花粉生活力萌发试验.doc
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实验二花粉生活力的测定―――悬滴培养法
一、实验目的：
掌握了解花粉生活力测定的意义和方法。
二、实验材料：
二月兰花粉
三、实验仪器及药品：
凹玻片、盖玻片、解剖针、镊子、纱布、标签、铅笔、显微镜、恒温箱、蔗糖、蒸馏水、硼酸、凡士林。
四、实验原理：
花粉是植物自然授粉和人工杂交的主要物质基础，花粉生活力的大小是保证杂交成功的关键。
在有性杂交育种中，常因父母本花期的不同，作为父本的花粉必须经过贮藏直到母本植株开花时再用于授粉（花粉在低温0－2℃、干燥、黑暗等条件下代谢强度降低。
花粉贮藏的原理就是创造代谢强度低的环境，以延长花粉的寿命）；或者双亲不在同一个地方，必须由外地邮寄花粉供应。
经过贮藏或外地邮寄的花粉是否已经丧失生活力，必须经过测定才能确定。
鉴定花粉生活力的方法主要有四种：
一是将待测花粉直接授粉，然后统计结实率和结子数。
此法的缺点是需要的时间较长，且实验的结果易受气候条件的影响。
二是将待测花粉授到柱头上，隔一定时间切下柱头，在显微镜下检查花粉的萌发情况。
根据萌发率的高低来鉴定花粉的生活力。
三是在培养基上进行花粉的人工萌发，检查待测花粉萌发率的高低。
后两种方法都是根据花粉的萌发率来反映生活力的高低，有一定的参考价值。
但是萌发的不一定都能受精，特别是人工萌发还受许多条件的限制，所以也只有相对的可靠性。
四是用染色方法来鉴定花粉的生活力。
其原理是在活的花粉内有过氧化氢酶的存在，它可以促进过氧化物（如H2O2）放氧分解。
这些刚被放出的活性氧很容易使还原剂氧化，常用无色联苯胺、α－萘酚等还原剂做指示剂，这些还原剂被氧化后表现红色或玫瑰红色。
如果花粉是活的，那么会很快被染成红色或玫瑰红色，如果花粉是死的，则这一反应迟迟不能进行，花粉保持原色。
此法优点是比较快捷，但是比较间接。
本试验采用悬滴培养法鉴定花粉生活力。
五、实验步骤：
1.配培养液：
用蒸馏水和蔗糖分别配成5％、10%、15％的蔗糖溶液，并在各培养液中加少量硼酸。
2.取盛开的正在散粉的二月兰花朵。
3.播花粉：
在凹玻片的凹点滴一滴清水。
在盖玻片中央滴一滴培养液，用镊子轻轻夹取二月兰的花药，在培养液中央轻轻蘸一下，使花粉均匀的分散在培养液的球面上。
在盖玻片的四角涂抹少量的凡士林，用镊子夹住盖玻片在上提的过程中迅速把它翻转过来，小心放在凹玻片上，使培养液处在盖玻片和凹点形成的小密室中。
每个凹玻片分别做蔗糖溶液的三个浓度，并用蒸馏水做对照。
4.培养：
做好的凹玻片上贴好标签，注明花粉种类、培养液的浓度以及时间，然后小心放到铺有湿润滤纸的培养皿中，放到22－24℃的恒温箱中培养5h。
5.观察：
从恒温箱中取出凹玻片，在低倍镜下随机观察三个视野，计算花粉的萌发率。
以花粉管长度达到花粉粒径的2倍及以上视为萌发。
六、结果分析
1.分析花粉萌发率高或低的原因。
2.本实验关键性步骤总结及实验中所存在问题的讨论。
七、作业
1.绘制一幅花粉粒萌发形态图。
2.花粉生活力测定在杂交育种中的重要意义？
测定花粉生活力的方法有哪些？
一般2核花粉粒较3核花粉粒高，对不适宜环境
（温度、湿度、辐射化学处理）抵抗力强。
原因：
1、营养消耗2、代谢旺盛3、外壁薄等
花粉生活力的研究对于农业、林业来说，具有很重要的理论及生产实践意义。
它为植物的育种、培育、栽培，为进行人工授粉和杂交授粉，提供理论依据。
一般来讲，花粉生活力的长短，即决定于植物的遗传性，又受环境因素的影响。
一般情况下，花粉生活力的长短依种而异，大多数植物的花粉只能活几个小时、几天或几个星期。
一般来看：
木本植物>草本植物
2胞花粉>3胞花粉
影响花粉生活力的主要环境因素有：
温度、湿度及空气。
现在延长花粉生活力的措施主要有：
超低温（-192℃的液态空气，-196℃的液态氮）、真空、降低氧分压、快速冷冻干燥等方法贮存。
影响花粉粒生活的因素主要
一般低温（1—50c），低湿（相对湿度20/100--50/100）低氧。
正常情况，液态氮进行超低温保存，如：
水稻100C，85/100的湿度24小时；玉米50C90/100的湿度8—9天。
但禾本科要求高湿。
研究花粉储藏对解决花期不遇问题相当重要。
：
（１）植物盛花期采集发育良好的花粉；（２）将花粉干燥至适宜贮藏的含水量，封装在耐低温容器内；（３）经预冷处理或直接置于低温、超低温条件下贮藏；（４）根据需要，随时取出封存花粉的容器进行缓慢或快速升温解冻，使花粉复苏；（５）采用花粉染色法、萌发法、授粉结实法鉴定花粉生活力；（６）具有生活力的花粉用于育种。
实验十七 花粉活力的测定
在作物杂交育种、作物结实机理和花粉生理的研究中，常涉及花粉活力的鉴定。
掌握花粉活力快速测定的方法，是进行雄性不育株的选育、杂交技术的改良以及揭示内外因素对花粉育性和结实率影响的基础。
一、花粉萌发测定法
【原理】
正常的成熟花粉具有较强的活力，在适宜的培养条件下便能萌发和生长，在显微镜下可直接观察计算其萌发率，以确定其活力。
【器材与用具】
载玻片；显微镜；玻棒；恒温箱；培养皿；滤纸。
【试剂】
培养基（10％蔗糖，10Mg／L硼酸，05％的琼脂）：
称10g蔗糖、1Mg硼酸、05g琼脂与90Ml水放入烧杯中，在100℃水浴中溶化，冷却后加水至100Ml备用。
【方法】
1.将培养基熔化后，用玻棒蘸少许，涂布在载玻片上，放入垫有湿润试纸的培养皿中，保湿备用。
2.采集丝瓜、南瓜或其他葫芦科植物刚开放或将要开放的成熟花朵，将花粉洒落在涂有培养基的载玻片上，然后将载玻片放置于垫有湿滤纸的培养皿中，在25℃左右的恒温箱（或室温20℃条件下）中孵育，5～10Min后在显微镜下检查5个视野，统计其萌发率。
【注意事项】
1.不同种类植物的花粉萌发所需温度、蔗糖和硼酸浓度不同，应依植物种类而改变培养条件。
2.此法也可用于观察花粉管在培养基上的生长速度以及不同蔗糖浓度、离体时间、环境条件等因素对花粉活力的影响。
3.不是所有植物的花粉都能在此培养基上萌发，本法适用于易于萌发的葫芦科等植物花粉活力的测定。
二、碘—碘化钾染色测定法
【原理】
多数植物正常的成熟花粉粒呈球形，积累较多的淀粉，I2-KI溶液可将其染成蓝色。
发育不良的花粉常呈畸形，往往不含淀粉或积累淀粉较少，I2-KI溶液染色呈黄褐色。
因此，可用I2-KI溶液染色来测定花粉活力。
【器材与用具】
显微镜；载玻片与盖玻片；镊子；棕色试剂瓶；烧杯；量筒；天平。
【试剂】
I2-KI溶液：
取2gKI溶于5～10Ml蒸馏水中，加入1gI2，待完全溶解后，再加蒸馏水300Ml。
贮于棕色瓶中备用。
【方法】
采集水稻、小麦或玉米可育和不育植株的成熟花药，取一花药于载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子将花药捣碎，使花粉粒释放，再加1～2滴I2-KI溶液，盖上盖玻片，在显微镜下观察。
凡是被染成蓝色的为含有淀粉的活力较强的花粉粒，呈黄褐色的为发育不良的花粉粒。
观察2～3张片子，每片取5个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的育性。
【注意事项】
此法不能准确表示花粉的活力，也不适用于研究某一处理对花粉活力的影响。
因为三核期退化的花粉已有淀粉积累，遇碘呈蓝色反应。
另外，含有淀粉而被杀死的花粉粒遇I2-KI也呈蓝色。
三、氯化三苯基四氮唑（TTC）法
【原理】
具有活力的花粉呼吸作用较强，其产生的NADH2或NADPH2可将无色的TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）还原成红色的TTＦ（三苯基甲）而使其本身着色，无活力的花粉呼吸作用较弱，TTC的颜色变化不明显，故可根据花粉吸收TTC后的颜色变化判断花粉的生活力。
【器材与用具】
显微镜；载玻片与盖玻片；镊子；恒温箱；棕色试剂瓶；烧杯；量筒；天平。
【试剂】
05％TTC溶液：
称05gTTC放入烧杯中，加入少许95％酒精使其溶解，然后用蒸馏水稀释至100Ml。
溶液避光保存，若发红时，则不能再用。
【方法】
采集任何植物的花粉，取少许放在干洁的载玻片上，加1～2滴05％TTC溶液，搅匀后盖上盖玻片，置35℃恒温箱中，10～15Min后镜检，凡被染为红色的花粉活力强，淡红次之，无色者为没有活力或不育花粉。
观察2～3张片子，每片取5个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的活力百分率。
【思考题】
1.上述每一种方法是否适合于所有植物花粉活力的测定
2.哪一种方法更能准确反映花粉的活力
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