药物敏感试验实验报告.docx

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药物敏感试验实验报告

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药物敏感试验实验报告

　　篇一：

药敏试验报告

　　药敏试验报告（琼脂稀释法）

　　一、实验目的

　　检测载铜离子土对沙门氏菌的最小抑菌浓度（mIc）二、实验原理

　　三、实验材料与试剂

　　材料：

平板，锥形瓶，10mLep管等；

　　试剂：

载铜离子土，沙门氏菌，琼脂平板计数培养基，mh肉汤培养基，硫酸（1%），氯钡（0.25%）。

四、实验方法

　　1配制琼脂平板计数培养基，按配方配制300mL，mh肉汤培养基100mL，待高压；2高压灭菌平板，锥形瓶，10mLep管等；

　　3沙门氏菌扩大培养:

10mlep管中加入4mlmh肉汤培养基，4ul菌液，放置摇床37℃，220rpm过夜培养；

　　4麦氏比浊管0.5的制备：

0.25%氯化钡0.1ml，1%硫酸4.9ml。

　　8

　　（即细菌的近似浓度为×10/ml）

　　5将扩大培养的沙门氏菌调制0.5麦氏比浊度后，再稀释100倍备用；

　　（每组做三个重复，16-24h后观察结果）五、实验结果

　　实验组1、2以及对照组平板中，肉眼可见针尖状半透明菌落，革兰氏染色后，镜下形态为红色短杆状，初步断定为沙门氏菌；实验组3、4、5未见菌落，涂片染色后，镜下也未观察到细菌。

六、结论

　　载铜离子土对沙门氏菌最小抑菌浓度（mIc）为3g/L。

　　篇二：

001-药物敏感试验

　　抗菌药物实验方法――药敏试验

　　由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，细菌的耐药性问题正变得越来越突出，不少耐药菌株可耐受多种抗生素。

由此而造成的危害十分严重，它不仅使抗菌药的疗效降低，疗程延长，死亡率升高和治疗费用增加。

这不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且耐药菌株可能会将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康也造成潜在威胁。

专家强调指出，临床上应合理应用抗菌药，以避免或减少耐药性的产生，而合理应用抗菌药控制畜禽疾病的一项重要内容就是通过药敏试验指导临床用药，以充分发挥抗菌药疗效，并尽可能减少其不良影响。

　　目前由各种细菌所引起的疾病给畜禽养殖业带来严重经济损失，阻碍了养殖业的快速发展和经济效益，所以使用抗菌药预防和治疗细菌性疾病成了畜禽养殖过程中的一项重要工作。

但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，细菌的耐药性问题正变得越来越突出，不少耐药菌株可耐受多种抗生素。

由此而造成的危害十分严重，它不仅使抗菌药的疗效降低，疗程延长，死亡率升高和治疗费用增加。

这不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且耐药菌株可能会将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康也造成潜在威胁。

因此，临床上应合理应用抗菌药，以避免或减少耐药性的产生，而合理应用抗菌药控制畜禽疾病的一项重要内容就是通过药敏试验指导临床用药，以充分发挥抗菌药疗效，并尽可能减少其不良影响。

　　一、什么是药敏试验？

　　抗菌药物敏感性试验（Antimicrobialsusceptibilitytest，AsT），简称药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。

药敏试验是兽医临床工作中的一项基本技能，也是使用抗菌药物治疗前必不可少的一道环节。

　　二、药敏试验的意义

　　1、可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，指导临床合理用药。

因为实验是在体外对已经分离的细菌进行药敏，不需要生物载体，不需要实验动物，操作相对简单，成本相对降低。

是一种既经济又有效的方法。

　　2、可以对流行病学调查进行监控，控制和预防耐药菌株的流行。

因为随着新型致病菌的不断出现，各种致病菌对不同的抗菌药的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药的敏感性也有差异。

进行有效的药敏试验可以及时掌握各种新型菌种和菌株的耐药性，对流行病学调查建立监控，同时采取相应的措施也就可以控制和预防耐药菌株的流行。

　　3、为临床用药提供参考依据。

因为一个正确的药敏试验结果，可作为临床兽医和畜禽养殖者选用有效抗菌药的参考。

长期以来，由于各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药药效下降或消失。

不能很好的掌握药物对细菌的敏感程度，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。

近十几年，在肉鸡生产中，为了控制大肠杆菌及某些细菌感染，一些抗菌药物的盲目使用，导致耐药菌株越来越多。

根据已进行的大量药敏试验结果，大肠杆菌、沙门氏菌对曾经敏感的氨基糖苷类、氟喹诺酮类等，均产生了不同程度的耐药性，经常发现对十几种常用抗菌药都不敏感的菌株。

这是一个非常危险的信号。

所以在临床疾病防治工作中，要取得较好的治疗效果，应扩大常规抗菌药种类进行药敏试验，根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意交替用药，按疗程投药，这样才能收到较好的治疗效果。

　　三、常用的药敏试验方法

　　兽医临床常用的药敏试验方法主要有两种，即扩散法和稀释法。

其中扩散法属手工测试方法，通过测试药物纸片或者牛津杯在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。

稀释法包括试管

　　稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（mIc）。

（一）纸片法

　　由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数实验室和基层单位所采用。

扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法，目前牛津杯法和打孔法在兽医临床已较少应用。

以下简单介绍纸片法。

1、药敏纸片的制作

　　纸片法中使用的药敏纸片目前市场上已有较多厂家的产品销售。

但也可根据需要自制，具体自制的方法如下：

　　取质量较好的定性滤纸，用普通的打孔器打成直径6mm的圆形小纸片。

取圆纸片50片放入清洁干燥的小瓶或小平皿中，以单层牛皮纸扎口或包扎。

经15磅15-20分钟高压灭菌后，置于37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。

按每张纸片饱和吸水量为0.01ml计，在上述含有50片纸片的小瓶内加入药液0.5ml，不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，一般浸泡30分钟即可。

同时在记录药物名称，于37℃温箱过夜。

在温箱或烘箱中的时间不宜过长，以免某些抗生素失效。

青霉素、金霉素宜在低温下真空干燥。

干燥后即密封。

切勿受潮，置阴暗干燥处或家用冰箱中保存，有效期4-6个月。

　　2、药液的制备

　　自制药敏纸片时还需自行配制抗菌药液。

抗菌药的稀释剂通常用蒸馏水。

一般可按商品药使用说明书上的配料或饮水浓度，按1g需加多少毫升水或配多少毫克饲料，就相当于配制药液所加蒸馏水的毫升数。

如10g药物可配50kg饲料，其换算方法为：

1g本品加5000ml蒸馏水。

此溶液液即为用于做药敏试验的药液。

　　3、试验操作方法

　　在超净工作台中或酒精灯旁，用无菌棉签或经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将菌液均匀涂布到平皿中的固体培养基表面。

然后用无菌镊子将纸片放于固体培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。

为了能准确观察结果，要求药敏纸片均匀分布于培养基上，位置安排适中，防止出现抑制圈重叠。

一般各纸片中心相距应大于24mm，可在平皿中央贴一片，外周等距离贴5－6片。

记住每种药敏纸片的名称。

贴完纸片的平皿15分钟后再置于37℃温箱中培养16－24小时，观察记录结果。

以药敏纸片周围没有肉眼可见生长物区域为抑菌圈，根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药的敏感性。

　　表1药敏试验结果判定标准

　　抑菌圈直径（毫米）敏感性

　　＞20XX-20

　　10-14＜100

　　极敏感高敏感中敏感低敏感不敏感

　　实践证明，利用自制药敏纸片进行药敏试验，可以灵活选药，与某病菌相关的药物均可随时制作药敏纸片用于治疗。

可在本场药品范围内或本地区容易买到的药品中选出最敏感的药物。

还可在短时间内选择最佳药品和最佳剂量，既能缩短病程，又能避免盲目用药，减少浪费。

　　4、影响药敏试验结果的因素

　　在以纸片法进行药敏试验时，以下几方面因素可影响试验的结果：

（1）培养基：

首先应根据试验菌的营养需要选择适宜的培养基。

培养基的成分的不同，不仅影响敏感菌株的生长繁殖并可影响到抑制圈的直径。

一般细菌，如大肠杆菌及葡萄球菌可使用普通营养琼脂；做磺胺类药物敏感试验时应选用无蛋白胨平板；链球菌和巴氏杆菌可用绵羊血琼脂平板。

其次，倾注平板时，厚度应合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。

培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（pAbA）能拮抗磺胺药和Tmp的活性。

（2）细菌接种量：

细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。

　　（3）药物浓度：

药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。

商品药应严格按照其推荐治疗量配制。

　　（4）培养时间：

一般细菌培养温度和时间为37℃12-24小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好药敏纸片的培养基先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较明显的抑菌圈。

　　5、纸片法药敏试验存在的问题

　　当前进行药敏试验仍然存在一些问题，主要包括以下几方面：

（1）方法学不统一，没有标准化。

（2）市场提供的药敏试验的培养基、药敏纸片等缺乏严格质控，质量难以保证。

所以还是建议按要求自制药敏纸片。

　　（3）因需要先进行细菌的分离培养，所以药敏试验报告出结果时间长，检验与临床缺乏沟通，对于基层兽医站或养殖场，药敏结果不能满足临床治疗要求，容易延误治疗时机。

但根据有关报道，也可进行简易的药敏试验，方法如下：

无菌取病死畜禽的部分肝、脾等组织，按1：

5加生理盐水研磨制成悬液，静置5分钟，用无菌吸管吸悬液，加两滴于营养琼脂板上，涂布均匀，5分钟后贴上药敏试纸，培养、观察抑菌圈大小。

　　（4）对于部分营养需求较高的细菌或微生物，如链球菌和支原体，临床上较难培养，限制了药敏试验的应用。

　　（5）部分养殖场或基层兽医站缺乏做细菌分离培养和药敏试验的意识。

绝大多数养殖者或技术人员是在没有明确微生物学诊断的情况下使用抗菌药物，养殖场规模越小，细菌培养和药敏试验做的越少，有的养殖场轮翻使用多种抗菌药物而不做细菌培养和药敏试验，致使疗效不佳，治疗时机延误和药品的浪费。

一些病例用药前不做药敏试验，而是在大量使用多种抗菌药物疗效不明显时才想起做细菌培养和药敏试验，而此时细菌已对多种抗菌药产生耐药性。

　　6、纸片法药敏试验中应注意的问题

　　药敏试验不仅是兽医工作中的一项基本技能，也是使用药物治疗前必不可少的一道环节，因此在实际操作过程中应注意以下几个问题，以保证试验结果的可靠性。

（1）病料采集：

采集病料最好是典型的病例，原则上采集的时间越早越好，特别是夏季，如果时间过长会发生质变，影响试验的结果，通常采集5份以上，使其具有代表性。

（2）划线接种：

在接种的过程中，所用剪刀或手术刀必须灭菌消毒，用酒精灯消毒时，在切口时注意不要过热，否则烫死细菌，划线涂布时—定要均匀。

　　（3）培养基的选择：

如前所述，培养基的成分的不同，不仅影响敏感菌株的生长繁殖并可影响到抑制圈的直径。

因此，操作过程中应注意培养基的选择，必要时可进行细菌分离培养。

　　（4）待试菌的涂布：

用灭菌铂金耳无菌操作进行待试菌涂布时，应涂布均匀，并注意不要划破培养基的表面。

　　（5）贴纸片：

贴纸片时位置一定要安排适中，防止出现抑制圈重叠。

　　（6）判定结果：

根据试验不同要求，并严格遵守细菌生化实验室观察结果的时间要求，多在24小时内判定，注意时间过长或过短都会影响到抑制圈的正常结果。

（二）稀释法及其他方法

　　1、肉汤稀释法

　　1.1常量肉汤稀释法

　　1.1.1.抗菌药物贮存液制备

　　抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml（如1280μg/ml）或10倍于最高测定浓度。

溶解度低的抗

　　菌药物可稍低于上述浓度。

抗菌药物直接购自厂商或相关机构。

配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。

　　1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围

　　根据抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。

1.1.3.培养基

　　推荐使用mueller-hinton（mh）肉汤，ph7.2~7.4。

需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。

在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（w/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的mh肉汤。

嗜血杆菌属菌使用hTm肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的mh肉汤。

　　营养琼脂平板制备：

牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml营养肉汤制备：

牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml

　　1.1.4.接种物的制备

　　以细菌生长方法配制接种物：

用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的mh肉汤中，37℃孵育2-6h。

对增菌后的对数生长期菌液进行平板菌落计数，一般约含10

　　8～9

　　cFu/ml。

用mh肉汤将上述

　　菌悬液进行1∶1000～10000稀释后备用。

并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。

　　取无菌试管（13×100mm）10～12支，排成一排，除第1管加入1.6mlmh肉汤外，其余每管加入mh肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml）0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。

此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。

然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105cFu/ml。

第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。

另设药物对照（药物＋营养肉汤）、培养基对照（营养肉汤）。

　　表2试管稀释法操作方法1

　　按每管需1.0ml，每排12管计算，一排需13ml（首管为2.0ml），如需重复4次，则共需42ml，计算损耗在内，应需50ml。

依次类推。

　　b、菌液制备

　　最终需将菌液稀释成浊度为105cFu/ml的应用菌液。

而菌原液浊度约为108cFu/ml，故共需稀释1000倍。

　　首先取菌原液（浊度约为108cFu/ml）0.2ml加至1.8mlmh肉汤中，混匀后取0.5ml加至49.5mlmh肉汤中，即为105cFu/ml的应用菌液50ml。

　　c、计算所需菌液总量

　　取无菌试管（13×100mm）10～12支，排成一排，除第1管加入1.8ml应用菌液外，其余每管加入应用菌液1ml（或0.9ml），在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml）0.2ml混匀，然后吸取1ml（或0.9ml）至第2管，混匀后再吸取1ml（或0.9ml）至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml（或0.9ml）弃去，第12管为不含药物的生长对照。

此时各管药物浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、

　　0.5、0.25、0.125μg/ml。

　　另设药物对照（药物＋营养肉汤）、培养基对照（营养肉汤）。

　　表3试管稀释法操作方法2

　　1.1.6.孵育

　　将接种好的稀释管塞好塞子，置37℃普通空气孵箱中孵育16~20h。

　　1.1.7.结果判断与解释

　　在读取和报告所测试菌株的mIc前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染。

以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的mIc。

　　1.2微量肉汤稀释法

　　1.2.1.抗菌药物和培养基制备同常量肉汤稀释法。

1.2.2.mIc板制备

　　无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，第12孔不加药作为生长对照，冰冻干燥后密封，-20（:

药物敏感试验实验报告）℃以下保存备用。

　　1.2.3.接种物制备

　　将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度为108～9cFu/ml菌悬液，经mh肉汤1∶1000～10000稀释后，向每孔中加100μl，密封后置37℃普通空气孵箱中，孵育16~20h判断结果。

此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。

　　1.2.4.结果判断

　　以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为mIc。

当阳性对照孔（即不含抗生素）内细菌明显生长试验才有意义。

当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。

如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。

通常对革兰阴性杆菌而言，微量肉汤稀释法测得的mIc与常量肉汤稀释法测得的结果相同或低一个稀释度（1孔或2倍）。

　　2、琼脂稀释法

　　琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量mh琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为mIc。

本法优点是可在一个平板上同时作多株菌mIc测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。

2.1.培养基制备

　　使用mh琼脂，按商品说明书进行配制，ph7.2~7.4。

　　2.2.含药琼脂平板制备

　　根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的mh琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。

通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。

配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天。

　　篇三：

药敏试验与报告解读

　　药敏试验与报告解读

　　一、药敏试验

　　1、概念:

测定抗感染药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为药物敏感性试验，简称药敏试验。

　　2、目的：

检测可能引起感染的细菌对一种或多种抗菌药的敏感性。

　　3、结果判断标准:

目前我国药敏试验判断标准参照cLsI标准文件，cLsI文件是我国的卫生部部颁文件。

　　二、mIc（minimalinhibitoryconcentration，最小抑菌浓度）

　　1、概念：

是指在体外试验中，抗菌药物能抑制培养基中细菌生长的最低药物浓度。

是抗菌药抗菌活性指标，显示出药物抑制病原微生物的能力。

　　2、cLsI文件中关于敏感、中介、耐药的定义

　　?

?

?

?

?

?

?

敏感：

最高血药浓度＞4倍mIc，使用常规剂量有效；

　　?

?

?

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?

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中介：

最高血药浓度≈mIc，加大剂量或药物浓缩部位有效；?

?

?

?

?

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?

耐药：

最高血药浓度＜mIc，无效。

　　三、抗生素的等效性与抗菌谱

　　1、抗生素的等效性：

是指用一种相关抗生素的试验结果预测同类抗生素体内抗菌活性。

如头孢噻吩与其他一代头孢具有等效性，可用头孢噻吩结果预测其他一代头孢。

此特性允许检测少数几种抗生素而不影响临床对其他抗生素广泛选择。

　　2、抗菌谱：

是指细菌在“野生菌”状态下能被抗生素在体内达到有效浓度时抑制的种类。

这些细菌称为对该抗生素的天然敏感菌。

未列在抗菌谱中的细菌则为天然耐药菌。

　　四、细菌的耐药性

　　1、细菌耐药性：

是细菌抵抗抗菌药物杀菌、抑菌作用的一种防御能力，一种生物学的表型。

　　2、天然耐药（固有耐药）：

耐药性为某种细菌固有的特点称细菌的天然或固有耐药性。

天然耐药非常稳定，据此就可预测某一细菌或可能存在的细菌对某种抗生素是否耐药。

　　3、获得性耐药：

由于细菌获得耐药基因，使原来敏感的细菌变为耐药称细菌的获得性耐药。

获得性耐药是目前临床面临的最主要的耐药问题。

由天然敏感菌基因突变或获得一段基因片段，使其基因型改变而产生耐药。

获得性耐药不断在变化（其变化频率与抗生素应用相关），不能预测，需要做药敏试验。