柑橘皮化学成分分析实验报告.docx
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柑橘皮化学成分分析实验报告
柑橘皮化学成分分析实验报告
综合化学实验
------柑橘皮化学成分分析报告
一、实验背景
1、柑橘皮营养价值
随着人类对营养、健康意识的增强和物质文明的迅速发展，使得食品向自然、粗糙、低热值、低盐、低脂肪、符合原物、方便等方向发展，整个社会对营养食品越来越关注。
关于柑桔果皮的营养价值与药用价值，国内外资料都有较详尽的介绍，尤其是近年来，美国、巴西、日本、中国等国科学家在柑桔果皮的营养及综合利用方面做了大量的研究，并取得了可喜成果。
柑橘皮是柑橘果实加工后余留的最大比例副产品，其内含丰富的生理活性成分以及磷、钙、铁、锌等微量元素。
其所含营养成分除氨基酸外，其余均高于果肉，尤其是富含具有一定生理活性成分如维生素C、类黄酮等物质，使柑橘皮及其提取物具有多重生理功效。
2、设计思路
3、实验目的
（1）掌握水溶剂浸渍法提取维生素C和微量元素。
（2）掌握醇类回流法提取类黄酮成分。
（3）掌握水蒸气蒸馏提取香精油成分。
（4）掌握碘量法测定维生素C含量。
（5）掌握原子吸收光谱测定金属离子。
（6）掌握紫外光谱法测定类黄酮含量。
（7）掌握建立GC混合物分离的色谱条件，并以外标法测定相关物质的含量。
二、实验原理
1、柑橘皮有效成分的提取
从天然产物中提取化学成分，常用的方法有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法及升华法。
（1）溶剂提取法
溶剂提取法是实际工作中应用最普遍的方法，根据天然产物中各化学成分的溶解性能，选用对有效成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，用适当的方法将有效成分尽可能完全地从药材组织中溶解出来。
溶剂提取法的基本原理是在渗透、扩散作用下，溶剂渗透入药材组织细胞内部，溶解可溶性物质，形成细胞内外溶质的浓度差而产生渗透压，在渗透压的作用下，细胞外的溶剂不断进入药材组织中，溶解可溶性成分，细胞内的浓溶液不断向外扩散，如此反复，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡即完成一次提取。
滤出此溶液，再加入新溶剂，使细胞内外产生新的浓度差，提取可继续进行，直至所需成分全部或大部分溶出。
溶剂提取法的关键是选择合适的溶剂，一种好的溶剂应对所提成分有较大的溶解度，而对共存杂质的溶解度很小。
良好溶剂的选择应遵循“相似相溶”的经验规律。
一般说来，只要溶剂的极性与化学成分的极性相似，化学成分就易被溶解。
按照溶剂极性大小顺序以及溶解性能不同，可将其分为水、亲水性有机溶剂、亲脂性有机溶剂三类：
水是强极性溶剂，对药材组织的穿透力大，中药中某些亲水性成分如糖类、蛋白质、氨基酸、鞣质、有机酸盐、生物碱盐、大多数苷类、无机盐等，都可以水为提取溶剂。
柑橘皮中维C和微量元素由于其很好的水溶性，故用水作溶剂提取。
亲水性有机溶剂 是指甲醇、乙醇、丙酮等极性较大且能与水相互混溶的有机溶剂，其中乙醇最为常用。
柑橘皮中的类黄酮物质在醇中有很好的溶解性，可用乙醇回流的方法提取。
亲脂性有机溶剂如石油醚、苯、乙醚、氯仿、醋酸乙酯等，此类溶剂的特点是极性小，与水不能混溶，具较强的选择性，只能提取亲脂性成分，如挥发油、油脂、叶绿素、树脂、某些游离生物碱及一些苷元等。
溶剂的选择要综合考虑溶剂的极性、被提取成分及共存的其他成分的性质三方面的因素来决定，同时还应兼顾考虑溶剂是否使用安全、价廉易得、浓缩方便等特点。
（2）水蒸气蒸馏
水蒸气蒸馏是用来分离和提纯液态或固态有机化合物的一种方法，常用于下列几种情况：
（1）某些沸点高的有机化合物，在常压下蒸馏虽可与副产品分离，但易被破坏；
（2）混合物中含有大量树脂状杂质或不挥发性杂质，采用蒸馏、萃取等方法都难于分离；（3）从较多固体反应物中分离出被吸附的液体。
使用水蒸气蒸馏这种分离方法是有条件限制的，被提纯物质必须具备以下几个条件：
（1）不溶或难溶于水；
（2）与沸水长时间共存而不发生化学反应；（3）在100℃左右必须具有一定的蒸气压（一般不小于1.33kPa）
柑橘香精油由柠檬烯,beta-蒎烯等纯碳氢烯烃和高级醇类,醛类,酮类,酯类组成的含氧化合物组成。
这些成分不溶于水,沸点较高,易被空气中的氧气氧化。
因此常用水蒸气蒸馏提取。
2、维生素C的测定原理
维生素C是可溶于水的无色结晶，是一种分子结构最简单的维生素。
维生素C有防治坏血病的功能，所以在医药上常把它叫做抗坏血酸。
维生素C在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，维生素C具有较强的还原性，在酸性条件下，可被2，6-二氯靛酚氧化。
其结构如下所示：
滴定法是维生素C含量测定最主要的方法，滴定法主要有2，6一二氯靛酚滴定法和碘量法。
本实验用碘量法。
碘的标定：
I2+2S2O32-→2I-+S4O62-
硫代硫酸钠的标定：
6H++IO3-+5I-→3I2+3H2O
I2+2S2O32-→2I-+S4O62-
以碘酸钾为基准物，在酸性条件下与过量的碘化钾反应生成I2与2S2O32-反应。
3、原子吸收光谱测定金属离子
柑橘皮中的微量金属元素主要有钾、钙、铁、锌等，这些金属离子的含量测定可以原子吸收光谱法测定。
待测的柑橘皮的提取液在空气-乙炔火焰中原子化，在光路中分别测定锌对特定波长谱线的吸收。
含量计算需要先建立各个金属的标准工作曲线。
4、紫外光谱测定黄酮类化合物
黄酮类化合物是一类具有C6一C3一C6结构的酚类化合物的总称，目前已从柑橘中鉴定出来的黄酮类化合物有6O余种，最常见的为橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素芸香苷等二氢黄酮类。
橙皮苷是目前柑橘属黄酮中最主要的研究对象，橙皮苷（又称陈皮苷或桔皮苷）为二氢黄酮苷类化合物，是橙皮素与葡萄糖和鼠李糖结合形成的苷类。
由于橙皮苷和Al（NO3）3溶液在80℃反应15min后能形成黄色络合物，通过波长扫描，可测其420nm有最大吸收，通过橙皮苷对照品的系列溶液得到工作曲线后，进行样品中橙皮苷含量的测定。
5、气相色谱测定香精油
柑橘皮中含有多种香精油，其中含量最大的4种香精油分别是：
柠檬烯，beta-蒎烯，芳樟醇，乙酸芳樟醇。
这四种成分沸点不高，受热基本稳定，可用GC进行含量测定。
成分
结构
沸点
柠檬烯
175~177℃
Beta-蒎烯
155~156℃
芳樟醇
193~194℃
乙酸芳樟酯
219~220℃
三、实验仪器与试剂
仪器：
滴定管（酸式、碱式）、移液管、碘量瓶、烧瓶、冷凝管、容量瓶、锥形瓶、铜壶、布氏漏斗、抽滤瓶、圆底烧瓶、研钵、循环水式多用真空泵、SpectAA220原子吸收光度计、UV-2501PC型紫外-可见分光光度计、气相色谱仪GC-2014C
试剂：
橘皮、乙醇（95%）、氯仿、碘酸钾、硫代硫酸钠、盐酸（2%）、硫酸（3M）、1426mg/LZn2+离子储备液、橙皮苷标准液等
四、实验步骤
1、维生素C提取及含量测定
（1）柑橘皮水溶性成分的提取：
新鲜柑橘皮50g称量，剪成20*20cm细条，加80mL2%的HCl，浸泡0.5小时，抽滤，再加50ml2%盐酸，浸泡0.5h，抽滤，再加50ml2%盐酸，浸泡0.5h，抽滤，合并三次滤液，定容到250mL，移取10mL保存用于原子吸收分析，剩余用于维生素C测定。
（2）维生素C的含量测定
a.Na2S2O3溶液的配制（0.01mol/L）:
称取约0.7895g的硫代硫酸钠结晶固体于小烧杯内，加少量蒸馏水溶解，定容于250ml容量瓶中，转移到棕色瓶中备用。
b.I2溶液的配制（0.01mol/L）已配好。
c.碘酸钾标准溶液配制：
差量法准确称取碘酸钾0.1052g，放入碘量瓶中，加20ml水，3ml3ml/L的H2SO4和10ml的10%的KI，用蒸馏水稀释定容到250ml。
d.硫代硫酸钠溶液的标定：
用水冲洗碱式滴定管，再用少量硫代硫酸钠溶液润洗，然后加入硫代硫酸钠至0刻度以上，排气；用移液管移取KIO3标准溶液25.00mL，加入3mL3M的硫酸、10mL10%碘化钾溶液，用硫代硫酸钠滴定该碘酸钾溶液至浅黄色，加入2mL淀粉指示剂，滴定至无色且30s内不变色；重复三次上述操作并记录数据；
e.I2溶液的标定
用移液管移取25.00mL）I2溶液到碘量瓶中，用硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加入2mL淀粉指示剂，滴定至无色；重复三次上述操作并记录数据；
f.用标定好的碘溶液滴定样品，将240ml的维C提取液倒至锥形瓶中，滴定前加入2mL淀粉指示剂，滴定至淡蓝色。
2、AAS测Zn2+
（1）标准溶液的配制：
称取0.2981g氧化锌基准物，用6mol/L的HCl定容至100ml，稀释100倍后，分别移取0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml、2.50ml上述溶液至编号为1-5的50mL容量瓶中，稀释定容后待用。
（2）工作曲线绘制及样品含量测量：
按浓度重低到高的顺序依次测定1-5号容量瓶中不同浓度标准液的的吸光度并记录数据绘制工作曲线。
标准液测定完毕后，取步骤1中所移取出的10.00mL维C提取液，用尼龙滤网抽滤该维C提取液，抽滤完成后测定其吸光度。
3、橙皮苷的提取和含量测定
（1）乙醇回流提取橙皮苷：
定量20g橘皮在80ml乙醇中回流2小时，过滤，用乙醇定容到100ml容量瓶中，备用。
（2）橙皮苷含量的测定：
储备液：
称取0.0989g橙皮苷配制橙皮苷标准液（2mg/ml），用0.1M氢氧化钠：
乙醇=50:
50，定容到50ml容量瓶中。
将储蓄液稀释5倍至0.4mg/ml。
标准曲线绘制：
分别精密量取0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.0ml、4.0ml的橙皮苷标准储备溶液0.4mg/ml，用用0.1M氢氧化钠：
乙醇=50:
50定容到50ml容量瓶中。
用移液管准确移取0.25mL样品于50ml容量瓶中，用乙醇定容。
（3）将紫外-分光光度计开机预热、设置，将参比液放入比色皿中，调零。
自检，波长范围为225~400nm，扫描速度为快。
基线校准。
打开样品室盖，对移取编号为3的那瓶溶液进行测定，确定最大吸收波长为287.10nm、361.90nm，之后按浓度由低到高的顺序，依次测定五个标准品的吸光度并记录数据，最后测定样品的吸光度并记录。
用三号在200-700nm内确定最大波长。
在最大波长处分别测定吸光度值，以值（y）为横坐标、橙皮苷的含量（x，mg／m1）为纵坐标作线性回归，得标准曲线。
样品含量的测定：
样品液稀释100倍，在最大吸收波长处测定吸光度。
4、香精油的提取和分析
（1）水蒸气蒸馏提取橘皮香精油：
称取30g的柑橘皮，剪成细条状，进行水蒸气蒸馏，控制水蒸气蒸馏速度，蒸馏1.5h，收集100-150ml左右的馏出液，将馏出液转移到分液漏斗中，用30ml氯仿萃取一次后，水层继续用20ml氯仿萃取一次，合并两次氯仿溶液，加无水硫酸钠至溶液澄清，用氯仿定容到50ml容量瓶中。
（2）气相色谱测定香精油的含量：
先进行色谱条件优化选出最优条件在进行样品及标准液的测定，优化条件为：
①柱温：
恒温180℃保留10min；②柱温：
60℃，以30℃/min的速度升到180℃，保留0min；③柱温：
60℃，以10℃/min的速度升到180℃，保留0min；优化完成后，选择最优条件进行样品的测定，并记录数据。
柑橘皮中含量最大的4种香精油分别是：
柠檬烯，beta-蒎烯，芳樟醇，乙酸芳樟醇。
将上述4中对照品配成标准溶液在GC上分离得到对照品的色谱图，样品进样，按照外标法测定含量。
五、结果与讨论
1、维生素C含量分析及讨论
称取0.1052g碘酸钾，0.7895g硫代硫酸钠MKIO3=214
C=6*（mKIO3/MKIO3）/（V2-V1）
相对偏差=|平均值-测量值|/平均值
表一、标定硫代硫酸钠
KIO3称重（g）
硫代硫酸钠初刻度V1（ml）
末刻度V2（ml）
滴定体积（ml）
硫代硫酸钠浓度（mol/L）
平均值（mol/L）
相对偏差（%）
0.1052
0.00
22.50
22.50
0.1311
0.1310
0.076%
0.1052
0.00
22.52
22.52
0.1310
0%
0.1052
0.00
22.51
22.51
0.1310
0%
表二、标定碘溶液
碘溶液体积（ml）
硫代硫酸钠初刻度（ml）
末刻度（ml）
体积（ml）
碘溶液浓度（mol/L）
平均浓度（mol/L）
相对偏差（%）
25.00
0.00
18.52
18.52
0.04852
0.04848
0.08%
25.00
0.00
18.50
18.50
0.04857
0.02%
25.00
0.00
18.46
18.46
0.04836
0.25%
CI2=CNa2S2O3*V/20
相对偏差=|平均值-测量值|/平均值
碘溶液滴定Vc所用体积10.03mlMvc=176.13m（VC）=CI2*V*MVc=85.64mg
样品中VC含量=m（VC）/（样品）=85.64/50=1.7129（mg/g橘皮）
2、金属离子锌含量分析及讨论
样品浓度（mg/L）
0.467
0.934
1.401
1.868
2.335
吸光度
0.1363
0.2030
0.3097
0.3844
0.4377
待测液吸光度
0.1765
由上图，拟合直线方程为：
A=0.1679c+0.0590，则浓度c=（A-0.0590）/0.1679
所以样品中Zn2+含量为：
c=（0.1765-0.0590）/0.1679=0.6998（mg/L）
故T=C*V/m（样品）=0.6998*0.25/50=0.0035（mg/g橘皮）
3、橙皮苷含量分析及讨论
先用3号0.01584mg/ml的样品测紫外吸收光谱，可得，在λ=287.10nm时，Abs为0.3977，
在即最大吸收值，所以λmax=287.10nm。
测得的待测溶液如下图：
λmax=287.10nm
样品浓度（mg/ml）
0.00396
0.00792
0.01584
0.02376
0.03168
吸光度
0.1259
0.2268
0.3977
0.5945
0.7974
待测液吸光度
0.3744
由上图，样品吸光度为0.3743时，样品中橙皮苷的含量为：
c=（0.3744-0.0291）/24.012=0.0（mg/ml）
故T=C*V/m（样品）=0.0144*100*100/10=14.38（mg/g橘皮）
λ=361.9nm
样品浓度（mg/ml）
0.00396
0.00792
0.01584
0.02376
0.03168
吸光度
0.0637
0.1191
0.2384
0.3546
0.4715
待测液吸光度
0.2860
由上图，样品吸光度为0.3352时，橙皮苷含量为c=（0.2860-0.0041）/14.755=0.0191（mg/ml）
故T=C*V/m（样品）=0.0191*100*100/10=19.1（mg/g橘皮）
（4）香精油含量分析及讨论
条件一：
柱温恒温180℃，保留10分钟
有效组分未完全分离，此条件不适合
条件二：
柱温：
60℃，以30℃/min的速度升到180℃，保留0min；
样品分离，分离效果不理想，原因在于程序升温过快
条件三：
柱温：
60℃，以10℃/min的速度升到180℃，保留0min；
样品完全分离，且分离效果较好
由柠檬烯、β-蒎烯、乙酸芳樟酯、芳樟醇的沸点与极性可知，出峰顺序为：
β-蒎烯柠檬烯芳樟醇乙酸芳樟酯。
bbeta-蒎烯=mbeta-蒎烯/V=0.0462*（10/50/50）=1.848*10-4（g/ml）
b柠檬烯=m柠檬烯/V=0.0432*（10/50/50）=1.728*10-4（g/ml）
b芳樟醇=m芳樟醇/V=0.134*（10/50/50）=5.36*10-4（g/ml）
b乙酸芳樟醇=m乙酸芳樟醇/V=0.1672*（10/50/50）=6.688*10-4（g/ml）
提取的精油的GC-FID谱图
成分
β-蒎烯
柠檬烯
芳樟醇
乙酸芳樟酯
标准样峰面积
274914.438
1845531.000
649394.938
1292709.125
标准样浓度（mg/mL）
0.1848
0.1728
0.5396
0.6688
样品峰面积
102769.961
2364683.000
203083.938
36935.277
样品浓度（mg/mL）
0.069
0.2214
0.168
0.0191
橘皮中样品含量（mg/g橘皮）
0.115
0.369
0.28
0.318
六、实验结果
1．橘皮Zn离子的含量为0.6998*0.25/50=0.0035（mg/g橘皮）
2．橘皮中橙皮苷含量为0.0144*100*100/10=14.38（mg/g橘皮）
3．橘皮中维C含量为85.64/50=1.7129（mg/g橘皮）
4．橘皮中β-蒎烯含量为0.115mg（β-蒎烯）/g（橘皮）
5．橘皮中柠檬烯的含量为0.369mg（柠檬烯）/g（橘皮）
6．橘皮中芳樟醇的含量为0.28mg（芳樟醇）/g（橘皮）
7．橘皮中乙酸芳樟醇的含量为0.318mg（乙酸芳樟醇）/g（橘皮）
七、讨论与分析
（1）维生素C含量的滴定：
①由Na2S2O3浓度测定的相对平均偏差可见，其滴定实验结果精密度较高；
②由I2的测定结果及相对平均偏差可见，三次滴定结果相对于Na2S2O3浓度测定时偏大，原因可能由于终点判断不准确、读数不够精准等；
③提取维C过程中，因为是一次性实验，对实验结果有着不可忽略的误差影响，I2浓度测定以及Na2S2O3浓度测定的准确与否也会对实验结果产生影响。
④测定中用的是碘量法，该方法简单方便，但是碘易挥发，见光分解。
在配置碘溶液时，加入了KI，结合成I3-以防止其挥发，分解。
滴定时要控制好滴定速度，多摇动。
快达到终点时。
滴定速度一定要慢。
判断变色点要半分钟内不褪色。
（2）AAS测Zn2+：
①由工作曲线可见，R2=0.9976其线性拟合关系较好，基本符合要求；影响线性的原因主要来至溶液的配置过程，如移取液体、读数的准确程度，溶液是否摇匀以及测定时比色皿装液过程中手法所带来的影响等；
（3）橙皮苷的提取和含量测定：
A，由工作曲线可见，在最大波长（λmax=287.10nm）处，样品的吸光度值在所作曲线的线性浓度范围内，实验结果具有一定的代表性；
B，在非最大波长（λ=361.90nm）处，样品的吸光度值在所作曲线的线性浓度范围之外，说明在361.90nm波长处，提取液试样中存在其他一些可以在此波长范围很好被吸收的物质。
不同分子的原子团和原子，它的发射光谱和吸收光谱不同。
因此可以根据其光谱的特征和强度研究化合物的结构和测定其含量。
本实验中，橙皮苷对光的特征吸收波长在287.10nm处，所以当波长为361.90nm时，溶液中存在着对该波长具有特征吸收的物质。
C，实验采用紫外分光光度计，柑橘提取液中可能有很多物质在最大吸收波范围内重叠吸收，吸光度并不能准确的反映含量，但是如果采用液相色谱进行分析可以将其中的组分全部分离出来，并且通过图谱信息可以得到柑橘皮中橙皮苷的准确含量。
（4）香精油的提取和分析：
①水蒸气蒸馏时，馏出液的速度不能太快，否则馏出液中有效成分含量很少，得到的谱图峰不明显，给后面的分析带来困难；
②加大鲜橘皮的用量、减慢馏出液滴下速度可有效增加有效峰的强度；
③影响香精油产量的主要因素有：
柑橘皮的粉碎程度、水蒸气速率、溶液挥发以及萃取过程中的损失等。
因此在实验过程中可适当加大橘皮的粉碎程度，更有利于香精油被蒸出；加快水蒸气的通入量，增大香精油被提取的动力，但通气量也不宜过大，以免蒸出过多的水，为进一步萃取带来不便，进而影响产率。
（5）在配制Na2S2O3溶液时，要用煮沸后冷却的蒸馏水，这是因为水中含有氧气、二氧化碳和细菌他们会发生反应，反应过程如下：
Na2S2O3→Na2SO3+S↓S2O32-+CO2+H2O→HSO3-+HCO3-+S↓（微生物）
S2O32-+1/2O2→SO42-+S↓
此外，水中微量的Cu2+或Fe3+等也能促进Na2S2O3溶液分解。
因此配制Na2S2O3溶液时，需要用新煮沸（为了除去CO2和杀死细菌）并冷却了的纯水，加入少量Na2CO3，使溶液呈弱碱性，以抑制细菌生长。
而Na2S2O3溶液不宜加热，加热时会加速空气中的氧气氧化Na2S2O3。
。
④通常从柑橘果皮中提取香精油的方法有压榨法、浸提法、水蒸气蒸馏法、超临界流体萃取法。
本实验采用的是水蒸气蒸馏法提取柑橘皮中香精油的。
选择水中蒸馏提取香精油这种方法的优点是设备简单、成本低、产量大、水分子容易向果皮组织中渗透，水置换出香精油，使精油向水中扩散，在水蒸气作用下形成油水共沸物同时蒸出。
水蒸气起到“搅拌”作用。
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