋白蛋白质与交换介质的结合DEAE-32纤维素处理称取DEAE-32纤维素5.0克先用40ml0.5mol/LHCL浸泡30分钟,倾弃上清液,加蒸馏水100m1,搅拌后倒入有100目尼龙滑布的漏斗中,用蒸馏水充分洗涤,直到流出液的pH4止，将上述纤维素水分挤干后放入烧杯中.再用40ml0.5mol/LNaOH浸泡30分钟,倾弃上清液,加蒸馏水100m1,搅拌后,倒入有细尼龙布的漏斗中,用蒸馏水充分洗涤,直到流出液的pH8时，滤去水分。

加入0.01MNa2HP04,搅动并充分洗涤，必要时再重复操作,直到溶液pH=8（8-9）止.将上述纤维素水分挤干后放入烧杯中.转型平衡膨润洗脱PHI蛋白质的分离过程洗脱方式阶段洗脱梯度洗脱起始缓冲液（ph8.0）0.01MNa2HPO430ml终末缓冲液（ph4.0）0.5MNaH2PO430ml梯度洗脱起始缓冲液0.01MNa2HPO430ml终末缓冲液0.5MNaH2PO430ml梯度发生器【方法与步骤】DEAE-32纤维素处理装柱安装梯度发生器加样洗脱检测调试仪器操作二装柱纤维素沉降完全纤维素1/22/3高度保留弯月形液体界面层析柱下口旋紧、层析柱上口打开封闭良好、防漏从上口倒入液体起始洗脱液，排气、查漏上口倒入纤维素已平衡好的纤维素流出管口封闭操作三加入样品加入血清0.5ml待样品完全进入加入起始洗脱液洗脱液高约1厘米层析柱上口旋紧流出管口封闭加样前加样后样品流入凝胶加入起始洗脱液梯度发生器层析柱蝴蝶夹蠕动泵紫外检测仪记录仪磁力搅拌器蠕动泵方向选择“左”上样参数：

0.5ml血清洗脱参数：

起始缓冲液：

30ml0.01MNa2HPO4终末缓冲液：

30ml0.5MNaH2PO4洗脱速度：

10滴/分记录仪器参数：

电压：

100mV走纸速度：

6cm/h洗脱条件安装梯度发生器将梯度发生器两筒间及出口胶管的螺旋夹都拧紧，向有出口侧的筒内加入0.01MNa2HP04液30m1，排出连接导管中气泡，另一筒内加0.5MNa2HP04液30m1。

把此梯度发生器放到磁力搅拌器上，搅拌子放在出口侧的盛液筒中，使梯度发生器出口细胶管内充满掖体，排出气泡。

扭紧螺旋夹。

细胶管下端连接到层析柱上口的胶塞上的连接管上。

胶塞与层析柱上口暂不连接。

起始缓冲液（ph8.0）0.01MNa2HPO430ml0.5MNaH2PO430ml起始缓冲液0.01MNa2HPO430ml终末缓冲液0.5MNaH2PO430ml终末缓冲液（ph4.0）安装梯度发生器将梯度发生器两筒间及出口胶管的螺旋夹都拧紧，向有出口侧的筒内加入0.01MNa2HP04液30m1，排出连接导管中气泡，另一筒内加0.5MNa2HP04液30m1。

把此梯度发生器放到磁力搅拌器上，搅拌子放在出口侧的盛液筒中，使梯度发生器出口细胶管内充满掖体，排出气泡。

扭紧螺旋夹。

细胶管下端连接到层析柱上口的胶塞上的连接管上。

胶塞与层析柱上口暂不连接。

DEAE-32纤维素处理称取DEAE-32纤维素4.0克先用40ml0.5mol/LHCL浸泡30分钟,倾弃上清液,加蒸馏水100m1,搅拌后倒入有100目尼龙滑布的漏斗中,用蒸馏水充分洗涤,直到流出液的pH4止，将上述纤维素水分挤干后放入烧杯中.再用40ml0.5mol/LNaOH浸泡30分钟,倾弃上清液,加蒸馏水100m1,搅拌后,倒入有细尼龙布的漏斗中,用蒸馏水充分洗涤,直到流出液的pH8时，滤去水分。

加入0.01MNa2HP04,搅动并充分洗涤，必要时再重复操作,直到溶液pH=8（8-9）止.将上述纤维素水分挤干后放入烧杯中.转型平衡膨润DEAE-32纤维素处理称取DEAE-32纤维素4.0克先用40ml0.5mol/LHCL浸泡30分钟,倾弃上清液,加蒸馏水100m1,搅拌后倒入有100目尼龙滑布的漏斗中,用蒸馏水充分洗涤,直到流出液的pH4止，将上述纤维素水分挤干后放入烧杯中.再用40ml0.5mol/LNaOH浸泡30分钟,倾弃上清液,加蒸馏水100m1,搅拌后,倒入有细尼龙布的漏斗中,用蒸馏水充分洗涤,直到流出液的pH8时，滤去水分。

加入0.01MNa2HP04,搅动并充分洗涤，必要时再重复操作,直到溶液pH=8（8-9）止.将上述纤维素水分挤干后放入烧杯中.转型平衡膨润紫外检测系统紫外检测系统恒流泵紫外监测仪部分收集器记录仪8、连接紫外检测器（280nm）、分步收集器和走纸记录仪；开关设置换管时间时钟与收集切换设置自动复位将样品出口对准第一根试管中心记录仪放下记录笔调零开始测量选择走纸速度电源开关与紫外连接选择量程记录仪参数走纸速度：

6cm/h量程：

100mvI0IT=I/I0;%T=T100蛋白质的紫外吸收性质（酪氨酸、色氨酸）波长：

280nmA=-LogT=KCL9、调紫外检测器透过率T为95，吸收率为5；样品进口透过率T为95样品出口吸收度C为5装柱用螺旋夹扭紧层析柱下端胶管，把层析柱夹在铁支架上柱中加数十毫升0.01MNa2HP04液，然后打开出口，排出气泡，待柱中液体只剩下约5-15cm高时关闭出口将处理好的DEAE纤维素混悬液移入层析柱内，蠕动泵开，使液体滴下。

连续移入纤维素混悬液，直到累积的柱面达到层析柱2/3高度后，停止移入。

待液面接近纤维素顶上界面时（此时调节滴速为5-10滴/分，并使柱面与液面相切），蠕动泵关。

加样用吸管接近床面的位置上缓慢加入血清0.5m1，打开蠕动泵让液体缓慢流出，流速每分钟5-10滴到全部血清恰好注入床面时，立即小心的用滴管加入0.01MNa2HP04液0.5m1,当液面接近床面时，（柱面与液面相切），蠕动泵关。

加样前加样后开：

样品停停:

加入起始流入凝胶，停洗脱液2-3cm用滴管加入0.5ml血清样品用吸管接近床面的位置上缓慢加入血清0.5m1，打开蠕动泵让液体缓慢流出，流速每分钟5-10滴到全部血清恰好注入床面时，立即小心的用滴管加入0.01MNa2HP04液0.5m1,当液面接近床面时，（柱面与液面相切），蠕动泵关。

用滴管加入起始洗脱液2-3cm高。

加样洗脱拧松并取下梯度发生器两盛液筒间的螺旋夹，开动磁力搅拌器。

将连接梯度发生器出口的细胶管连接到层析柱上端胶塞连接管上，使液体流入层析柱内。

控制流速约5-10滴/分，每收集管收集量约为4m1时换管，直到收集完为止拧松并取下梯度发生器两盛液筒间的螺旋夹，开动梯度发生器：

细胶管下端连接到层析柱上口的胶塞上的连接管上洗脱洗脱与监测洗脱速度10滴/分钟记录仪参数走纸速度：

6cm/h量程：

100mv结果与分析不同管号中的蛋白质溶液，吸光度各异，随着管号增加，吸光度先逐渐升高然后逐渐降低【注意事项】一、装层析柱时应注意：

固定玻璃柱，调整垂直；将交换剂用起始缓冲液调稀搅匀后加入，柱内的交换剂应非常均匀地分布，不应出现节面和气泡，不能干柱，床面要平整，床高距柱顶23cm为宜。

加样时不要搅动床面。

二、使用紫外检测系统时应注意：

紫外检测仪：

1、用0.2A档以上量程时，仪器需预热4小时。

2、仪器应避免震动。

3、仪器最好经常使用。

不经常使用时，仪器最好每隔2-3个月开机4小时。

不经常使用的空芯极灯在开始使用时，稳定时间要长些，这是正常现象。

4、置于灯保护套前方的滤光片，长期不用时应保存在干燥皿里，防止受潮，沾污时可用镜头纸擦试。

5、更换新的吸收池时，需在机外加一定压力的液体检查，确保接口无泄漏，方可安装上机。

6、每次测试完毕，关机前都需将量程旋钮（5）旋回T档。

在旋转的过程中，用劲要过大。

否则使用T档逐渐向下错位，给仪器的使用带来不便。

恒流泵：

1、仪器在使用期间，应随时注意硅橡胶管是否完好，一般在中速情况下运转为佳，当发现硅橡胶管使用老化时，应及时更换。

当仪器开始运转时，硅橡胶管可能有向一端肿起现象，可用手拉直即可。

2、要注意保持泵槽内清洁，尤其对滚子轴套（当中一只）必须擦干净，以免“T”字轮搁死。

3、如果长时间不使用，应取下硅橡胶管，延长使用期间。

记录仪1.记录纸一般都具有伸缩特性,特别是受温度影响大,因此,要充分注意使用之前记录纸的存放地方及存放时间。

2.由于笔尖是用毡纤维制成,请不要用力按压,以免损坏尖端。

3.有时候新的纤维笔一开始不出墨水,此时用手拿在纸上轻轻地擦划,使其出水。

4.在记录仪的地端子和测量用的L端子间施加1千赫以上的高频电压或脉冲电压时。

可能出现笔摆动（不稳）的状况.在这种情况下,可利用滤波器将高频电压滤掉,或者将接地端子和L端子间短路来解决。

5.本仪器没有配备防护端子,因此,信号源的低阻抗则一定要同L端子连接。

6.在开始记录之前要使手转走纸驱动轮反向旋转使其无间隙.不然的话,在低速度送纸时,要等相当一段时间,记录纸才能送出来。

【复习题】层析,离子交换剂,离子交换层析,转型DEAE纤维素离子交换层析法分离蛋白质的基本原理。

分析梯度洗脱的机制思考题1、分子筛层析、离子交换层析样品在流经柱子的时候都受到哪些力的作用？

2、分子筛层析、离子交换层析对柱料前处理、上样和洗脱的要求有何不同？

3、如果两种组分分离不开，试解释其可能的原因？

4、上样之前如果不进行平衡，会对结果产生什么影响？

5、凝胶过滤分离大分子物质的机理是什么?

6、分子质量为8万和10万Da的蛋白质能否在SephadexG-75柱中分开？

为什么?

7、在操作方面，凝胶过滤与离子交换层析有何异同处？

8、制备合格的凝胶层析柱应注意哪几点？

9、在使用紫外检测系统装置时，有哪些操作事项是应该注意到的？