分子生物学实验讲义剖析.docx

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分子生物学实验讲义剖析

　　　　　　　实验质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

一、实验原理

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。

目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：

当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。

对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

二、实验试剂

1、溶液Ⅰ：

50mM葡萄糖，25mMTris-HCl（pH8.0），10mMEDTA（pH8.0）。

1MTris-HCl（pH8.0）12.5ml，0.5MEDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。

在10lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4℃。

2、溶液Ⅱ：

0.2NNaOH，1%SDS。

2NNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。

使用前临时配置。

3、溶液Ⅲ：

醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。

5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。

4℃保存备用。

4、TE：

10mMTris-HCl（pH8.0），1mMEDTA（pH8.0）。

1MTris-HCl（pH8.0）1ml，0.5MEDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。

15lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

5、苯酚/氯仿/异戊醇（25：

24：

1）

6、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）

7、5×TBE：

Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O4.65g，加ddH2O至1000ml。

15lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

8、溴化乙锭（EB）：

10mg/ml

9、RNaseA（RNA酶A）：

不含DNA酶（DNase-free）RNaseA的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。

10、6×loadingbuffer（上样缓冲液）：

0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。

11、1%琼脂糖凝胶：

称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：

EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。

缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。

三、实验操作

1、挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0mlLB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。

2、取1.0ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

3、将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

4、加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。

溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀,4℃离心8000g×10min,小心移出上清于一新微量离心管中。

6、加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心8000g×10min。

7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.0倍体积（1ml）预冷的无水乙醇，混匀，室温放置５min，4℃离心12000g×10min，弃上清。

8、加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干或吹干（不能过于干燥，造成溶解困难）。

9、沉淀溶于20μlTE（含RNaseA20μg/ml），-20℃保存备用。

四、质粒DNA的电泳检测

　　观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。

该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。

DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。

这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。

因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。

取制备的质粒DNA1-2μl，加适当loadingbuffer混匀上样,采用1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。

五、注意事项

　　本裂解法小量制备质粒DNA重复性好，一般无麻烦。

若所提取质粒DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。

六、习题：

1、什么是质粒？

质粒有什么主要用途？

2、分子生物学实验中用的质粒是由野生型改建而来的，它必须具备哪三个基本要素？

3、制备的质粒DNA在琼脂糖凝胶上通常以三种形式条带存在，它们分别是什么？

实验琼脂糖凝胶电泳实验

一、实验目的

（1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；

（2）掌握使用水平式电泳仪的方法；

二、实验原理

　　琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。

核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。

核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。

因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：

（1）DNA的分子大小。

线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。

（2）DNA分子的构象。

当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。

相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。

如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。

（3）电源电压。

在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。

但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。

要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。

（4）离子强度影响。

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。

在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

溴化乙啶（Ethidiumbromide,EB）

（1）能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。

由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以现在也开发出了安全的染料，如Sybergreen。

常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。

三、试剂与器材

（一）材料

电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等

（二）试剂

1、50*TAE（1000mL）：

242gTris,57.1mL冰醋酸，18.6gEDTA。

2、EB溶液：

100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。

3、DNA加样缓冲液：

0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。

4、DNA分子量标准

四、操作方法

常规的水平式琼脂糖电泳：

制备琼脂糖凝胶：

按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：

琼脂糖的含量（%）分离线状DNA分子的有效范围（Kb）

0.360-5

0.620-1

0.710-0.8

0.97-0.5

1.26-0.4

1.54-0.2

2.03-0.1

1、制备琼脂糖凝胶：

称取琼脂糖，加入1x电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。

在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

2、胶板的制备：

将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB（也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分钟），摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；

3、加样：

点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。

用10μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。

（注意：

加样前要先记下加样的顺序和点样量）。

4、电泳：

加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。

当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。

样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。

电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。

当溴酚蓝移动到距离胶板中央时，停止电泳。

5、观察和拍照：

电泳完毕，取出凝胶。

在波长为254nm的紫外灯下观察染色后

（2）的或已加有EB的电泳胶板。

DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。

于凝胶成像系统中拍照并保存之。

五、注意事项

1、EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。

凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。

简单处理方法为：

加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L碳酸氢钠。

如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。

2、由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。

因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。

六、实验报告要求与思考题

1、附上电泳结果的图片并进行正确的标注（如下图）

M：

1KbDNAladder；1：

质粒DNA

2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？

3、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？

4、为什么分子生物学实施时要担心EB？

5、琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？

为什么？

电泳流程图：

实验PCR扩增eGFP基因

一、PCR技术的基本原理　

　　PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

　　①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

　　②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

　　③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

（Plateau）。

到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

　　PCR技术应用广泛，不可能有这样一套条件满足所有的实验，但本实验所介绍的方法可适应于大多数DNA扩增反应，即使有的不适应，至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。

不过下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。

1、模板：

单、双链DNA和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料是RNA，须先通过逆转录得取第一条cDNA。

虽然PCR可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般宜用ng量级的克隆DNA，ug级的染色体DNA，待扩增样品质量要求较低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，TaqDNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA的蛋白质。

2、引物：

引物是决定PCR结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。

（1）尽可能选择碱基随机分布，GC含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。

（2）避免具有明显二级结构（尤其是在引物3'—末端）的序列。

3、防止引物间的互补，特别要注意避免具有3'末端重叠的序列。

4、引物的长度约为20个碱基，较长引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。

5、引物浓度不宜偏高，过高易形成二聚体解链；然后冷却至37—55℃，使引物与模板退

二、实验试剂

（一）仪器与器皿

PRC扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，微量取样器，一次性eppendorf管，凝胶成像仪

（二）试剂与材料

1、琼脂糖凝胶电泳试剂

1）电泳缓冲液：

Tris—乙酸0.04mol/LPH8.00.002mol/LEDTA

2）加样缓冲液：

0.25%溴酚兰40%w/v蔗糖

3）溴化乙锭溶液：

0.05mg/ml溴化乙锭/水

4）琼脂糖

2、TaqDNA多聚酶

3、5´反应缓冲液：

125mmol/LTris-HClpH8.2；10mmol/LMgCl2；0.5mg/mlgelatin；125mmol/L（NH4）2SO4；Formamide25%

4、混合dNTP液（dATPdGTPdTTPdCTP各2.5mmol/L）

5、DNA模板

6、引物1（10μmol/L）

7、引物2（10μmol/L）

8、无菌水

三、实验步骤

1、按顺序在200μl指形管中加入以下试剂与样品：

（因购入的试剂批次不同，加样时有所差别，以预实验结果为准。

1）ddH2O37μl

2）10*Buffer5μl（含有MgCL2）

3）dNTP２μl

4）引物1（上游）２μl

5）引物2（下游）２μl

6）模板1μl（pEGFP质粒）

7）TaqDNA聚合酶１μl（2.5U）

总体积共50μl

2、在PCR扩增仪上按以下反应条件编入程序：

（以下为参考值，因扩增的DNA片段不同，各类PCR扩增仪程序设定各不相同，编程过程视扩增的DNA片段的要求及仪器而定参数。

）

1）预变性94℃3分种

2）循环条件（30次）

变性94℃30秒

复性55℃30秒

延伸72℃1分

3）延长延伸72℃7分钟

编完反应程序，置反应管于PCR扩增仪的反应孔中，开动机器，扩增循环反应开始。

3、PCR扩增完毕，配1.5%琼脂糖凝胶，电泳观察结果。

4、凝胶成像仪或紫外灯下观察实验结果，是否已扩增到实验设计的DNA片段

四、习题

1、PCR反应液中主要成分是哪些？

在PCR反应过程中各起什么作用？

2、为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？

3、用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？

实验从动物组织（猪肝）中提取DNA

一、实验内容

采用SDS裂解和蛋白酶K消化法从猪肝中提取DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳分析。

目的

（1）掌握SDS裂解法从猪肝中的原理和方法；

（2）巩固DNA的琼脂糖凝胶电泳分析实验。

二、实验原理

DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。

通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：

氯仿：

异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。

三、实验材料

新鲜猪肝

TES缓冲液：

pH8.0Tris-HCl  10mmoL/L,  EDTA  1mmoL/L,  SDS0.1mmoL/L

四、实验步骤

1、剪取约0.5g肝脏组织，放入到研钵中磨碎；

2、向研钵中再加入1mlTES轻轻研磨，将TES与破碎的组织混匀；

3、吸取535µl组织匀浆液于2mlEP管中，再加入60µlSDS（10%），5.0µl蛋白酶K，充分混匀后，于56°C保温1h，每30分钟轻摇1次；

4、放置到室温，加入等体积饱和酚（600µl），颠倒混匀，11000rpm，离心10min，吸取400µl水相，并转移至一个新的1.5ml离心管中；

5、加入2倍体积（1000µl）的无水乙醇和1/10倍体积（40µl）3M醋酸钠沉淀DNA，12000rpm离心10min，弃乙醇；

6、加入适量TE溶解DNA和RNAseA（具体依DNA的多少而定），并利用0.7%的琼

脂溏进行电泳分析。

五、注意事项

1、在将猪肝剪碎前要将猪肝清洗干净，除去脂肪及系膜成分。

2、抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。

3、取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。

4、乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。

5、离心后，不要晃动离心管，拿管要稳。

6、在乙醇沉淀后，经离心要观察留在EP管中的小白点，其主要成分就是DNA，在以后的实验中都要细心观察，防止因将小白点丢失。

六、习题

1、为了获得高质量的肝脏DNA，在实验过程中应注意什么。

2、结合本人操作体会，总结在提取过程中如何避免大分子DNA的降解。

3、核酸提取中，去除蛋白质的方法有哪些？

实验限制性内切酶切割DNA

一、实验目的

1．通过对DNA的酶切，学会设计构建体外重组DNA分子；

2．根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶；

3．掌握DNA的酶切技术。

二、实验原理

限制性内切酶是从细菌中分离出来的一种能在特异位点切割DNA分子的核酸内切酶，目前已从多种细菌中分离出超过400种，识别各自不同的核苷酸顺序，这一顺序大多为具有一对称中心的回文序列，如从大肠杆菌中分离的EcoRI识别…GAATTC…切割后产生…CTTAAG…、…G和AATTC…的末端，

…CTTAAG…该末端由于有一段小的能互补配对的单链突出，故称为粘性末端。

切割后的末端为3’-OH和5’-磷酸基团，即…G-OH和…CTTAA-P。

有的限制性酶识别四碱基对的顺序，如San3A识别…GATC…；有的识别六

碱基对，如上述的ECORI。

识别四碱基对的内切酶由于识别顺序在DNA出现的频率更高（四碱基酶为44=256，六碱基酶为46＝4096），因而可将DNA切割成更小的片段，而识别八碱基对的NotI…GCGGCCGC…、…CGCCGGCG…则识别和切割位点更少（48＝65536），但碱基并不以均等的概率出现，因而切割后产生的片段变化范围很大。

限制性内切酶作用的温度一般为37℃，反应体系中以Mg2＋为唯一的辅助因子，且要求pH缓冲在7.5左右。

商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃贮存，活性通常较高，5u/μl（每单位即最适条件下1小时内完全酶解1μgDNA的酶量）。

三、实验材料

待酶切的DNA样品

四、实验仪器、器皿及试剂

1、仪器：

可调微量加样器、恒温水浴箱、电泳仪、电泳槽、紫外检测灯

2、器皿：

Eppendorf管、Tip、试管架

3、试剂：

标准DNA（Marker）

EcoRI限制性内切酶

10×buffer：

50mmol/lNaCl

10mmol/lTris-HCl（pH7.5）

10mmol/lMgCl2

lmmol/lDTT（二硫苏糖醇）

五、实验步骤

1、将DNA样品8.5μl（质粒pEGFP,1μg）

2、加入1μl10×buffer，酶解buffer由厂家提供。

3、加入1u（0.5μl）的限制性内切酶EcoRI（限制性酶很昂贵，从-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip头，以免污染杂质，吸完后尽快放回冰箱）。

4、混匀反应液后，稍离心使液体聚集，置37℃温育１小时。

5、进行电泳检查酶切结果，100V25分钟。

6、紫外灯下观察消化效果。

六、注意事项

1、分子生物学实验大多为微量操作，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性以保证酶切效果最佳。

现介绍三种微量取样方法：

（1）吸样时，将Tip尖刚刚接触到液面时，轻轻吸取。

此法可吸取0.2~0.5μl的样品，注意不要将Tip尖全部插入溶液，这样Tip壁上会沾上很多的样品，导致吸样不准。

（2）用1cm长的塑料毛细管代替Tip吸样，此法也可吸取0.2~0.5μl的样量。

（3）目前也有细长Tip出售，专门用于吸取微量样品。

2、限制性内切酶价格比较贵，因此要注意不使其污染而导致浪费。

这就要求每次吸酶时要用新的无菌Tip。

另一个造成限制性内切酶浪费的因素就是限制性内切酶的失活。

因此，要注意加样次序，即各项试剂加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要尽可能