REACH法规 第四卷译稿41.docx
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REACH法规第四卷译稿41
B.41.光毒性－体外3T3NRU光毒性测定
光毒性测定
1.方法
1.1.引言
光毒性被定义为一种毒性反应，它是有皮肤在接触某种化学物质及并发的光线后产生的，或者是在一种化学物质射线的诱导下产生。
从体外3T3NRU光线损害测定中得出的信息，可用于识别测定物质的光学毒性，即测定当测定物质接触于紫外光和可见光下时发生危险的可能性。
由于在体外3T3NRU光线损害测定中毒物学的终点决定了化学物质和光共同作用而产生的光线损害，整体的分布和应用于皮肤的具有活体光学毒性的化合物以及在局部应用于皮肤的光学辐射之后的化合物可以被测定出。
体外3T3NRU光线损害测定是在1992-1997年联合的EU/COLIPA
（1）
（2）（3）中开发和生效的，其目的在于建立一个合法的项目以替代目前使用的各种各样的活性测定。
1996年，OECD工作组推荐了一种用于光线损害度评估的活性测定（4）。
来自体外3T3NRU光线损害测定的结果与在动物/人身上的敏锐的光线损害/光学辐射作用相比较时，其表现出了很好的对这些作用的预期指示性。
这一测定并不是设计用来预测其他来自化学物质和光线共同作用而产生的相反的作用。
例如，磷光光线损害、光变反应和光致癌,尽管许多表现出以上特殊性质的化学物质将在体外3T3NRU光线损害测定中发生正反应。
此外，该测定也不能用于光学毒性效力的评估。
在附录1种已给出一个相继产生的测定光线损害的化学物质的方法。
1.2.定义
辐照度:
紫外线或可见光在一表面上的强度，用W/m2或mW/cm2度量。
光的剂量:
紫外线或可见光在一表面上伴随产生的量（强度*时间），用焦耳/米2或焦耳/厘米2表示。
紫外线光波段:
CIE推荐的名称为UVA（315-400nm），UVB（280-315nm）和UVC（100-280nm）.也常使用其他一些名称：
UVB和UVA的分界线常置于320纳米，UVA可被分为UV-A1和UV-A2其分界线大约在340纳米。
细胞存活率:
测量一细胞总活性的参数（例如.将关键的染料移入细胞的溶酶体中），其决定于测量的终点和所用的设计方案，并且与细胞总数和存活率相关联。
相对细胞存活率:
即在与整个实验步骤中所用的阴性对照组相关的，但不处理测定物质的细胞存活率。
预测模型:
一个用于将毒性测定结果变异为对毒性能力的预测。
在现有的测定方针中PIF和MPE可用于将体外3T3NRU光线损害测定的结果变异为对该物质光线损害能力的预测。
PIF:
（光刺激因素）一个由对测定化学物质两个等价的效力的细胞毒素的浓缩物的比较而引发的因素，所用测定化学物质置于（+UV）和无细胞毒性的UVA/vis光的辐射下。
MPE:
（光方法作用）但（+UV）和无细胞毒素的UVA/vis光的辐射下，我们发现了一种新的测量方法。
在上述条件下，对两个浓缩物的反应曲线完整形状的数学分析。
光线损害:
皮肤在某种化学物质下第一次接触，随后，在光线下接触时被激发的毒性反应；或者是皮肤在一种化学物质的监控下，发生的放射现象。
光刺激:
术语'光线损害'的子种,仅用于描述当皮肤局部接触于化学物质时产生的光学毒性反应。
这些光学毒性反应常常导致对细胞不确定的损害（如太阳光的灼伤）。
光过敏:
一种后获得的免疫的活动能力；该能力的活得在皮肤第一次接触于化学物质和光线时不能产生，它需要一到两个星期的诱导时期。
光神经毒性:
在基因终端发生的基因毒性反应；这种反应是在细胞接触于无基因毒性剂量的紫外或可见光和无机印度星化学物质时引导产生的。
光致癌性:
由于重复使用光线照射和化学物质而诱发的光学致癌性。
术语‘co-carcinogenesis'一次用于当紫外光诱发的肿瘤遇化学物质进一步恶化时。
1.3.参考物质
除了应在每一测定中测定的阳性对照组物质氯丙嗪之外，对在新建立的3T3NRU光线损害测定中，人们建议把实验室内关于目前测定用到的化学物质中的一部分作为参考物质
（1）（3）（13）。
1.4.开始的考虑
据实验结果报告，许多类型的化学物质都能诱导光学毒性效应（5）（6）（7）（8）.它们唯一的共性，即是它们在太阳光区域内吸收光能的能力。
依照光化学（Grotthaus-Draper's定律）光化反应需要吸收足够量的光子。
因此，在考虑根据现有的实验方针作生物实验之前，应确定一个测定物质的紫外光吸收谱（例如，根据OEC实验方针101）如果摩尔猝灭/吸收率小于10升每摩尔每厘米，该化学物质无光反应能力，并不许作3T3NRU光线损害测定或其它任何测定相反光化学效应的生物实验（附录1）。
1.5.测定方法原理
用来确定一种（化学物质）生色团吸收光的四种装置可导致光线损害反应（7）、它们会导致细胞损害。
因此，在体外3T3NRU光线损害测定中建立在当接触在一个非毒性剂量
UVA/vis光存在或不存在情况下测定一个化学物质毒性比较的基础上。
在这个实验中的细胞毒性用在用试验化学品和辐射处理后，用生物染料和中性红（NR,（9）24小时在浓度方面的复原表示。
Balb/c3T3细胞在单分子层的形成的24h内的培养液中获得。
每种测定物质的两个96-well盘用该种化学物质的8种不同浓度预培养1小时。
此后，将两个盘中的一个用非破性5J/cm2UVA/Vis光照射，（+UVA实验），另一个盘子保存在暗处（-UVA实验）。
在两个盘子中，处理媒质用培养媒质代替，而且在培养24小时后，细胞存活率用NeutralRedUptake（NRU）确定3小时。
相对细胞存活率用未处理阴性对照组百分比描述。
它用每8种测定浓度计算。
比较在可见（+UV）和不可见（-UV）光中得到的浓度响应来预测光线损害能力。
其响应经常在EC50水平,即在一种浓度下，用未处理对照组已知细胞存活率到50%。
1.6.质量标准
UVA细胞敏感度,以往的实验数据:
细胞应该定期检查其对UVA的敏感度。
细胞在体外3T3NRU光线损害测定中使用的密度下繁殖。
第二天用从1-9J/cm2的UVA剂量昭示，第三天用NRU验证测定确定细胞存活率。
如活细胞存活率在用5J/cm2UVA照射率不低于在暗处对照组中存活率的80%，那么细胞满足标准特性。
在最高量的UVA9J/cm2下，存活率不应低于在暗处对照组的50%。
这种测定应每10个细胞节重复一次。
阴性对照组细胞的UVA敏感度,近期测定：
如果阴性对照组（在Earl’平衡盐溶液（EBSS）用或不用1%的二甲亚砜（DMSO）或1%乙醇（EtOH）中的细胞）在那+UVA实验中得出的存活率不低于统一溶剂中在暗处（-UVA）实验中未被照射细胞存活率的80%，则实验满足标准。
阴性对照组的存活率:
在NR阴性对照组的浓缩物中测得的绝对光密度（OD540NRU）说明了在测定的两天内，每well中1*104个去核细胞在正常倍增时间内已成熟。
如果未处理培养液的平均OD540NRU大于等于0.2，测定符合接受标准。
阳性对照组:
一已知的光线损害化学物质应在体外3T3NRU光线损害测定中同时各项测定.精神病药（CPZ）在欧盟/COLIPA证实研究中作为阳性对照组并因此被建议使用。
对于在体外3T3NRU光线损害测定中的标准草案的CPZ测定，规定了下列可接受标准：
CPZ照射:
（+UVA）对EC50=0.1到2.0μg/毫升，CPZ未被照射（-UVA）:
EC50=7.0到90.0μg/毫升。
光线发射因素（PIF）,如EC50的变化应该至少是6。
对其它已知光学损害化学物质，若化学物质种类合适或被测化学物质的溶解度特性已被评估过，则可代替CPZ来做同步阳性对照组。
在这种情况下，在以往实验数据的基础上，EC50数值范围和PIF或MPE（平均光效应）应该足够定义为测定的可接受标准。
1.7.测定方法的描述
1.7.1.准备
1.7.1.1.细胞
建议使用来自ATCC或ECACC的一个永久的小鼠fibroblast细胞系用来在确定研究中。
如果培养条件随特殊细胞和改变的话，其他的细胞或细胞列可能成功地用在同一测定草案中，但必须证明其等值性。
应该定期检查细胞的myciplasma污染的缺乏。
如果这种检查结果令人满意的话，细胞应该仅被使用。
既然细胞的UVA敏感度可能随传代的数目而增长。
应该使用可获得的最低传代数目（最好少于100）的Balb/c3T3细胞。
Balb/c3T3细胞的UVA敏感度应依据在这个指示方针所规定的培养测定步骤来测定，这是很重要的。
1.7.1.2.培养基和培养条件
合适的培养媒质和培育条件应用在细胞传代实验步骤中和测定步骤过程中。
对因为Balb/c3T3细胞来说是用10%新生牛犊血浆，4毫摩尔夫酸安，盘尼西林和链霉素,和在37℃/7.5%CO2条件下湿度调节培育。
尤其重要的是细胞培养条件应保证一个细胞循环同期在正常的以往细胞或细胞列所用同期的范围内。
1.7.1.3.培养准备
从冰冻储存的培养液中取出的细胞在一个合适的密度的培养媒质中繁殖，并在把它们用于体外3T3NRU光线损害测定前至少次培养一次。
光学损害测定细胞在一个密度下的培养媒质中繁殖，使得在测定结束时培养液未达到汇合。
如细胞存活率在细胞繁殖后48小时内决定下来。
对生长在96个well的盘中的Balb/c3T3细胞，建议使用1*104个细胞/well的细胞密度。
对每种测定化学物质，细胞同时在2个单独的96个well盘中繁殖。
然后在确定的培养条件下，在整个实验步骤中同时取这些盘子。
只有当一个盘子被照射（+UVA/vis）而另一个盘子放在暗处（-UVA/vis）时例外。
1.7.1.4.新陈代谢
尽管新陈代谢系统的使用在所有预测基因毒性和潜在致癌性的在体外测定中是一个基本要求。
迄今为止，在光线损害情况下没有一种已知化学物质需通过新陈代谢转化来作为光学毒性在体内或体外中。
因此，既无必要认为也无科学证明现在的实验需要使用新陈代谢活化系统来做。
1.7.1.5.测定化学物质/准备
测定化学物质必须在使用前迅速新鲜制备，除非稳定的数值证明使用存储可接受。
当可能发生光降解时要求在红光下准备。
测定化学物质应该在缓冲盐溶液中，例如.Earl平衡盐溶液,或PhosphateBufferedSaline（PBS）,这是为了防止照射时的干扰。
必须没有蛋白质成分和光吸收pH指示剂的颜色.
在水中溶解度小的待测化学物质应以最后要求浓度的100倍浓度溶在合适的溶剂中。
然后以1:
100的比例用缓冲盐溶液稀释。
使用的溶剂必须在所有培养液中有一个确定的体积比1%（v/v）如在阴性对照组和所有的浓度测定化学物质中。
建议使用二甲亚砜（DMSO）和乙醇（EtOH）。
其他低毒性（例如.丙酮）的溶剂可能也适合，但必须仔细评估它们的特殊属性。
例如，与待测化学物质的反应，光线损害作用的猝灭，吸收波的特性等。
可能是用到漩涡混合和/或声波和/或加热到37℃，如果必要的话，辅助溶解。
1.7.1.6.紫外线发光/准备
光源:
选择一种合适的光源和合适的滤色镜，在光线损害的测定中是最主要的因素。
UVA和可见区域经常与光敏性（7）（10）联合。
然而UVB更不合适并具有直接高毒性。
从313到280个nm通过1000叠增加它的损害性。
合适光源选择的标准应包括光源能发射被待测化学物质吸收的波长的光并且光的量（在一个合理的时间能达到）应足够已知光敏剂的探测使用的潜在要求。
更进一步讲，使用的波长和光强度不易有损于测定系统，包括传播热量（红外区）。
用太阳模拟器模拟的太阳光是一种理想光源。
氙电弧和（浓的）卤化汞中卤用在太阳模拟器中。
后者又放出更少的热和更便宜的优点，但是并不与太阳光完全一样，因为所有的太阳模拟器发射有效数量的UVB，它们应适合过滤到减弱的高度光线损害的UVB波长范围。
例如在体外3T3NRU光线损害测定中UVB实际应用的是缺乏UVB（UVA:
UVB~20:
1）的辐射光谱。
一个过滤的太阳模拟器的辐射光谱分布的例子在体外3T3NRU光线损害测定研究。
这个证实研究已经发表。
放射量测定:
光的强度（辐照度）应该在每次光线损害测定之前用一个合适的宽频UV-METER定期检查。
这个UV-METER必须经刻度校准。
应该检查UV-METER的表现，并且为了这个目的，使用第二者，推荐参考文献同一类型和同一校准刻度的UV-METER。
理想的情况是，在更大的间隔中，分光辐射度计应该用来测定过滤的光资源的光谱辐射度并检查宽频UV-METER的校准刻度，但这些工具要求合适的受过训练的人的熟练操作。
一个5J/cm2UVA）的剂量在研究中确定对Balb/c3T3细胞无毒害作用并充分有效激活弱光学毒性物质。
为了在50分钟内达到5J/cm2辐射度，必须调节到1.666mW/cm2。
如果使用另一个细胞列或一个不同的光源，UVA剂量必须根据对细胞无害并有效测定标准光学毒性物质的标准稍作改动。
光照时间应按下列公式计算：
1.7.2.测定条件
一种被测化学物质的最大浓度不应超过100μg/毫升,因此所有的光学毒性物质都在一个低浓度下测定，反之在高浓度下的伪阳性入射增加。
测定物质的最高浓度pH应适当（pH范围:
6.5-7.8）.
在可见（+UVA）和不可见（-UVA）光中测定的化学物质浓度范围应在范围-查找实验中被适当定下来。
一种浓度系列的范围和截距应随依据有效实验数据而作的浓度-响应曲线而调整。
应使用几何浓度系列（带有连续稀释因素）。
1.7.3.测定步骤14
1.7.3.1.第一天
在培养液中准备含1x105细胞/毫升的悬浮液，并在一个96well组织培养液的微量测定皿中的外部容器中配100μL培养液。
在剩下的容器中，配100μL，1*105细胞/毫升的细胞悬浮液。
对于每种测定化学物质,准备二个盘:
一个用来确定毒性（-UVA），另一个用来确定光线损害（+UVA）。
培育细胞24小时（7.5%CO2，37℃）者到它们形成半-汇合单分子层。
在这个培育过程中，允许细胞恢复和黏附并且以指数速度生长。
1.7.3.2.第二天
在培育之后,慢慢从细胞中倒出培养液，用150μLEBSS/PBS洗两次。
100μLEBSS/PBS到包含有合适浓度的测定物质或溶剂（阳性对照物）中。
使用8种不同的浓度的测定物质。
在暗处用被测化学物质培育细胞60分钟（7.5%CO2，37℃），在实验的形成（+UVA）部分，在室温下通过一个96well盘盖1.7mW/cm2UVA照射细胞50分钟，用扇子通风防止水凝结在盖子下。
保持副本盘（-UVA）在室温下在暗处50分钟（=UVAexposuretime）
慢慢倒出测定溶液并用150μLEBSS/PBS洗两次。
用培养液代替EBSS/PBS并培育（7.5%CO2,370C）过夜（18-22h）.
1.7.3.3.第三天
显微镜的评估
在一个时期-差别显微镜之下调查细胞.在形态学中的记录变化那由于测定化学物质的细胞毒素作用的细胞.检查被推荐,排除实验的错误,但是这些记录没被为细胞毒性的评估用或光线损害。
中性红色吸收测试
用150μL预热的EBSS/PBS洗细胞.轻轻敲打除去洗濯溶液.在37℃增加100μlNR培养基,湿气为7.5%CO2,时间为3小时。
在培育之後，除去NR培养基,用150μLEBSS/PBS洗细胞。
轻轻倒出所有EBSS/PBS.（可选择的:
离心分离机颠倒盘.）
增加150μLNR解吸溶液（新准备乙醇/醋的酸）
快速地在微量滴定盘摇荡机上摇动微量滴定盘为10最小,直到NR从细胞中榨出并且有形成同种的溶液。
以540nm在一个分光光度计中测量NR榨出物的光学密度,使用空格当做一参考。
在合适的文件格式中为后来的分析保留实验数据（例如：
美国信息交换标准代码）。
2.实验数据
2.1.实验数据的质量和数量
实验数据应当允许一个有意义的浓度响应的分析结果，其中包含了有紫外和没有紫外光照耀下的照射强度。
如果生物滋养层被发现，单个浓度的范围和截距都应当设置的使曲线和实验数据相符合。
由于实验的化学物质在黑暗实验的条件下（也就是无紫外光照耀）即使在浓度达到实验所允许最高值（即100微克每毫升）的时候，也并不发生细胞毒素现象，但是在有紫外光辐射下的时候却强烈发生细胞霉素这个事实，所以要在两方面用于实验的浓度范围需要在数量上进行区分，也满足对实验数据定量的需要。
如果在实验的两部分（有紫外光照射和没有紫外光的照射）都没有发现细胞霉素，被选用测定的试剂之间应有较大的差距以达到浓度要求。
没有必要通过进行重复实验来确认一个清晰的阳性的结果，另外，清晰的消极的结果不需要进行确认，如果实验化合物具有足够高的浓度的话。
在这样的情况下，有一个或多个寻找范围的支撑实验支持的主要实验就足够了。
在猜测样本的取舍点附近有界限值的实验应该进行重复实验确认。
如果重复实验被认为是必要的话，那么实验条件的变量对取得一个很清晰的值就很重要。
实验中一个主要的变量是得到这个化合物结果的准备工作。
因此，这些条件的变量（溶解性、超声波降解法、粉碎粉末）就和实验的重复性非常的相关。
要么，变量的照耀前时间就应该仔细的考虑。
更短的时间对于对水不稳定的物质就很相关。
2.2.实验结果处理
如果可能的话，被测量的化合物的浓度会反映细胞抑制剂达50%。
通过应用一些合适的非直线衰退剂实验步骤可以达到要求。
或者运用其他合适的实验步骤。
在运用EC50来进行更深计算时，设置的定量应当进行精确的核实。
或者，坐标法也可以用来计算EC50。
在这种情况下，推荐使用合适的坐标纸（X轴：
LOG，Y轴：
概率单位），同很多别的情况一样，通过变异，浓度的响应功能将更加线形化。
2.3.结果的估计（预计模型）
2.3.1.预计模型1：
光刺激因素
如果在有紫外光和没有紫外光照耀两种情况下，得到了完整的浓度响应曲线，通过下面的公式将能把PIF计算出来
PIF=EC50（-UV）/EC50（+UV）（a）
如果PIF小于5，表明没有光线损坏的可能性。
如果PIF大于5，表面光线损害是有可能的。
如果一个化合物只在有紫外照耀下出现细胞霉素，而在没有紫外光的测定下却没有出现相同的现象，那么不能计算PIF，即使计算结果表面光线损坏的可能。
在这样的情况下，如果在没有紫外光照耀，且浓度达到了符合实验要求的最高值的条件下完成了的细胞滋养层实验。
“＞PIF”能被计算出来。
＞PIF=Cmax（-UV）/EC50（+UV）（b）
只要到一个“＞PIF”。
那么任何大于1的值表明光线损坏的可能性。
如果化合物在浓度达到允许的最高值也不表现出细胞霉素的性质而使得EC50（-UV）和EC50（+UV）的值无法计算，这就表明没有光线损坏的可能性。
这种情况下，“PIF=*1”用来描述结果。
PIF=*1=Cmax（-UV）/Cmax（+UV）（c）
只要可得到“PIF=*1”,就意味着没有潜在的光毒性。
如果b和c情况下，在预测光的损坏可能性时，在体外3T3NRU光线损坏性实验应该仔细的考虑。
2.3.2.预测模式2：
平均光作用（MPE）
或者，一种新形式预测光的损坏可能性分析的模式来可以用来运用，该模式已经发展到应用EU/COLIPA实验数据，并已在封闭性条件下进行过测定。
这种模式克服了在MPE中EC50不能被包含的缺点。
这种模式使用了MPE，一种基于完全的浓度响应曲线的比较的方法。
为了使用MPE模式，一种特殊的计算机软件已经在位于德国柏林的洪保德大学研究发展，而且这种软件可以免费的加入包含。
2.4.对结果的解释
一个体外3T3NRU关于光的损坏性实验得到的阳性结果表面了实验的本质具有光的损坏性可能性。
如果这种结果在浓度低于10μg/ml得到，用于实验的化合物也很可能在各种活体接触条件下表现出光线损害性。
如果一个阳性的实验结果只在浓度达到最高值（100μg/ml）才能得到的话，为了确认该物质的危害性和光损坏可能性，需要进行更深一部的考虑。
这些包含个方面的实验数据，比如光的渗透性、吸收性和在皮肤对化合物可能的积累性，或则在确定性的交替实验中检查化合物，比如使用人类体外皮肤实验。
从体外3T3NRU的光损坏性实验得出的阴性结果表明了实验测定的本质对哺乳动物来说是不具有光的损坏性的。
使用过的情况.以防万一化学物质可以哪里被直到最高的浓缩测定100μg/毫升，一个阴性的结果指示化学物质没有光线损害的潜在性,和光线损害在体内中可能被认为不太可能.以防万一哪里同一的剂量毒性反应（EC50+紫外线和EC50-紫外线）在比较低的浓缩被获得,那实验数据的解释会是相同的.在差别中,如果没毒性性被示范（+紫外线和-紫外线）和如果限制对数值少于100μg/毫升的浓缩水可溶性,然后有测定的测定物质的相容性可能被询问和复合型测定应该是考虑过的（例如：
使用一在体外中剥皮模型,或一个体内皮肤模型或一在体内中测定）.
3.实验结果报告
测定结果报告
测定结果报告一定包括下列各项实验数据:
3.1.测定化学物质:
-确认实验数据和CAS号码,如果已知的
-物理性质和纯度
-与研究指导有关的物理化学特性
-稳定性和光稳定性,如果已知的
3.2.溶剂:
-选择溶剂的鉴定
-溶剂中测试化学物质的溶解性
-处理培养基（EBSS,PBS）中溶剂的百分比
3.3.细胞:
-细胞的类型和来源
-支原体的缺乏
-细胞纪代移钟的数目,如果已知的
细胞的UVA敏感度,被辐照仪器用在试管内3T中3NRU光线损害测试测定。
3.4.测定情况:
（a）处理之前和之後的培养:
-培养基的形状和成分
-培养条件（CO2浓度，温度,湿气）
-恒温时间（处理前，处理后）
（b）用化学品的处理
-有无UV/vis辐照时使用的测试化学品的浓度选择的基本原理
-如果测试化学品溶解度有限而无细胞毒性，最高测试浓度的基本原理
-处理媒介的形状和成分（缓冲盐溶液）
-化学处理期间
（c）辐照
-使用光源的选择原理
-光源的分光照度特性
-使用的滤波器的传输/吸收特性
-校准的辐射计特性和细节
-光源与测试体系的距离
-在此距离以Mw/cm2表示的UVA辐射照度
-UV/vis光处理时间
-UVA剂量（辐射照度×时间），以J/cm2表示
-辐照中的细胞培养温度和目前存放在暗处的细胞培养温度
（d）NRU测试
-NR媒介的成分
-NR恒温的时间
-恒温条件（二氧化碳浓度，温度，湿度）
-NR提取条件（提取剂，时间）
-NR光学密度分光光度读数使用的波长
-第二波长（参考），如果使用的话
-分光光度计空格的内容，如果有的话
3.5.结果:
-用百分比表达在每个浓缩的测定化学物质的细胞存活率。
-并行的+UVA和-UVA实验中获得的浓度反应曲线（测定化学物质浓缩VS比较有关的细胞存活率）,
-浓度反应的实验数据分析曲线:
如果可能的话,计算EC50（+UVA）和EC50（-UVA）
-通过光刺激系数（PIF）或光作用平均值的计算（MPE）存在UVA/vis辐照和缺少UVA/vis时的两个浓度反应曲线的比较。
-光损害潜在性的分类
3.6.测定接受标准:
（a）同时进行的阴性对照:
-被辐射的和未被辐射的细胞的绝对的存活率（NR榨出物的光学密度
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