高级生化实验报告记录二.docx

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高级生化实验报告记录二

高级生化实验报告记录二

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实验二Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白

一、背景

印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。

1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southernblotting。

之后，JamesAlwine、DavidKemp和GeorgeStark三位教授又发明了RNA杂交检测技术，因与Southernblotting相似，故命名为Northernblotting。

GeorgeStark这位教授在两年后又开发出类似的蛋白质检测方法。

1981年，在NealBurnette所著的AnalyticalBiochemistry中，首次将单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Westernblotting。

此后开发的Easternblotting是Westernblotting的变形，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Easternblotting。

30多年来，Westernblotting技术已成为蛋白质研究中最常用的工具，用于鉴定目的蛋白是否存在（定性），目的蛋白质的表达量和不同样品之间的表达差异性（定量）。

pET系统是在大肠杆菌（Escherichiacoli）中克隆表达目的基因、产生重组蛋白的经典表达系统。

目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。

T7RNA聚合酶被充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。

目的蛋白可用于进一步的SDS-PAGE分析、Westernblotting检测或亲和层析分离纯化。

二、实验目的

利用WesternBlotting技术，定性检测苦荞二氢黄酮醇4-还原酶基因（FtDFR）在E.coliBL（DE3）中的诱导表达。

三、实验原理

采用PCR技术，在苦荞FtDFR基因ORF起始密码子前引入KpnІ酶切位点，终止密码后引入SalⅠ酶切位点。

PCR产物与pET-30b（+）质粒进行体外重组，获得重组质粒pET-30b-FtDFR，设计其表达产物在N-末端含有6×His标签。

重组质粒经鉴定后转化表达宿主菌E.coliBL21（DE3）并使用IPTG进行诱导表达，分别收集诱导0h、2h、4h、6h和8h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Westernblotting分析。

Westernblotting的实验流程如下：

蛋白质首先通过SDS-PAGE凝胶电泳分离，进一步通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜）；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定后含有特定抗原的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体发生抗原-抗体反应，并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。

本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-HistagIgG，一抗）与重组FtDFR蛋白的N-末端的6×His发生抗原-抗体特异反应，利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（peroxidase-GoatAnti-MouseIgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。

DAB即：

二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine），是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。

DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。

该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Westernblotting等膜显色中应用广泛。

四、操作步骤

1样品的制备

原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。

1.1材料与试剂：

基因工程菌重组E.coliBL21（DE3）pET-30b（+）-FtDFR；

LB固体培养基（Kan50μg/mL）

LB液体培养基（10mL、50mL）

Kan（50mg/mL）

IPTG（24mg/mL）

PBS缓冲液：

137mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4,2mMKH2HPO4,pH7.4；

5×SDS上样缓冲液（pH8.0）：

250mMTris-HCl（pH6.8），10％（W/V）SDS，0.5％（W/V）溴酚蓝，50％（W/V）甘油，5％（W/V）β-巯基乙醇；

1.2仪器与设备：

恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、酒精灯、消毒酒精（75%）、棉球、接种环、台式离心机、Tip（10μL、200μL、1mL）、微量加样器（10μL、200μL、1mL）、离心管（1.5mL）。

1.3操作步骤：

①将基因工程菌E.coliBL21（DE3）pET-30b（+）-FtDFR划线于LB固体培养基（Kan抗性），37℃培养16h。

②挑选单菌落，接种至10mLLB培养基（按0.1%加入Kan，10μL）于37℃过夜培养，即为种子液。

③按2%的接种量（1mL）将种子液接种到50mLLBKan培养基中（按0.1%加入Kan，50μL），于37℃培养OD600至0.5（约2.5h）。

④加入IPTG至终浓度为1mmol/L（100μL），置于22-25℃连续诱导表达8h，分别取诱导前0h，诱导后2h、4h、6h和8h的培养液1mL于1.5mL离心管中，置于4℃备用。

⑤诱导完毕后，各样品于12000rpm离心5min收集沉淀，用等体积PBS（1mL）重悬漂洗细胞2次，收集菌体。

⑥各管分别加入80μLPBS重悬细胞，加入20μL5×SDS上样缓冲液，混匀后置于沸水浴中10min，12000rpm离心3min后，置于4℃备用。

1.4注意事项：

①重组蛋白的诱导表达应进行正确的无菌操作并加入适宜浓度的抗生素，避免可能的污染。

②制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。

③多次使用时样品应进行分装，保存于-20℃或-80℃且避免反复冻融。

2SDS-PAGE

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAG1）是一种常用的定性分析蛋白质的电泳方法，多用于分离蛋白质或测定蛋白质相对分子质量。

十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，能破坏蛋白质分子间的非共价键，使白质变性而改变原有的空间构象。

在强还原剂（如β-巯基乙醇或二硫苏糖醇）存在的情况下，蛋白质分子内的二硫键被打开，蛋白质的空间构象可进一步改变。

此时，SDS以其疏水基和蛋白质的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的蛋白质-SDS复合物。

据计算，结合到蛋白质分子上的SDS分子数目和蛋白质的氨基酸残基比值一般为1：

2。

这种复合物由于结合了大量的SDS，所引入的净电荷大大超过了蛋白质原有的净电荷（约10倍），使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小但屏蔽了蛋白质天然电荷差异的负离子复合物，因而各SDS-蛋白质复合物具有均一的电荷密度，相同的荷质比，其电泳迁移率主要取决于蛋白质自身的分子质量，而与其所带电荷和形状无关。

当蛋白质相对分子质量在11700-200000之间时，电泳迁移率与分子质量的对数呈直线关系，符合以下方程式：

lgMW=-bmR+K

式中，MW为蛋白质相对分子质量；b为斜率，mR为电泳相对迁移率，K为节距。

在一定条件下，K和b均为常数，基于这一关系，通过测定几个标准蛋白质（即相对分子质量已知）的迁移率，可得一条标准曲线。

未知蛋白质在相同条件下进行电泳，测得它的相对迁移率，即可在标准曲线上求得其相对分子质量。

2.1材料与试剂：

①分离胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl，0.4%SDS，pH8.8）。

②浓缩胶缓冲液（0.5mol/LTris-HCl，0.4%SDS，pH6.8）。

③30%丙烯酰胺/N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（Arc/Bis）：

29.2gAcr，0.8gBis，定容至100mL。

④TEMED（四甲基乙二胺）。

⑤2×SDS上样缓冲液（pH8.0）：

250mMTris-HCl（pH6.8），10％（W/V）SDS，0.5％（W/V）溴酚蓝，50％（W/V）甘油，5％（W/V）β-巯基乙醇。

⑥电极缓冲液（pH8.3）：

3.03gTris，14.41gGly，1.0gSDS，调整pH后定容至1000mL。

⑦电极缓冲液（3.03gTris，14.41gGly，1.0gSDS，调整pH=8.3定容至1000ml）

⑧封底胶：

1g琼脂糖溶于100ml电极缓冲液。

⑨染色液：

45%甲醇，10%乙酸，0.25%考马斯亮蓝R-250。

⑩脱色液：

10%（V/V）乙酸，5%（V/V）乙醇。

预染标准分子量蛋白质Marker。

2.2仪器与设备：

MV-Ⅲ型小型单垂直板电泳槽及附件、电炉、电泳仪、微量加样器（10μL），Tip（10μL）。

2.3操作步骤：

①制胶槽的安装：

将成套的两块玻璃板放置于制胶槽背面上的支架固定（凹形玻璃板向外），4个铁夹分别夹在玻璃板左右两侧即可制胶。

②SDS-PAGE分离范围一般在10-200kDa，超过这个范围无法进行准确比较。

不同的凝胶浓度适用于不同的相对分子质量范围，根据蛋白质相对分子质量选择最适的凝胶浓度，如下表所示。

本实验选用12.5%的分离胶对重组FtDFR（约40kDa）进行分离。

试剂

分离胶

浓缩胶

浓度

7.5%

10%

12.5%

15%

30%

4%

分离胶缓冲液mL

4.0

4.0

2.0

4.0

4.0

-

浓缩胶缓冲液mL

-

-

-

-

-

0.625

Acr/BismL

4.0

5.3

3.35

8.0

10.7

0.375

H2OmL

8.0

6.7

2.65

4.0

1.3

1.5

10%APmL

0.3

0.3

0.15

0.3

0.3

0.075

TEMEDmL

0.008

0.008

0.008

0.008

0.008

0.005

③制胶：

配制12.5%的分离胶，灌入两玻璃板之间，加至凹形玻璃板顶端2cm处，立即覆盖5mm左右水层，静置聚合。

当分离胶与水层之间的界面重新出现时表明已胶已聚合。

小心倒掉分离胶上水层，配制4%浓缩胶后加入玻璃板中，插入梳子并及时补充由于浓缩胶聚合产生的空隙。

④电泳槽安装：

浓缩胶聚合后，除去4个铁夹，正确安装进入电泳槽（凹形玻璃板向内）并用白色塑料夹将玻璃板固定。

⑤点样：

分别于内外槽加入适量电极缓冲液，使内槽水位超过凹形板缺口。

使用微量加样器分别于制胶孔中加入诱导后的样品4-5μL，预染标准分子量蛋白质点10μL。

⑥电泳：

接通电源，待指示剂在分离胶中迁移5cm时，停止电泳。

⑦剥胶：

小心剥胶，将浓缩胶（浓缩胶影响操作）和分离胶上不用的部分切去（便于识别）。

WesternBlotting做到此处为止。

⑧染色：

凝胶加入适量染色液，电炉加热处理15min染色。

⑨脱色：

使用蒸馏水漂洗取出染色液，加入脱色液，电炉加热脱色至出现清晰的蛋白条带。

2.4注意事项：

①上样总体积一般5-10μL左右，胶孔的最大限度可加15μL样品。

②微量加样器应贴壁吸取样品，避免吸进气泡；将微量加样器Tip头插至加样孔中缓慢加入样品，避免样品溢出。

③电泳设备应注意检查正负极、是否短路或接触不良、是否漏液、电流电压大小（电流强度会随电泳的进行有所降低）。

④电极缓冲液、TEMD和AP应新鲜配制。

3转膜与杂交

杂交膜的选择是决定Westernblotting成败的重要环节。

应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。

用于Westernblot的膜主要有两种：

硝酸纤维素膜（NC）和聚偏氟乙烯膜（PVDF）。

NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起；在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。

PVDF膜灵敏度高、分辨率和蛋白亲和力比NC膜高，非常适合于低分子量蛋白的检测。

PVDF膜在使用前必须用纯甲醇浸泡饱和5sec，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。

根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜或PVDF膜。

随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。

通常用0.45μm和0.2μm两种规格的NC膜和PVDF膜。

大于20kDa的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kDa的蛋白用0.2μm的膜。

蛋白质常用的转移方法主要有两种：

槽式湿转和半干转移。

前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。

以下为槽式湿转的操作步骤。

3.1材料与试剂：

①材料：

PVDF膜（0.45μm，进口分装），Whatman滤纸（进口分装），搪瓷盘，一次性PE手套，镊子，玻棒，WesternblottingDAB显色法试剂盒。

②试剂：

转移缓冲液pH8.3（25mmol/LTris，0.2M甘氨酸，20%甲醇）1000mL；

10×TBS缓冲液pH7.6（24.2gTrisbase，80gNaCl，用1NHCl调pH=7.6）；

脱脂奶粉、BSA或试剂盒自带的蛋白质干粉；

洗涤缓冲液（1×TBS，0.1%Tween-20）；

封闭缓冲液/抗体稀释液（1×TBS，0.1%Tween-20，5%w/v脱脂奶粉）。

3.2仪器与设备：

转膜电泳仪及其附件，电泳仪、杂交仪，方形培养皿，凝胶成像系统。

3.3操作步骤：

3.3.1转膜

①将PVDF膜在甲醇溶液中浸泡5sec，使膜表面充分和甲醇接触（可观察到膜变为半透明）。

②准备转移缓冲液，依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，将凝胶和NC膜和滤纸放入转移缓冲液中平衡5min。

③装配转移三明治（海绵→3层滤纸→胶→膜→3层滤纸→海绵），在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜；将夹子打开使一面保持水平（规定为正极）。

在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。

在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

依次加膜、加胶，再在膜上盖3张滤纸并除去气泡。

④注入转移缓冲液，放入转印三明治，接通冷凝装置，于100V电泳45min（电流约为0.3A）。

⑤电泳结束，观察预染的蛋白质Marker是否转移到膜上。

3.3.2杂交

①用25mL洗涤缓冲液洗涤PVDF膜1次，5min。

②封闭PVDF膜：

加封闭缓冲液、脱脂奶粉（100ml封闭液+5g），37℃封闭3h。

用量以浸没整张膜为准。

③PVDF膜孵育一抗：

加入20mL抗体稀释液，将20μL一抗加入培养皿中（已完全覆盖膜为准），37℃孵育2h左右，（视实验时间，也可以4℃孵育过夜）

④用25mL洗涤缓冲液振荡洗涤硝酸纤维素膜3次,每次5min。

⑤PVDF膜孵育二抗：

加入20mL抗体稀释液，将10μL二抗加入培养皿中（以完全覆盖膜为准），37℃孵育1.5h。

⑥用30mL洗涤缓冲液振荡洗涤NC膜4次,每次5min。

⑦DAB显色（6mL）：

按每2mL蒸馏水加显色剂A，B，C各１滴，混匀后加至膜上。

室温显色1min。

若无背景出现则可继续显色。

显色后用蒸馏水洗涤以终止反应。

3.4注意事项：

①操作中戴手套，不要用手触膜。

②如检测小于20kDa的蛋白应用0.2μm的膜，并可省略转移时的平衡步骤。

③某些抗原和抗体可被Tween-20洗脱，此时可用1.0%BSA代替Tween-20。

④关于封闭剂的选择：

5%脱脂奶/TBSorPBS:

能和某些抗原相互作用，掩盖抗体结合能力；0.3~3%BSAinPBS：

低的内源性交叉反应性。

⑤如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。

五、实验结果

如图所示，两图中从右到左，分别表示诱导0h，2h，4h，6h，8h胶上与膜上出现的条带，可以明显看到随诱导时间增加，条带逐渐明显和增宽，0h没有出现条带，表明抗体-抗原作用随时间增加愈加明显。