中药连翘精油包合物制备工艺优化研究.docx

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中药连翘精油包合物制备工艺优化研究

1.绪论

1.1课题背景

1.1.1连翘

连翘Forsythiasuspensa，系木犀科植物的干燥未成熟果实。

别名:

落翘（山东）、空壳（河南），黄链条花（河北）．黄花条（陕西），黄花瓣（山西）。

灌木，高2—3m。

茎丛生，枝条细长、开展或下垂．着地生根。

小枝稍呈四棱形，节间中空，仅在节部具有实髓，表面浅棕色，皮孔明显。

单叶对生，或偶有三出小叶．叶片卵形、宽卵形或椭圆状卵形．长2cm，宽1.3cm，无毛，先端锐尖或钝，基部圆形或宽楔形，边缘有不整齐的锯齿。

花先叶开放，1至数朵，腋生。

花萼基部台生成管状，上部4深裂，花冠黄色，直径约3cm，裂片4，卵圆形。

花冠管内有橘红色的条纹12，雄蕊2．着生于花冠基部；花部细长，柱头2裂。

种子多数，棕色，扁平，—侧有薄翅，歪斜。

花期3—5月，果期7—8月。

（图1）

图1连翘

多生于山野阳坡，现多有栽培。

分布于辽宁、河北、河南、山西、山东、江苏、湖北、陕两、曾肃、云南等省。

8月下旬-9月上旬，采收末成熟的青绿果实，用沸水煮片刻或蒸熟，晒干为“青翘”。

若9月下旬-10月上旬，果实成熟发黄而裂开后，采收晒干为“黄翘”或“老翘”。

连翘FructusForsythiae生产于山西晋城、陵川、阳城、恒曲、安泽、武乡、沁县；河南灵宝、伊阳、沁阳、辉县、篙县；陕西宜川、宜君、黄龙、黄陵、商县、洛南、山阳、丹风；山东淄博、莱芜等地。

以山西、河南产量最大。

老翘为一般商品，行销全国或出口。

连翘主销四川、浙江、上海、北京、天津等地。

具有清热解毒，消肿散结之攻效；主治痈疽，瘰疠，乳痈，丹毒，风热感冒，温病初起，温热入营，高热烦渴，神昏发热，热淋尿闭。

连翘果实中含木脂素类、黄酮类、挥发性成分、苯乙烷类、乙基环己烷类、三萜类及香豆素类等化合物，前三类是连翘中具有较强抗菌和抗病毒作用的活性成分。

挥发性成分主要存在于连翘心（种子）中。

果皮和种子中挥发油含量分别为0.32％-0.37％（ml/g）和3.3％-4.0％（ml/g），主要成分α-蒎烯（α-Pinene）、莰烯（Camphene）、β-蒎烯（β-Pinene）、对聚伞花烯（p—Cymene）、柠檬烯（Limonene）、γ-松油烯（γ-Terpinene）、β-水芹烯（β-Phellandrene）、香叶烯（Myrcene）、β-罗勒烯（β-Ocimene）、樟脑（Camphor）、香叶醛（Gerania）、龙脑（Borneol）、α-萜品醇（α-Terpineol）、黄樟醚（Snfrole）、芳樟醇（Linalool）、松油烯醇-4（Terpinen-4-ol）、去甲拉帕醇（Norlapachol）、和1，3-环庚二烯（1，3—Cycloheptadiene）。

应用GC-MS-DS及GC分离鉴定了连翘果皮和种子挥发油的化学成分，并用归一法计算其相对含量，结果见表1。

表1连翘果皮和种子挥发油的化学成分和相对含量（％）

用GC-MS联用法测定连翘果实挥发油中56种成分的相对百分含量，结果见表2。

表2连翘挥发油成分相对含量（％）

1.1.2β-环糊精

1903年，Schardinger成功分离出了2个晶体产品，糊精A和糊精B，这种描述是被看作他们缺乏减少能量的能力。

由淀粉细菌株产生的这些东西很可惜没有保留下来。

1904年，Schardinger提炼出了一种新的能从糖类和其他含淀粉植物原料中产生丙酮和酒精的有机体。

1911年，他形容，这株称为芽孢杆菌，同样能从淀粉中产生大量的结晶糊精（25％-30％）。

Schardinger将他的结晶产品分别取名为“结晶糊精α”和“结晶糊精β”。

这种说法一直持续到1935年“结晶糊精γ”被发现。

几种生产环糊精的分馏法同样也产生了。

那时这些化合物的结构还未确定，但在1942年α，β环糊精的结构由x光结晶学确定了。

1948年，γ-环糊精的x光结构也被确定，而且被认为能形成环糊精的包含物。

1961年，δ-，ε-，ζ-甚至η-环糊精的自然存在被证明。

对环糊精的最大兴趣在于它们所具有的和其他复合物形成包含物的能力。

有x光结构可以看出在环糊精中次羟基族（C2和C3）在环的较宽的边缘，主要羟基族（C6）在另外一边，非极的C3,C5氢和醚状氧在花托状分子里面。

这导致有一个能溶解于水的亲水外部和能提供一个不易被水沾湿的非级壳的分子，被描述成“微异质环境”。

由于有这种洞状结构，环糊精可以和各种各样的疏水分子形成包含物。

一或两个客分子能被1，2或3个环糊精诱陷。

除了这些自然生成的环糊精之外，又合成了很多环糊精衍生物。

这些衍生物通常是由氨化、酯化作用或是由环糊精的主要和次要的羟基族酯化作用生成的。

由于替代品的不同，这些环糊精衍生物的溶解性通常和它们的母环糊精不同。

事实上所有的衍生物都有一个变化了的疏水空腔体积，而且这些变化能增强溶解性，对光和氧的稳定性，以及控制客分子的化学活性。

然而在所有环糊精中，β-环糊精（β-CDs）是近年来备受关注的新型药物包合材料，也是目前用的最多的。

这主要是由于β-CDs具有特殊的分子结构，即呈闭合筒状结构，外部是亲水性的表面，内部则是一个具有一定尺寸的手性疏水管腔，能包合一定大小的药物分子，形成一种特殊的包合物，从而改变药物的特性。

所以我们有必要重点了解它的一些理化性质:

如β-环糊精的红外吸收图像（图2），β-环糊精的C谱和H谱（图3）等。

图2

-环糊精的红外吸收图

图3

-环糊精的C谱和H谱

1.2连翘挥发油β-环糊精包合物的研究进展

1.2.1环糊精包合的研究进展

1.2.1.1影响环糊精包合物稳定性的因素

（1）主客体分子尺寸的匹配

作为主体的环糊精（CD）与客体分子形式包合物的一个基本要求是尺寸的匹配，即对体积的选择性。

环糊精的空腔由于边缘羟基间的氢键网络作用而具有一定的刚性，因此，客体分子与空腔的尺寸匹配在决定主客体间所形成的包合物的稳定性中起重要作用。

α-，β-,γ-环糊精的空腔容积分别为0.174nm3、0.26nm3和0.472nm3，这样，大尺寸的客体分子将无法进入环糊精的内腔，而尺寸过小的客体分子则不能与环糊精产生强的疏水相互作用和范德华力，从而也不易形成稳定包合物。

只有客体分子大小与环糊精空腔内径相匹配时，此时两者之间的距离较小，范德华力和疏水作用较强，形成的包合物才比较稳定。

（2）客体分子的几何形状

客体分子的立体效应对包结作用有很大影响，范德华力相互作用不仅依赖于客体分子的尺寸，同样与其几何形状有很大的关系。

客体分子不能完全进入环糊精空腔时，此时空间阻碍作用决定了包合物的稳定性。

其中比较典型的例子就是2-萘磺酸负离子比1-萘磺酸负离子、对位芳香客体比邻位芳香客体与β-CD能形成更稳定的包合物。

（3）极性，电荷

环糊精的包合物形成的程度也依赖于客体分子的极性。

即客体分子的疏水性一般来说，强亲水性、强水合性使得离子化客体化合物与环糊精形成包结物的能力很弱，只有极性比水小的客体分子才能与环糊精包结。

因为环糊精分子的空腔为疏水的，客体分子在环糊精空腔中所处的位置总是有利于疏水基团与疏水空腔有最大的接触，而客体的亲水基团尽量远离环糊精疏水空腔。

这条规律在很多例子中都得到了证明。

（4）介质

原则上，包合物的形成不需要溶剂。

对于易升华的物质，可将粉状晶体环糊精与粉状客体混合，制备环糊精的包结物。

但是对于不易升华的物质就需要水或其他物质作溶剂。

大多数关于环糊精的包结配位作用的研究通常是在水溶液中进行的，然而也有一些报道在有机溶剂-水混和体系或纯有机溶剂。

目前，已经有很多实验结果表明溶剂可以影响环糊精对客体分子的包结配位能力，在某些情况下还可以改变主客体间的包结配位模式。

在环糊精超分子体系中，随着溶剂极性的降低，常常可以观察到主-客体间所形成配合物的稳定性也随之下降。

主一客体配合物的稳定性还受到溶剂

pH值的影响。

（5）氢键与释放出高能水

有些客体分子与环糊精的羟基可形成氢键，增加包结物的稳定性。

由于环糊精空腔的疏水性，使主、客体之间非极隆非极性结合在热力学上有较大的稳定性，这种相互作用必然使客体的疏水端进入环糊精的腔，取代环糊精腔内的高能水，以降低其内腔与水分子的非极隆极性相互作用的能量。

1.2.1.2环糊精的包合作用

（1）环糊精对有机物的包合作用

根据客体分子溶解性的差异，可以采取不同的方法制备环糊精包合物。

例如以水或水与某种有机溶剂构成的混和溶液为介质，通过将环糊精与有机客体直接作用，可以制备以2，2-联吡啶、安息香和对羟基联苯等有机分子为客体的环糊精包含物（图4）。

图4环糊精的结构及其包合物的形成

（2）环糊精对各类无机物的包合作用

环糊精与各类无机物，如水、无机离子、卤素和卤化氢、无机酸、稀有气体或其它无机气体等均可形成包合物。

（3）环糊精对卤素的包合

卤素-环糊精包合物在1924年首次得到研究，Crammer指出，α-CD可与Cl2，Br2和I2包合，β-CD可与Br2和I2包合，而γ-CD只与I2包合，卤素环糊精包合物中研究得最多的是碘与环糊精的包合物。

当α-CD从含碘水溶液中结晶出来时，单个碘分子包含在笼状晶体结构中。

若在水溶液中加入金属碘化物，可得到管道型结构，多碘离子贯穿在孔道中。

（4）环糊精对各种气体包括稀有气体的包合

Crammer和Henglein在他们早期工作中描述了α-CD与气体形成的包合物。

只有二氧化碳在包合物中的物质的量比可以达到或超过1:

l，氯、氪和氧的物质的量比小于1:

1。

所有这些气体的包合物均可稳定储存。

（5）环糊精与过渡金属配合物的包合作用

发现环糊精作为主体对过渡金属配合物产生识别作用的是Breslow，1975年他报道了二茂铁及其衍生物与β-CD可形成1:

1型包合物，二茂铁插入环糊精内腔。

不久Harada进一步考察了二茂铁在α-CD、β-CD、γ-CD腔内的取向，并制备了二茂铁及其衍生物的环糊精包合物，发现α-CD与之形成2:

1型包合物，茂基平面几近与环糊精的C6轴垂直，β-CD，γ-CD与客体形成1:

1型包合物，前者茂基平面差不多与β-CD的C7轴垂直，而后者的茂基平面几乎与γ-CD的C8轴平行。

这表明3种环糊精的二茂铁包合物具有不同的空间构型。

对环糊精与一苯基三碳基合铬、β-CD与毗咯及其衍生物的三碳基合锰配合物的包合反应研究显示，苯环或吡咯上取代基数目的多少直接影响包合反应产率，基至决定反应能否进行。

由此说明进入环糊精空腔中的基团与环糊精结构的匹配是决定第二配位层化合物能否稳定存在的重要因素。

1.2.1.3环糊精包结方法

1.2.1.3.1饱和水溶液法

先将环糊精配成饱和水溶液，再加人客体（比例为1:

1），混和30min，即形成包接配合物并分离出来，然后低温干燥即得产品。

当客体分子不溶于水时，若其中有些包接物仍溶于溶液中，此时可加人有机溶剂，使其沉淀析出。

一般当客体分子不溶于水时，可先加人丙酮、异丙醇、甘油等小分子亲水性高的有机溶剂溶解后，再混人到主体的饱和溶液中即可。

但重复操作，并不能提高环糊精对客体的包接量。

1.2.1.3.2研磨法

将环糊精用l～5倍的水研匀，加入客体后，充分研磨至糊状，低温干燥后，即成为环糊精的客体包接物。

1.2.1.3.3喷雾干燥法

将环糊精制成5％～40％的溶液，加入占环糊精量5％～50％的客体化合物，用均质机均质（10000～200000r／min，5—50min），喷雾干燥（送风温度130～

l90℃，排风温度60～90℃），即得粉末状包合物。

1.2.1.4环糊精的应用

1.2.1.4.1环糊精在食品工业中的应用

环糊精分子很容易以其内部空隙而与有机分子结合，生成复合物，减少了与周围环境的接触，从而被包结的物质对光、热及氧化更加稳定，不易挥发、蒸发和升华，其他物理化学性质也会改变（如溶解度、颜色、香、味及水中分散性等）。

利用该特性，环糊精在食品工业作为食品添加剂发展很快，应用面广；如有效成分的包囊，异味或有害成分的脱除，提高食品与改善食品的组织结构，保持与改善风味等。

该3种环糊精中β-环糊精的性能最好，应用面最广。

1.2.1.4.2环糊精在医药中的应用

（1）为有利于调配和服用而改善药物的某些性质

①增加药物的溶解速度。

药物与环糊精形成包含物后，利用环糊精分子上的羟基亲水性而增加药物溶解度和溶解速度。

②减少药物的不良气味或苦味。

药物被包合在环糊精分子囊内后，会大大掩盖其不愉快臭气和苦味。

③减小药物的刺激性等。

（2）增加药物的稳定性

增加药物的稳定性主要是使药物被环糊精包合而受保护，使药物免受光，氧、热以及易水解的条件的影响，延长药效和保存期，如前列腺素经γ-CD包合后，其脱水生成前列腺素（PCA）的速度缓慢，增加了聚乙二醇（PGE）的稳定性。

（3）降低药物的毒副作用

降低药物毒副作用的研究，以非幽体抗炎药为多，主要是减轻由于这些药物对胃粘膜的刺激而引起的胃溃疡，如氯丙嗪β-CD包合物使氯丙嗪溶血反应减低，而对它的中枢作用无影响。

降低毒副作用在中药方面亦在研究，巴豆属峻下逐水药，有大毒。

为降低毒性，缓和泻下作用，传统上将巴豆除去大部分巴豆后制成巴豆霜人药，然而，巴豆中的泻下有效成分为巴豆油，巴豆油存在毒性大、刺激性强、均匀性差、含油量不宜控制、含油量测定复杂，流动性差等缺点，将巴豆油制成β-CD包合物后，巴豆油分散均匀，质量稳定、剂量准确，刺激性小临床验证表明包合物用药易于掌握，疗效满意。

（4）增加药物的生物利用度

增加药物的生物利用度可能与药物形成包合物后，在水中的溶解速度和溶解度增加，从而增强膜对药物的渗透性有关。

齐墩果酸片临床已用于治疗急慢性肝炎，但因齐墩果酸的强疏水性，使其片剂的生物利用度低，将齐墩果酸制成β-CD包合物后再压制成片剂，比较包合与否的齐墩果酸的溶解度及其片剂的溶出速率，实验表明:

β-CD包合可以使齐墩果酸溶解度提高12倍，累积溶出速率增大6倍，大大地提高了齐墩果酸片的生物利用度。

但是，不是所有药物均适合于形成包合物，其中一些药物不能被包合，或者包合后没有突出的优点，也有的药物在包合物中含量过低，在普通给药1～2片／次时达不到要求剂量。

大多数无机化合物均不适宜或不能形成包合物，虽然有些例外，例如Cu+2、Ag+能与环糊精形成氢氧化物包合物。

1.2.2连翘挥发油β-环糊精包合物的稳定性

1.2.2.1强光照射实验

分别称取连翘油β-CD包合物和按制备投料比例混匀所得的连翘油与β-CD的混合物（以下简称混合物）各若干份，均照射10d（强度为4000Lx），于第0，5，10天时取样，测定挥发油相对含量，结果见表3。

实验结果表明，包合物抗光解性优于混合物。

表3抗光解实验结果（％）

1.2.2.2高温实验

分别称取包合物和混合物各若干份，密封于玻璃瓶中，分别于40℃，60℃，80℃恒温干燥箱内放置10天，于第0，5，10天时取样，测定挥发油相对含量，结果见表4。

实验结果表明，包合物的热稳定性优于混合物。

表4热稳定性实验结果（％）

1.2.2.3高湿实验

分别称取包合物和混合物适量，于25℃置入相对湿度分别为75％（NaCl）和92.5％（KNO3）的两个密闭器皿中，放置10天，第0，5，10天时取样，测定挥发油相对含量，结果见表5。

实验结果表明，在高湿条件下，包合物较混合物稳定。

表4湿稳定性实验结果（％）

稳定性实验表明，包合物的抗光解性、热稳定性和湿稳定性明显高于混合物。

可见连翘油β-CD包合物可有效地防止连翘油的挥发，提高其稳定性。

1.2.3课题主要研究任务

本课题主要对连翘挥发油β-CD包合物制备的工艺优化,可以提高挥发油的利用率和包合物的收得率.主要内容包括:

1）连翘精油β-环糊精包合物制备工艺正交优化；

2）连翘精油β-环糊精包合物稳定性考察。

2.实验部分

2.1仪器与试剂

2.1.1仪器:

电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；79－1磁力搅拌器（江苏金坛市恒丰仪器厂）；JB90-D型强力电动磁力搅拌机（上海标本模型厂制造）；研钵、挥发油测定装置（上海玻璃厂）。

2.1.2试剂:

连翘精油（实验室自制）；β-环糊精（北京奥博星生物技术责任有限公司）；乙醇（95%）；蒸馏水。

2.1.3药材:

连翘（Forsythiasuspensa，为重庆工学院傅善权副研究员鉴定系木犀科连翘属植物的干燥未成熟果实）。

2.2方法与结果

2.2.1连翘挥发油的提取

　　将连翘原材料2kg,加8倍量水，浸泡1h，按中国药典2005年版一部附录挥发油发进行提取，油水分离后得连翘挥发油，为淡黄色油状液体，密封，冷藏保存，备用。

2.2.2包合物制备

2.2.2.1饱和水溶液法

称取适量的β-环糊精置适宜的烧杯中，加入蒸馏水（β-CD:

水=1:

12.5），在水浴加热溶解，于磁力加热搅拌器上恒温搅拌，速度200r／min，缓缓滴加挥发油乙醇溶液（50%），β-CD与挥发油的投料量配比为4:

1，40℃恒温搅拌60min，置冰箱中冷藏24h，抽滤后得白色包合物，于50℃干燥，即得。

2.2.2.2研磨法

称取β-CD适量置研钵中，加入蒸馏水（β-CD:

水=3:

5），研磨均匀，缓缓滴加挥发油乙醇溶液（50％），β-CD与挥发油的投料量配比为3:

1，研磨60min，置冰箱中冷藏24h，包合物处理方法同2.2.2.1项下.

2.2.3脱包

将制得的包合物的5/1置500ml圆底烧瓶中加蒸馏水250ml，加热3h至挥发油不再增加.

2.2.4数据处理分析

收得率、含油率和利用率的计算公式如下:

根据数据可得连翘挥发油β-环糊精包合物的制备以饱和水溶液法包合挥发油为优，且其适用于工业化生产。

数据结果见表5.

表5不同制备方法的数据结果（％）

制备方法

收得率（%）

利用率（%）

含油率（%）

饱和水溶液法

80.25

40

8.82

研磨法

74.93

29.9

8.65

2.2.5挥发油包结的正交设计

由实验数据结果,采用饱和水溶液法进行以下实验.为了寻找连翘挥发油β-CD最佳包合工艺条件，选择挥发油β-环糊精投料比、β-CD与水的投料比、包合温度、搅拌时间4个主要因索，以挥发油收得率、利用率和含有率为指标，进行了L9（34）正交试验，因素水平见表6。

按照设计，共进行了9组试验。

表6因素水平表

水平

因素

A

B

C

D

油:

β-CD/ml:

g

温度/℃

时间/min

β-CD:

水/g:

ml

1

1:

4

40

60

1:

4

2

1:

6

50

90

1:

7

3

1:

8

60

120

1:

10

2.2.6正交实验结果

表7挥发油β-CD包合的正交试验数据

序号

A

B

C

D

含油率（%）

利用率（%）

收得率（%）

1

1

1

1

1

8.52

42.76

89.06

2

1

2

2

2

7.74

41.84

85.67

3

1

3

3

3

8.59

42.86

88.76

4

2

1

2

3

9.65

72.45

93.89

5

2

2

3

1

8.7

52.04

57.63

6

2

3

1

2

9.03

51.02

71.82

7

3

1

3

2

9.69

89.80

83.57

8

3

2

1

3

9.70

92.86

79.61

9

3

3

2

1

9.60

65.31

58.75

含油率

K1

24.85

27.87

27.25

26.82

K2

27.38

26.14

26.99

26.46

K3

28.99

27.22

26.98

27.94

k1

8.283

9.287

9.083

8.940

k2

9.127

8.713

8.997

8.820

k3

9.663

9.073

8.993

9.313

R

1.380

0.574

0.090

0.493

利用率

K1

127.46

208.07

186.64

160.11

K2

175.51

186.74

179.6

182.66

K3

247.97

159.19

184.7

208.17

k1

42.487

68.337

62.213

53.370

k2

58.503

62.247

59.867

60.887

k3

82.657

53.063

61.567

69.390

R

40.170

15.274

2.346

16.020

收得率

K1

263.49

262.56

240.49

205.44

K2

223.34

222.91

238.31

241.06

K3

221.93

219.33

229.96

262.26

k1

87.830

88.840

80.163

68.480

k2

74.447

74.303

79.437

80.353

k3

73.977

73.110

76.653

87.420

R

13.853

15.730

3.510

18.940

表8以含油量为指标的方差分析表

因素

偏差平方和

自由度

F比

F临界值

显著性

油:

环糊精

2.904

2

181.500

19.000

*

温度

0.504

2

31.500

19.000

*

时间

0.016

2

1.000

19.000

环糊精:

水

0.397

2

24.813

19.000

*

误差

0.02

2

F

（2，2）=19，F

（2，2）=99,*为有显著性。

通过R值直观分析对该工艺影响的因素程度为A>B>D>C，其中A因素中A3为优、B因素中B1为优、D因素中D3为优、C因素中C1为优。

通过方差分析影响，A、B、D因素均有显著性差异。

经以上直观分析和方差分析。

结果表明以含油率为指标得到的最佳包合工艺是A3B1C1D3。

表9以利用率为指标的方差分析表

因素

偏差平方和

自由度

F比

F临界值

显著性

油:

环糊精

2453.546

2

278.338

19.000

*

温度

354.696

2

40.238

19.000

*

时间

8.815

2

1.000

19.000

环糊精:

水

385.447

2

43.726

19.000

*

误差

8.81

2

F

（2，2）=19，F

（2，2）=99,*为有显著性。

通过R值直观分析对该工艺影响的因素程度为A>D>B>C，其中A因素中A3为优、B因素中B1为优、D因素中D3为优、C因素中C1为优。

通过方差分析影响，A、B、D因素均有显著性差异。

经以上直观分析和方差分析。

结果表明以利用率为指标得到的最佳包合工艺是A3B1C1D3。

表10以收得率为指标的方差分析表

因素

偏差平方和