海南地方标准豆芽中4氯苯氧乙酸钠6苄基腺嘌呤24.docx
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海南地方标准豆芽中4氯苯氧乙酸钠6苄基腺嘌呤24
海南省地方标准《豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸残留量的测定液相色谱质谱联用法》
编制说明
（征求意见稿）
一、标准起草的基本情况（包括简要起草过程、主要起草单位等）
海南省地方标准《豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸残留量的测定液相色谱质谱联用法》（编号：
琼食安地标2014004号）被列入2014年海南省食品安全地方标准项目计划，由中国热带农业科学院分析测试中心承担该标准的起草工作。
按照工作方案要求，起草工作组先后查阅了豆芽的历史背景资料、相关的技术及标准。
期间分别对豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸残留量进行测定、验证和总结。
结合并参照相关食品安全标准完成初稿。
通过多次征求相关专家意见，在初稿的基础上修改完善标准稿件。
随后，标准工作组向质检部门、食药监、疾控中心等相关部门发出征求意见稿25份，收到20份回复，共收到76条回复意见，采纳及部分采纳共计73条，采纳率96.1%。
根据意见和建议，对标准初稿进行了修改和完善，完成了项目起草任务要求。
二、标准的主要技术内容及依据
标准工作组在参考相关标准的基础上，结合实际情况，本着标准趋向科学性、先进性及合理适用的原则进行了标准制定工作。
制定过程中坚持公开透明，广泛向社会公开征求意见和建议。
对收集来的意见进行逐一分析，吸取合理化建议反映、体现到标准中。
1标准编制的背景及意义
豆芽是人民群众喜爱的一种蔬菜，豆芽生产以传统的小作坊和家庭自产自销经营模式为主，为了提高产率，出现生产者在豆芽生产过程中添加4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸等的情况，市场上充斥着这种被称为“药水豆芽”的产品，引起消费者的严重不安，也使豆芽消费量逐年萎缩。
由于豆芽是黄豆和绿豆等一些豆类的衍生产物，在行业监管领域，既不属于食品范畴，也不属于蔬菜范畴，因此食品安全法和产品质量法都无法监管，也缺乏全国性的统一检测标准和处罚标准。
豆芽菜虽小，却是关系到普通百姓健康的大事，长期食用在生产过程中使用了4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸等化学原料的豆芽，对身体健康危害很大。
本标准的制定，可以填补海南省豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸残留检测地方标准的空白。
因而制定“豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸残留量的测定液相色谱质谱联用法”的标准具有非常的紧迫性和必要性。
本实验经乙腈作为提取溶剂前处理方法。
该方法灵敏度高，重复性好，完全满足豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸残留量的检测。
常规的双仪器分析方法包括基质分散固相萃取法、液-液萃取或固相萃取净化、浓缩后，用液相色谱/紫外（UV）和液相色谱/二极管阵列（DAD）检测。
但液相色谱，由于常规检测器如UV及DAD对双酰肼类农药残留的灵敏度较低，不能满足实际监测等工作需要。
液相色谱-质谱尤其是串联质谱结合了色谱、质谱两者的优点,将色谱的高分离性能和质谱的高鉴别特点相结合,组成了选择性强、灵敏度高的现代分析技术，并在残留检测领域得到越来越广泛的应用。
本标准在研发出用乙腈提取，液相色谱-质谱联用检测的方法标准。
1、通过试验研究确定了用液相色谱-质谱联用定性、定量测定4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸残留量技术条件，在豆芽中的定量限均为0.01mg/kg。
2、优化了提取、确定了操作简单、快捷的前处理方案，回收率试验表明，本标准确定检测方法标准满足4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸残留分析要求。
3、进行了针对不同基质的方法适应性试验，证实方法的适用性。
4、进行了实验室不同人员比对、不同实验室比对试验，确定了方法的重现性限和再现性限。
5、明确4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸的基质效应系数
6、豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸残留量的测定液相色谱质谱联用法，本标准涵盖参数多，操作简单，灵敏度高，满足4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸残留量事故的鉴定和残留研究的要求。
2标准的编写原则
本标准的编写制定过程中以提高测试方法的选择性、精密度、检测限、准确度和分析效率为总原则，反映科学技术的先进成果和先进经验。
在标准的制定过程中严格遵循国家有关方针、政策、法规和规章，标准的编写规则及表述按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：
标准的结构和编写规则的要求》、GB/T5009.1-2003《食品卫生检验方法理化部分总则》、GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：
化学分析方法》、GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：
总则与定义（GB/T6379.1-2004，ISO5725-1：
1994，IDT）、GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：
确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：
1994，IDT）、GB/T8855新鲜水果和蔬菜的取样方法（GB/T8855-2008，ISO874:
1980，IDT）的要求编写。
在标准制定过程中力求做到：
技术内容的叙述正确无误；文字表达准确、简明、易懂；标准的构成严谨合理；内容编排、层次划分等符合逻辑与规定。
3标准主要内容的确定
3.1试样的制备
称量样品约1kg，切碎后均一化制成匀浆、采用四分法进行装样。
3.2试样贮存
试样应放在清洁、结实的容器或包装袋内，可用聚乙烯瓶或袋。
试样应在规定的保质期内进行分析，必要时采用冷冻储存。
试样应有清晰牢固的标识标记，防止造成标记的遗失和混乱。
3.3赤霉素、4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、萘乙酸的性质
（1）赤霉素：
是广泛存在的一类植物激素。
其化学结构属于二萜类酸，由四环骨架衍生而得。
可刺激叶和芽的生长。
已知的赤霉素类至少有38种。
赤霉素应用于农业生产，在某些方面有较好效果。
例如提高无籽葡萄产量，打破马铃薯休眠；在酿造啤酒时，用GA3来促进制备麦芽糖用的大麦种子的萌发；当晚稻遇阴雨低温而抽穗迟缓时，用赤霉素处理能促进抽穗；或在杂交水稻制种中调节花期以使父母本花期相遇等。
（2）4-氯苯氧乙酸：
白色棱柱体针状结晶。
有清香气味。
对湿敏感。
溶于乙醇、丙酮和苯，微溶于水。
熔点155～156℃（157～158℃）。
低毒，半数致死量（大鼠，经口）850mg/kg。
有刺激性。
主要用作植物生长调节剂。
（3）6-苄基腺嘌呤：
中文别名为2-苄氨基嘌呤，N-苄基腺苷，丙烯酸正丁酯，白色或类白色晶体，难溶于水，微溶于乙醇，在酸、碱中稳定，属广谱性植物生长调节剂，可促进植物细胞生长，抑制植物叶绿素的降解，提高氨基酸的含量，延缓叶片衰老等。
（4）2，4-滴：
白色至黄色、晶体粉末、无臭、工业品略带酚气味。
具有代表性的合成植物生长素（auxin），是一种生长素类似物，简称2，4-D。
在普通的植物生长素定量法中显示有高的活性，但在采用植物生长素标准定量法的燕麦伸长试验中，其效颇低。
（5）萘乙酸：
白色结晶,无气味，易溶于热水、丙酮、乙醇、乙醚、苯、氯仿、乙酸和碱液，微溶于冷水。
萘乙酸系萘类具有生长素类活性的植物生长调节剂，由根、茎、叶吸收。
萘乙酸广泛用于农业、林业、蔬菜、花卉、果树等领域，诱发不定根形成，提高树木扦插成活率；提高座果率，防止采前落果。
表14-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸的相关性质
序号
中文名称
英文名称
分子式
分子量
CAS号
1
4-氯苯氧乙酸
4-Chlorophenoxyaceticacid
C8H7ClO3
186.59
122-88-3
2
6-苄基腺嘌呤
6-benzylaminopurine
C12H11N5
225.25
1214-39-7
3
赤霉素
Gibberellicacid
C19H22O6
348.39
77-06-5
4
2，4-滴
2,4-D
C8H6Cl2O3
221.04
94-75-7
5
萘乙酸
1-Naphthylaceticacid
C12H10O2
186.21
86-87-3
3.4液相色谱-质谱联使用条件的确定
3.4.1流动相的确定
由于电喷雾质谱的电离是在溶液状态电离，因此流动相的组成和配比不但影响目标化合物的色谱行为，还会影响到目标化合物的离子化效率，从而影响灵敏度。
对多种成分分析测定多采用梯度洗脱。
采用梯度洗脱的方法不仅可以降低基质中的杂质干扰，而且提高分离效果。
通过比较甲醇-超纯水、乙腈-超纯水、甲醇-1mmol/L乙酸铵和甲醇-1mmol/L乙酸铵水-0.1%甲酸水等不同的流动相，发现在流动相甲醇-1mmol/L乙酸铵水-0.1%甲酸水梯度洗脱时，响应最高，因此选用流动相为甲醇-1mmol/L乙酸铵水-0.1%甲酸水的洗脱方法2。
表2流动相及梯度洗脱条件
时间（min）
流速（mL/min）
A（甲醇）%
B（1mmol/L乙酸铵水-0.1%甲酸水）%
0.00
0.25
10
90
0.60
0.25
45
55
2.00
0.25
60
40
3.50
0.25
70
30
3.60
0.25
45
55
3.70
0.25
10
90
5.00
0.25
10
90
3.4.2质谱条件的确定
标准品调谐条件实验以甲醇-1mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液梯度为基准流动相，采用“T”三通方式，对4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸的质谱条件进行优化，采用负离子扫描模式，多反应监测色谱图见附录C。
基本参数如下：
a色谱柱：
C18柱，100mm×2.1mm×1.7μm；b流动相A为1mmol/L乙酸铵水-0.1%甲酸水溶液；B为甲醇；（梯度洗脱条件见表2）c柱温：
35℃；d进样体积：
5μL；e离子源类型：
ESI-；f扫描方式：
正、负离子扫描；g检测方式：
多反应监测；h毛细管电压：
2.8kv；i离子源温度:
110℃；j去溶剂气温度:
350℃；k去溶剂气流量:
900L/hr；l锥孔反吹气流量:
50L/hr；m碰撞气（He）流速:
0.21mL/min。
优化各个待测物的碰撞能量，选择响应值最高的两个碎片离子分别作为定量和定性离子，用于选择反应监测。
具体参数见表3。
表3监测离子对、碰撞气能量、去簇电压和保留时间
序号
中文名称
英文名称
ESI
保留时间
min
定量离子
M/Z
定性离子
M/Z
去簇电压
V
碰撞能量
V
1
4-氯苯氧乙酸
4-chlorphenoxyacetic
ESI-
2.52
185.0/127.1*
185.0/127.1*；187.0/129.0
20
15；15
2
6-苄基腺嘌呤
6-benzylaminopurine
ESI+
2.91
226.3/148.1*
226.3/148.1*；226.3/91.2
20
36；21
3
赤霉素
Gibberellicacid
ESI+
2.02
363.9/329.2*
363.9/329.2*；363.9/239.1
20
20；15
4
2，4-滴
2,4-D
ESI-
2.07
219.0/161.0*
219.0/161.0*；220.9/162.5
20；16
10；18
5
萘乙酸
1-Naphthylaceticacid
ESI-
2.72
185.0/141.1*
185.0/141.1*
10
10
注释：
带*为定量离子，4-氯苯氧乙酸钠以4-氯苯氧乙酸表示
3.4.3工作曲线的绘制
用空白样品基质溶液配成一系列浓度为10.00µg/L、20.00µg/L、50.00µg/L、100.0µg/L、200.0µg/L和500.0µg/L的4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸混合标准工作液，用于做标准曲线。
在浓度范围为10.00µg/L至500µg/L之间，响应值与进样量呈良好的线性关系，相关系数r>0.99，结果见表4（绿豆芽基质为例）
表4基质标样（绿豆芽）标样校准曲线
名称
参数
校准曲线
4-氯苯氧乙酸钠
y=ax+b
y=10.61x+23.68
r
0.9972
6-苄基腺嘌呤
y=ax+b
y=7.923x+8.132
r
0.9964
赤霉素
y=ax+b
y=2.113x+14.51
r
0.9952
2，4-滴
y=ax+b
y=11.61x+108.6
r
0.9955
萘乙酸
y=ax+b
y=0.7512x+1.297
r
0.9979
3.5样品前处理方法的确定
关于豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸残留量的测定液相色谱质谱联用法，该检测方法概述于下表5。
本标准在该检测的基础上进行了条件试验，包括提取试剂的确定，同时对不同基质的样品进行了回收率试验，并最终确定了前处理方案。
表5豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸残留量的测定液相色谱质谱联用法概要
豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸残留量的测定液相色谱质谱联用法
备注
种类
5种
/
仪器
液相色谱-串联质谱
/
提取液
0.1%甲酸-乙腈
/
定量限
10.00µg/kg
/
3.5.1提取试剂的确定
分别采用0.1%甲酸-乙腈、、甲醇、丙酮作提取剂时，发现甲醇和丙酮和水层不易分离，且丙酮较易挥发，而乙腈通过盐析法可以较好的将有机相和水相分层，因此我们选用0.1%甲酸-乙腈作为提取剂，以绿豆芽为空白基质，添加浓度为20.00µg/kg为例，回收率（83.5%-97.1%）完全满足实验要求。
表60.1%甲酸-乙腈提取的回收率（n=5）（绿豆芽）
农药名称
20.00µg/kg
回收率（%）
RSD（%）
4-氯苯氧乙酸钠
93.9
4.2
6-苄基腺嘌呤
93.7
4.1
赤霉素
85.4
4.2
2，4-滴
93.1
3.2
萘乙酸
83.5
3.1
3.5.2前处理方法的确定
称取试样10g（精确至0.01g）于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入10.0mL提取液后，超声10min，滤液收集到装有1g～3g氯化钠的50mL另外一支聚四氟乙烯离心管中，剧烈震荡2min，在室温下静置30min，使乙腈相和水相分层。
取1mL上清液高速（10000rpm/min）离心10min，过0.22μm滤膜，待测。
3.5.3基质效应的分析
配制一系列溶剂标样，浓度分别为10.00µg/L、20.00µg/L、50.00µg/L、100.0µg/L、200.0µg/L、500.0µg/L。
称取空白样品（以绿豆芽基质为例说明），按照4.4.4所述步骤操作，在空白提取液中添加混合标样，使5种成分混合标样浓度分别为10.00µg/L、20.00µg/L、50.00µg/L、100.0µg/L、200.0µg/L和500.0µg/L；分别以标样浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归。
溶剂标样和基质标样在在10.00～500.0µg/L范围内线性良好，相关系数r均大于0.99。
基质与溶剂标准曲线斜率的比值（ratio）可反应基质效应的强弱。
5种成分的斜率比值为0.608～1.23（数据见表8），其中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤和赤霉素基质抑制效应较强；2，4-滴和萘乙酸，基质增强效应较强，因此根据基质标样计算豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素、萘乙酸残留量。
表7溶剂标样校准曲线和基质标样（绿豆芽）校准曲线及其斜率比值
名称
参数
溶剂标样校准曲线
基质标校准曲线
4-氯苯氧乙酸钠
y=ax+b
y=13.47x+62.48
y=10.61x+23.68
r
0.9985
0.9972
ratio
0.788
6-苄基腺嘌呤
y=ax+b
y=13.04x+3.810
y=7.923x+8.132
r
0.9992
0.9964
ratio
0.608
赤霉素
y=ax+b
y=2.195x+6.216
y=2.113x+14.51
r
0.9978
0.9952
ratio
0.963
2，4-滴
y=ax+b
y=9.445x+82.81
y=11.61x+108.6
r
0.9959
0.9955
ratio
1.23
萘乙酸
y=ax+b
y=0.7387x+0.6288
y=0.7512x+1.297
r
0.9976
0.9979
ratio
1.02
3.5.4定性测定
在相同条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰保留时间与标准品相一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离子丰度比与标准样品的离子丰度比相一致（相对丰度﹥50%，允许±20%偏差；相对丰度﹥20%～50%，允许±25%偏差；相对丰度﹥10%～20%，允许±30%偏差；相对丰度≤10%，允许±50%偏差），则可判断样品中存在这种农药。
3.5.5定量测定
采用外标法-标准曲线法定量测定，为减少基质对定量测定的影响，定量应采用基质混合标准溶液绘制标准曲线，并且保证所测样品中农药的相应值均在仪器的线性范围内。
3.5.6平行试验
按以上步骤对同一试样进行平行试验。
3.5.7空白试验
除不称取试样外，均按上述步骤进行。
3.6准确度
根据GB/T5009.1-2003，准确度为测定平均值与真值的相符程度。
准确度的测定：
将某一稳定样品中加入不同水平已知量的标准物质（将标准物质的量作为真值），称为加标样品，同时测定样品和加标样品，加标样品扣除样品空白值后与真值的误差即为该方法的准确度。
按4.4.3所述的前处理步骤，选取经检测为空白的植物源性样品，进行添加浓度分别为10.00、20.00和100.0µg/kg的回收实验，每档浓度进行5个平行的操作。
具体数据见表9-表11。
表8不同添加浓度的回收率（n=5）（绿豆芽基质）
名称
10.00µg/kg
20.00µg/kg
100.0µg/kg
回收率（%）
RSD（%）
回收率（%）
RSD（%）
回收率（%）
RSD（%）
4-氯苯氧乙酸钠
83.4
4.6
93.9
4.2
85.1
1.1
6-苄基腺嘌呤
93.5
3.3
93.7
4.1
94.3
4.4
赤霉素
82.4
2.0
85.4
4.2
82.6
3.4
2，4-滴
86.1
5.1
93.1
3.2
94.3
3.9
萘乙酸
83.3
3.4
83.5
3.1
82.3
3.9
表9不同添加浓度的回收率（n=5）（黄豆芽基质）
名称
10.00µg/kg
20.00µg/kg
100.0µg/kg
回收率（%）
RSD（%）
回收率（%）
RSD（%）
回收率（%）
RSD（%）
4-氯苯氧乙酸钠
83.0
4.3
90.4
5.6
84.2
4.6
6-苄基腺嘌呤
92.5
3.2
90.2
6.5
95.8
4.3
赤霉素
81.4
2.8
87.3
5.5
82.9
6.4
2，4-滴
85.1
4.1
90.2
5.6
94.6
3.4
萘乙酸
82.7
3.6
84.7
4.2
85.2
4.1
表10不同添加浓度的回收率（n=5）（黑豆芽基质）
名称
10.00µg/kg
20.00µg/kg
100.0µg/kg
回收率（%）
RSD（%）
回收率（%）
RSD（%）
回收率（%）
RSD（%）
4-氯苯氧乙酸钠
81.5
4.8
84.9
6.0
85.0
4.2
6-苄基腺嘌呤
92.6
3.7
93.7
4.1
93.5
5.0
赤霉素
82.7
4.4
84.6
6.1
82.9
2.5
2，4-滴
89.7
3.2
93.5
3.5
91.1
6.1
萘乙酸
82.3
5.6
83.1
8.0
83.4
5.9
3.7定量限（LOQ）
定量限是指可以进行准确定性和定量测定的最低水平，在该水平下得到的准确度应满足表12的要求。
添加标准溶液质量浓度得到的信噪比一般为10。
表11不同添加水平对回收率的要求
添加水平mg/kg
范围%
相对标准偏差%
≤0.001
50~120
≤35
＞0.001≤0.01
60~120
≤30
＞0.01≤0.1
70~120
≤20
＞0.1≤1
70~110
≤15
＞1
70~110
≤10
根据3倍信噪比（S/N）计算豆芽中5种农药的检出限（LOD）为0.9～3.0µg/kg，根据10倍信噪比确定的定量限（LOQ）均为0.9～3.0µg/kg，为配合实际样品和定量准确，本试验从添加水平3.0µg/kg一直添加到10.00µg/kg，通过添加回收率试验和准确定量的要求，发现在添加浓度在10.00µg/kg，回收率和准确度才符合定量限的要求，因此，5种农药的定量限在植物源食品中的定量限均为10.00µg/kg，详见表13。
表125种农药的定量限
序号
名称
定量限（LOQ）µg/kg
1
4-氯苯氧乙酸钠
10.00
2
6-苄基腺嘌呤
10.00
3
赤霉素
10.00
4
2，4-滴
10.00
5
萘乙酸
10.00
3.8方法重现性和再现性
为考察不同检测人员对方法的重复性，本实验室3位检测人员分别进行添加回收实验，添加浓度为20.00µg/kg。
检测结果如表13所示：
表13实验室不同检测人员的检测结果（绿豆芽，添加浓度为20.00µg/kg）
名称
A（n=3）
B（n=3）
C（n=3）
平均值
µg/kg
标准偏差µg/kg
相对标准偏差%
平均值
µg/kg
标准偏差
µg/kg
相对标准偏差%
平均值
µg/kg
标准偏差µg/kg
相对标准偏差%
4-氯苯氧乙酸钠
18.1
1.1
5.9
17.8
0.9
4.9
17.5
1.1
6.0
6-苄基腺嘌呤
18.8
0.3
1.6
18.6
0.3
1.7
19.1
1.0
5.5
赤霉素
17.2
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