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胰蛋白酶相关性质检测方法综述
胰蛋白酶相关性质的检测方法综述
王安
北京理工大学珠海学院09生物工程
目录
1摘要………………………………………………………………3
2目的………………………………………………………………3
3简要步骤…………………………………………………………3
4实验方法…………………………………………………………4
4.1鸡卵粘蛋白的提取………………………………………4
4.2亲和层析法分离纯化胰蛋白酶…………………………5
4.3酶促学研究………………………………………………6
4.4分子量测定--聚丙烯酰胺凝胶电泳法…………………7
5结语………………………………………………………………8
6参考文献…………………………………………………………10
1摘要：
胰蛋白酶Trypsin是蛋白酶的一种，在脊椎动物个体中作为消化酶起作用，酶原在胰脏合成分泌到肠道中，再受到肠激酶的限制分解成为有活性的胰蛋白酶，作用使蛋白质水解。
本实验探讨胰蛋白酶的分离提纯方法，以及其活性和分子量大小的检测方法。
关键词：
胰蛋白酶Trypsin鸡卵粘蛋白CHOM亲和层析酶活力米氏常数SD-PAGES聚丙烯酰胺凝胶电泳
2目的：
以胰蛋白酶为对象，研究其分子结构、生物功能和作用效果。
优化设计实验蛋白质的提纯、分子量测定、活性鉴定等方法。
巩固生物化学课程要求的知识点。
3简要步骤：
1酶提纯提纯
2酶促反应动力学研究
3对象蛋白分子量测定
4实验方法
4.1鸡卵粘蛋白的提取
4.1.1方法
我们用鸡卵粘蛋白CHOM作为胰蛋白酶亲和层析分离的专一性配体。
a取两个鸡蛋蛋清，加入三氯乙酸-丙酮（0.5M）取出其他蛋白杂质；
b加入-20°C预冷丙酮溶液使鸡卵粘蛋白沉淀
c离心取沉淀物，丙酮洗涤，定容
D考马斯亮蓝（Bradford）法测浓度
E样品溶液放置于4°C冰箱保存
1.1.2现象及数据处理
所得的鸡卵粘蛋白沉淀为白色粉末溶解在10mL去离子水中，
在595nm光下测吸光度曲线，结果如下
标准蛋白测吸光度：
Graph1
Sheet-1提纯后CHOM浓度估算
吸光度
分子量
稀释倍数
0.0874
0.38
400倍
0.0437
0.19
800倍
估算CHOM样品浓度：
34.96mg/mL
4.2亲和层析法分离纯化胰蛋白酶
4.2.1方法
分离过程使用甲壳素为载体，对象酶通过在层析柱中与鸡卵粘蛋白结合而分离出来，再进行洗脱，获得胰蛋白酶液样品。
a按照每克甲壳素配30mg鸡卵粘蛋白，配置2g甲壳素混合液，加入适量戊二醛，搅拌后装成亲和层析柱；
b以Tris-HCl（0.1M,pH8.0,含0.5MKCl,0.05MCaCl2）作亲和平衡液冲洗多余蛋白
c将粗酶样品液上样，用平衡液洗涤，直至流出液不含蛋白质
d用洗脱液（0.1M甲酸pH2.5,含0.5MKCl）代替平衡液进行洗脱，以每试管4mL收集流出液
e用考马斯亮蓝法测定每根试管的蛋白含量，保留蛋白含量最高试管的收集液
fBAEE法测定该收集液的酶活，并计算比活值。
Graph-2洗脱曲线
1.2.2数据处理
定流量/4ml
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
A280吸光值
0.016
0.135
2.816
2.935
2.984
2.892
1.913
0.688
0.265
0.133
附表
定流量/4ml
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
A280吸光值
0.13
0.126
0.103
0.061
0.041
0.028
0.026
0.02
0.011
0.012
定流量/4ml
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
A280吸光值
0.043
0.056
0.046
0.07
0.349
2.408
1.58
0.675
0.36
0.185
*以亲和柱平衡液（0.1M，pH8.0TrisHCl缓冲液）调零
当280nm吸光0.02以下时洗脱完毕
Sheet-2纯化前后胰蛋白酶比活测算
纯化前胰蛋白酶蛋白浓度测定
稀释50倍
A595=0.317
稀释后对应浓度：
3.39mg/mL
样品活力
15000
样品比活
14749
（BAEE单位）
纯化后胰蛋白酶蛋白浓度测定
稀释10倍
A595=0.117
稀释后对应浓度：
0.25mg/mL
稀释5倍后每分钟A升0.070
样品活力
1750
样品比活
23333
（BAEE单位）
4.3酶促动力学研究
4.3.1实验原理及方法
实验原理
酶促反应动力学（kineticsenzyme-catalyzedreactions）主要研究各种理化因素对酶促反应速
度的影响。
在酶的结构与功能关系以及酶作用机理的研究中，需要动力学研究提供实验证据。
为了最大限度地实现酶促反应的高效率、寻找最有利的反应条件以及了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机理等，都需要掌握酶促反应速度的规律。
因此，酶促反应动力学是酶学研究中的一个既具有重要理论意又具有实践意义的课题。
影响酶促反应速度的因素主要有底物的浓度、酶的浓度、温度、pH值、酶的激活剂及抑制剂等。
时间-光吸收关系曲线法
a根据每个底物浓度下的t-A253关系曲线求出酶促反应的初速度v[μmol/（L·min）]，利用作图法得到Km和V。
Sheet-3测定胰蛋白酶Km、最大速率V及胰蛋白酶抑制剂的动力学加样表（单位mL）
b代入米氏方程作图，并求出米氏常数Km和最大反应速率Vmax。
4.3.2数据处理
Sheet-4提纯后CHOM浓度估算
浓度数
浓度倒数
无抑制（#2速率倒数）
抑制1（#3速率倒数）
抑制2（#4速率倒数）
0.138
7.25
111.11
166.67
1000.00
0.207
4.83
100
142.86
666.67
0.276
3.63
90.91
125
500.00
0.345
2.9
83.33
111.11
400.00
0.414
2.42
76.92
100
333.33
graph-3米氏方程图表
*延长无抑制曲线（蓝色）交x轴负方向于-7
计算得Km=0.143
V=0.0013ODA253/s
鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶的抑制是竞争性抑制
4.4聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定胰蛋白酶和鸡卵粘蛋白酶相对分子量
4.4.1实验方法
A组装电泳槽，并依次注入分离胶和浓缩胶待用
B制备待测样品
分别稀释胰蛋白酶溶液（稀释过程加入1MNaOH中和甲酸）、粗酶溶液、鸡卵粘蛋白溶液
各取10微升，加入3微升LoadingBuffer染色液体
C四种样品分别上样，进行电泳
D记录电泳结果，推测胰蛋白酶、鸡卵粘蛋白酶相对分子量
4.4.2电泳结果处理
graph-4电泳结果处理
*括号内表示为Marker中蛋白的分子量
*buffer前沿距离加样端：
4.00cm
Sheet-5电泳结果处理
点样项目
Marker
Trypsin胰蛋白酶
CHOM鸡卵粘蛋白
1
0.5
2.2
1.5-2
2
0.75
3.3
3
1.2
4
1.95
5
2.7
6
3.3
单位：
cm
Marker蛋白（序号）
1
2
3
4
5
6
相对迁Mr
0.125
0.187
0.3
0.487
0.675
0.825
Sheet-6、Graph-5相对迁移率
CHOM：
相对迁移率=0.820
分子量=14000
Trypsin：
相对迁移率=0.55
分子量=67000
5结语
作为验证实验，本次实验令我们对胰蛋白酶的性质有的初步了解，实践了几种常用的酶和蛋白质检验方法，由于操作不熟练、仪器误差和实验时间跨度较大带来的蛋白质变性等因素，实验结果和文献记载仍有一定的出入。
研究蛋白质的性质能够帮主我们了解其作用功能，对生命科学的发展和制药工业意义重大。
6参考文献
[1]生物化学教程高等教育出版社（王镜岩朱圣庚徐长法）
[2]LMB2011.ZHBIL生物化学实验V1.0.pdf（朱超锋，苟斌全，刘小刚）
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