大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺.docx

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大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺

1.提取目的基因:

既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离.

2.提取质粒:

使用细胞工程，培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为环状DNA.

3.基因重组:

取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒.

4.将质粒送回大肠杆菌：

再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如CaCI2，这使细胞会吸收外源基因.

此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收.

5.胰岛素的产生:

再大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻译后，便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素！

『学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA粗提取的

技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法

【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。

、基础知识

【活动1】阅读教材P54“基础知识”，讨论并回答下列问题:

1.（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。

2.（记忆）DNA的溶解性特点:

DNA在不同浓度_NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒

精。

【思考1】据图5-1分析:

DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？

在0.14mol/L时溶解度最小;

要使DNA溶解，需要使用什么浓度？

较高浓度，可使DNA溶解;

要使DNA析出，又需要使用什么浓度？

0.14mol/L可使DNA析出。

【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分

离目的。

3.（记忆）DNA的耐受性特点:

蛋^酶能分解蛋白质而不能分解DNA;在60〜80C时蛋白质变性沉淀而DNA

分子不变性。

洗逢剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。

4.（记忆）DNA的鉴定原理

当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定。

在沸水浴条件下，该试剂与DNA反应，呈现（浅）蓝色。

二、实验设计

【活动2】阅读教材P55“实验设计”，讨论并回答下列问题:

1.（记忆）实验材料的选取：

选取材料时应本着DNA含量高、材料易得、便

于提取的原则。

DNA。

【思考3】你认为教材提供的材料中哺乳动物的血液不适合提取

2.（记忆）破碎细胞，获取含DNA的滤液:

鸡血：

向鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并玻棒搅拌，用纱布过滤后，收集滤液。

洋葱：

向研钵中加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，用纱布过滤后，收集滤液。

【思考4】在以上实验中，蒸馏水的作用是使血细胞大量吸水而胀裂，洗涤剂的

作用是瓦解细胞膜，食盐的作用是溶解DNA物质。

3.（学会）去除滤液中的杂质:

方案一：

30mL滤液-加NaCI使DNA溶解-过滤得滤液-加蒸馏水使DNA

析出-过滤得过滤物-放到2mol/LNaCI溶液中溶解-DNA—NaCI溶

解液

方案二：

30mL滤液-加嫩肉粉（木瓜蛋白酶）-静置10分钟-得DNA滤液

方案三：

30mL滤液-60〜67C处理-过滤得DNA滤液

【思考5】以上三个方案的原理分别是什么?

【思考6】方案一中：

“加NaCI使DNA溶解-过滤得滤液”的目的是除去不溶

（可溶、不溶）于NaCI溶液中的细胞杂质；“加蒸馏水使DNA析出-过滤

得过滤物”的目的是除去可溶（可溶、不溶）于NaCI溶液中的细胞杂质。

4.（记忆）DNA的析出:

DNA滤液与等体积冷却酒精混合，静置一段时间后析出的白色丝状物就是

DNA。

5.

（记忆）DNA的鉴定:

沸水浴5min,观察颜色变化，甲试管呈现蓝色。

三、操作提示

注意事项:

1在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心后除去血浆，以提高细胞

悬液浓度。

2.实验中使用塑料烧杯和尼龙布，以免DNA被吸附。

3•玻棒沿同一方向缓慢搅拌（细胞破裂时快速搅拌），玻棒不要碰到烧杯壁。

4•二苯胺试剂要现用现配。

5•为提高DNA纯度，实验中通常使用的洗涤剂有CTAB、SDS等。

【活动4】观看视频：

观看“DNA的粗提取与鉴定”视频，体会并学会相关技

术方法。

『课后学习〗

1尝试从植物组织中提取DNA分子。

2.基础训练册：

将基础知识整理到作业本上；完成该节训练题。

［学习要求〗

尝试PCR技术的基本操作，体验PCR技术的分子生物学实验方法；理解PCR技术的原理；讨论PCR技术的应用

【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。

、基础知识

【活动1】阅读教材P58“PCR原理”，讨论并回答下列问题:

1.（记忆）PCR技术扩增DNA的过程与细胞内的DNA复制过程类似。

【思考1】填写下表：

（记忆）细胞内DNA复制条件分析

条件

参与的组分

在DNA分子复制中的作用

模板

DNA的两条单链

提供复制的模板

原料

四种脱氧核甘酸

合成DNA子链的原料

酶

解旋酶

打开DNA双螺旋

RNA聚合酶

合成RNA引物

DNA聚合酶

催化合成DNA?

链；切除引物

DNA连接酶

将不连续的DNA子链连接起来

能量

ATP

为解螺旋和合成子链提供能量

引物

RNA

为DNA聚合酶提供合成的3'端起点

2.（理解）细胞内DNA的复制

（1）DNA的结构：

脱氧核苷酸分子通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链,

两条脱氧核苷酸长链反向平行排列并螺旋化，形成DNA双螺旋结构。

⑵DNA的复制：

首先，在解旋酶的作用下，由ATP供能，DNA发生解旋形

成两条DNA单链。

其次，在DNA单链的31端，在RNA聚合酶在作用下,

合成RNA引物。

再次，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3'端开始合成

DNA子链。

最后，DNA聚合酶将引物切去，并合成空缺处DNA单链，再

由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来。

性。

性。

复制条件:

缓冲液，DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种

引物。

控制仪器：

PCR仪（温度周期性自动调节仪）。

【思考2】缓冲液相当细胞内的什么成分？

核液。

【活动2】阅读教材P59“PCR的反应过程”，讨论并回答下列问题:

1.（记忆）填写PCR反应流程:

II~HI—H

—~T

2.（理解）PCR反应过程是：

在升温至90C以上时DNA解旋；在降温至50C

左右时引物与DNA单链结合；在升温至72C左右时合成DNA子链。

二、实验操作

【活动3】阅读教材P62“实验操作”，讨论并回答下列问题:

种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物、水。

体系50丄用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；将微量离心管放到

PCR仪中；设置PCR仪的工作参数;DNA在PCR仪中大量扩增。

处理。

三、操作提示

【活动4】阅读教材P62“操作提示”，讨论并回答下列问题:

菌。

四、结果分析与评价

【活动4】阅读教材P63“结果分析与评价”，讨论并回答下列问题:

1.（记忆）反应液稀释：

取2?

LPCR反应液，添加98?

L蒸馏水。

2.（记忆）分光光度计调零：

将100?

L蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将

分光光度计读数调节为零。

3.（记忆）将100?

L反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。

4.（记忆）DNA含量计算：

DNA含量（？

g）=50X光吸收值X稀释倍数。

【活动4】观看视频：

观看“多聚酶链式反应扩增DNA片段”视频，学会相关

技术方法。

『课后学习〗

1•尝试从植物组织中提取DNA分子。

2•基础训练册：

将基础知识整理到作业本上；完成该节训练题。

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