一株高漆酶活性树舌灵芝木质素降解条件的优化.docx
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一株高漆酶活性树舌灵芝木质素降解条件的优化
一株高漆酶活性树舌灵芝木质素降解条件的优化
[1]
农作物废弃秸秆中含有大量木质素资源难以被利用；同时木质素也是影响反刍动物瘤胃微生物消化的因素之一[1]。
如何提高其对木质素的降解效率成为近年来研究开发的热点。
目前报道木质素降解能力较强的微生物多为白腐真菌、软腐真菌和褐腐真菌[2-4]。
木质素降解真菌通过合成漆酶（Lac）、锰过氧化酶（MnP）和木质素过氧化物酶（LiP）[3,5]等一系列同功酶发挥作用。
灵芝具有较高的药理活性，同时具有高效降解木质素的潜在特性[6]。
目前国内外对灵芝
属菌株的研究多集中在木质素降解酶系及产单一酶发酵条件的分析方面，而相关木质素降解应用的研究相对较少。
在前期分离到一株树舌灵芝的基础上，分析该菌株的降解酶系，进一步研究其对木质素的降解条件，为提高木质素的微生物降解能力提供参考，同时对未来农作物废弃物资源的生物转化及饲料加工等领域的应用具有重要意义。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1菌株
树舌灵芝菌株由吉林农业科技学院生物工程学院微生物实验室分离并鉴定。
1.1.2培养基
（1）PDA培养基及种子培养基参考文献[7]配制。
（2）愈创木酚显色培养基：
含0.04%的愈创木酚的PDA培养基。
（3）产酶培养基[8]：
20.0g/L小麦麸皮、2.0g/L豆粕、20.0g/L葡萄糖、3.0g/LKH2PO4、1.5g/LMgSO4。
（4）木质素降解培养基[3]：
2.0g/L木质磺酸钠、0.5g/L葡萄糖、2.0g/L豆粕、3.0g/LKH2PO4、1.5g/LMgSO4、0.375g/LCuSO4。
1.2方法
1.2.1树舌灵芝降解木质素的定性分析
将活化好的树舌灵芝菌株接种于愈创木酚显色培养基上，28℃培养，12h后观察是否产生有色圈形成，并测定菌落直径d1及有色圈直径d2，计算d1/d2的比值[9]，初步分析树舌灵芝降解木质素的特性。
1.2.2树舌灵芝中木质素降解酶的动态分析
将活化好的菌株，用打孔器取3块直径为5mm的菌饼，接种至种子培养基中，28℃，120r/min培养5d后即为种子液，转接至产酶培养基中进行发酵培养。
每隔2d取5mL发酵液，10000rpm离心8min，取上清液测酶活。
木质素降解酶系的酶活测定：
漆酶酶活力的测定采用ABTS法[10]；锰过氧化物酶（MnP）的活性测定参考Rogalski的方法[11]；木质素过氧化物酶（LiP）活性测定采用藜芦醇法[12]。
1.2.3木质素的降解率的测定
配制不同浓度梯度木质磺酸钠标准溶液，280nm波长下测定不同浓度溶液的OD值，并绘制标准曲线[3]。
木质磺酸钠浓度与吸光值间的线性回归方程为y=0.0288x-0.0283，相关系数R2=0.9986。
种子液按2%接种于降解培养基中，28℃，120r/min培养9d。
发酵液经10000r/min离心8min，上清液经适当稀释后，测定OD280值，计算木质磺酸钠含量[13]。
木质素磺酸钠降解率（%）=（2.0g/L-发酵后的含量）/2.0g/L×100%。
1.2.4不同因素对树舌灵芝降解木质素的影响
将制备的种子液接种到降解培养基中，以木质素磺酸钙为底物，发酵培养9d后，测定木质素的降解率。
以降解率为指标，分别考察不同氮源，氮源浓度，底物浓度，培养温度及初始pH对树舌灵芝降解木质素的影响。
1.2.4正交试验优化降解条件
在单因素试验结果的基础上，进行L9（34）正交试验（表1），进一步优化木质素降解条件。
1.2.5验证试验
按照正交试验优化的最适降解条件进行验证试验，平行进行3次试验，计算木质磺酸钠的平均降解率。
2 结果与分析
2.1产漆酶树舌灵芝的定性分析
树舌灵芝菌饼接种于显色培养基上，第2d即形成淡红色有色圈，初步判断该菌株可以产漆酶。
第5d后菌落直径最大，有色圈颜色明显加深，呈棕红色（图1）。
进一步测定菌落直径及有色圈直径并计算d1/d2的比值，比值0.568-0.734之间，小于1，初步判定该菌株可以选择性降解木质素[14]。
图1树舌灵芝在愈创木酚平板中的显色分析
2.2树舌灵芝中木质素降解酶系的动态分析
对木质素降解酶的测定结果如图2所示，树舌灵芝Lac酶活明显高于LiP和MnP；发酵培养7d时Lac酶活达到峰值，为735.2U/L。
其次是LiP，而MnP的活性相对较低。
LiP和MnP均在第5d检测到峰值，分别为254.6U/L和142.7U/L。
由此推断树舌灵芝木质素降解中漆酶可能发挥关键作用。
图2树舌灵芝木质素降解酶系分析
2.3不同因素对树舌灵芝降解木质素的影响
2.3.1不同氮源对树舌灵芝降解木质素的影响
本研究分别选取无机氮源和有机氮源各3种，分析氮源对木质素降解的影响。
结果如图3所示，以豆粕作为氮源时，降解率达到32.22%。
降解效果最好。
后续试验中选择豆粕为主要氮源。
图3氮源种类对树舌灵芝降解木质素的影响
2.3.2不同氮源浓度对树舌灵芝降解木质素的影响
适宜的氮源浓度有利于提高木质素降解效率。
对不同氮源浓度的实验结果如图4，氮源浓度为2.5g/L时，木质素的降解率最高。
较高的氮源浓度下降解率要略低于较低浓度氮源的降解率。
图4氮源浓度对树舌灵芝降解木质素的影响
2.3.3不同底物浓度对树舌灵芝降解木质素的影响
由图5可知，当底物浓度为2g/L时，降解效果最好，降解率达到35.73%。
当底物浓度大于5g/L后，降解率迅速下降。
分析原因可能是底物浓度后，随着培养时间的延长，发酵液逐渐粘稠，会降低菌体对营养及氧气的吸收[15]，进一步抑制菌体分泌降解酶系，进而影响木质素的降解。
图5底物浓度对树舌灵芝降解木质素的影响
2.3.4不同培养温度对树舌灵芝降解木质素的影响
温度一方面影响菌株的生长代谢，另一方面影响木质素降解速度。
由图6知，在30℃条件下，树舌灵芝木质素降解率最高。
温度高于30℃时，降解率显著降低，与相对高温下降解酶容易变性失活有关。
图6培养温度树舌灵芝木质素降解率的影响
2.3.5不同初始pH对树舌灵芝降解木质素的影响
由图7可知，该菌株在pH6.0-9.0之间对木质素均有很好的降解效果。
在pH9.0时，降解率仍能达到28.92%。
pH值过大或过小降解率明显降低。
图7初始pH对树舌灵芝降解木质素的影响
2.4树舌灵芝木质素降解条件的优化
正交试验结果（见表1）表明，树舌灵芝降解木质素的最适发酵条件为底物浓度为3.0g/L，氮源浓度为2.5g/L，初始pH6.0，发酵温度28℃。
极差分析结果表明，4个因素对木质素降解率的影响大小依次为氮源浓度＞底物浓度＞初始pH＞培养温度。
表1正交试验设计及结果
试验编号
氮源浓度
（g/L）
底物浓度
（g/L）
初始
pH
温度
（℃）
木质素降解率
（%）
1
1（1.5）
1（1.0）
1（6.0）
1（26）
29.53
2
1（1.5）
2（2.0）
2（7.0）
2（28）
30.64
3
1（1.5）
3（3.0）
3（8.0）
3（30）
30.42
4
2（2.5）
1（1.0）
2（7.0）
3（30）
39.87
5
2（2.5）
2（2.0）
3（8.0）
1（26）
40.14
6
2（2.5）
3（3.0）
1（6.0）
2（28）
41.30
7
3（3.5）
1（1.0）
3（8.0）
2（28）
33.63
8
3（3.5）
2（2.0）
1（6.0）
3（30）
34.66
9
3（3.5）
3（3.0）
2（7.0）
1（26）
34.90
k1
30.197
34.343
35.163
34.857
k2
40.437
35.147
35.137
35.190
k1
34.397
35.540
34.730
34.983
R
10.240
1.197
0.433
0.333
各因素对试验显著性的影响如表2所示。
由表2可知氮源浓度对木质素的降解影响显著。
表2正交试验显著性分析结果
因素
偏差平方和
自由度
均方
F值
显著性
氮源浓度
158.973
2
79.49
6.36
∗
底物浓度
2.232
2
1.12
0.055
初始pH
0.354
2
0.18
0.009
温度
0.170
2
0.09
0.004
误差
161.74
8
80.87
∗有显著差异（P＜0.05）
2.5验证试验
根据正交试验结果，选择最优降解条件，进行3次验证试验，得到优化后的树舌灵芝木质素降解率，结果见表3。
树舌灵芝木质素降解率的平均值为44.72%，表明该发酵条件下木质素降解率较高，重复性好，符合最佳降解条件。
表3验证试验结果
序号
木质素降解率（%）
平均降解率%
1
44.84
2
43.95
44.72
3
45.37
3 讨论
不同灵芝属菌株普遍具有高效降解木质纤维素的特性，在农作物秸秆的生物降解、造纸废水的处理、饲料加工等领域具有广阔的应用前景[6]。
目前灵芝属菌株的研究主要是高产菌株的选育、产漆酶条件的优化及酶生物学特性分析等基础研究方面[16]，应用研究中多集中在染料脱色方面，而相关木质素降解应用研究相对较少。
真菌在不同生长阶段分泌的木质素降解酶活性不同[17]，有文献报道食用菌在菌丝体时期漆酶活性较高[18]。
因此本研究采用液态发酵进行降解特性的分析。
不同灵芝菌株在中木质素降解酶活性差异很大，直接影响到木质素的降解。
本研究中对树舌灵芝发酵培养分泌的木质素降解酶系分析表明，其中Lac活性明显高于LiP和MnP；发酵培养7d检测到峰值，为735.2U/L。
刘禹等分析相同培养条件下灵芝属7个不同菌种漆酶活性的差异，其中有柄树舌与信州灵芝的漆酶活性显著高于其他菌种，有柄树舌在第3d时即可检测到高漆酶活性，信州灵芝在第6d达峰值[19]。
王茂成等对8种不同食用菌产酶情况进行分析，发现木耳和灵芝产酶活性最高，培养第3d时，检测到灵芝中Lac、LiP和MnP的酶活分别为508.6U、112.3U和112.6U[20]。
影响菌株合成和分泌木质素降解酶种类和活性的关键因素是培养体系中的碳源和氮源种类、浓度[17]及培养条件。
陶君等研究发现灵芝的最适产漆酶条件为麦芽糖3%、酵母浸粉0.25%、pH值6.0，培养温度25℃[21]。
潘志恒等发现树舌灵芝发酵产漆酶最佳培养基组成为小麦麸皮20g/L、豆粕2g/L，硫酸铜0.625g/L和香兰素0.0375g/L[8]。
孙海鑫研究发现杂色云芝产漆酶培养基最优组合为马铃薯200g/L，葡萄糖10g/L，麸皮10g/L和黄豆粉7g/L[22]。
吴佳慧研究表明最适合灵芝K-17菌株产漆酶的营养成分为玉米粉、麸皮和花生壳[23]。
而Stajic等研究表明灵芝产LiP和MnP的最佳氮源是蛋白胨，Lac和MnP酶的最佳氮源NH4NO3[24]。
Batool等对灵芝菌株IBL-05进行产酶条件的优化时发现选择葡萄糖和尿素作为碳氮源，发酵培养
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