基因工程实验教学教案.docx
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基因工程实验教学教案
基因工程实验
教学方案
湖南人文科技学院生命科学系
生物技术教研室
指导教师:
吴娟
实验一重组质粒的提取及转化表达型菌株
Ⅰ质粒DNA的提取
实验目的
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术与方法。
实验原理
1.碱变性法基本原理是,在Ph12.０-１２．6碱性环境中,线性的大分子量细菌染色体DＮA变性,而共价闭环质粒ＤNA仍为自然状态。
将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DＮA仍为可溶状态,通过离心可除去大部分细胞碎片,染色体DNＡ,RNA及蛋白质,质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿或硅基质膜柱子进一步纯化DNA。
2．设计构建体外重组DNA分子
构建体外重组ＤＮＡ分子,首先要了解目的基因的酶切图谱。
选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有识别位点，也就是说用一种或两种限制性内切酶就能切割得到完整的外源ＤNA基因。
构建体外重组ＤＮA分子,最简单的重组方式就是在目的基因DＮA的两端用两种不同的限制性内切酶进行酶解,产生两个不同的粘性末端。
再用这两种限制性内切酶去选择合适的载体进行酶切，也产生这两个不同的粘性末端，这样构建的重组DNA分子，目的基因DNA片段是从一个方向插入质粒载体中的,重组的效率高,也易于筛选处重组子。
附表达载体pGEX－6P-1－mreB的构建图：
仪器材料与试剂
（一）仪器
1.恒温摇床
2.台式离心机
3．漩涡混合仪
（二）材料与试剂
１.含pＧEＸ-mreB质粒的大肠杆菌DＨ5α
2.含pGEX质粒的大肠杆菌DH５α
３.液体LＢ培养基
4.１００mg／ｍL氨苄青霉素Amｐ
５.新捷质粒提取试剂盒
实验步骤
分为两组:
一组提取质粒pGEＸ-mreB，另一组提取质粒pGEX。
１）12０00rmｐ离心30秒收集1－5ml过夜培养的细菌，弃尽培养基。
加入2５0ｕｌ已加入RnａsｅＡ的BｕfferⅠ,充分悬浮细菌沉淀。
2）加入２50ul Buffｅr Ⅱ,温和并充分地翻转离心管4-6次。
3）加入３50ulＢufferⅢ，温和并充分地翻转离心管4-6次。
4）13000rｍp离心10分钟。
5）将核酸纯化柱置于2ml离心管中,转移步骤4中的上清液到核酸纯化柱中,盖上管盖，1２000rmp离心3０秒。
６）弃2mｌ离心管中的滤液,将核酸纯化柱置回到２ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700ulBufferW2,盖上管盖,１2000rmp离心30秒。
7）弃２ml离心管中的滤液,将核酸纯化住置回到２ｍｌ离心管中，14000rmp离心1分钟。
８）弃２mｌ离心管,将核酸纯化住置于一个洁净的1．５ｍl离心管中,在纯化柱的膜中央加入50-１00ulBufｆerＴＥ，盖上管盖,室温静置１分钟，１２０００ｒｍp离心3０秒。
9）弃纯化柱，洗脱的质粒可立即用于各种生物学实验，或储存于-2０℃。
实验结果
实验安排
3个小时
Ⅱ 质粒ＤNA的转化
实验目的
通过本实验,掌握大肠杆菌转化的方法与技术。
实验原理
细菌处于容易吸收外源DＮA的状态称感受态。
转化是指质粒ＤNA或以其为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是细菌处于0℃、CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNＡ形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸DNA复合物粘附于细胞表面，经４2℃短时间热激处理，促进细胞吸收DＮA复合物。
将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型（如Ａmpr等）得到表达，然后将此细胞培养物涂在选择性培养基上。
E.cｏｌiDＨ5α是一种用于质粒克隆的菌株。
E.cｏli BL21是一种适合于外源蛋白表达的菌株，其内源性的蛋白酶基因缺失。
仪器材料与试剂
（一）仪器
1.超净工作台
2.恒温摇床
3.制冰机
4.高压灭菌锅
（二） 材料与试剂
1.大肠杆菌Bl21感受态细胞
2．质粒ＤNA：
ｐGEX－mreB、pGEX。
3．固体LB培养基平板（含Ａmｐ120ug/ml）
实验步骤
分为两组：
一组加入质粒ｐGＥX－mｒeＢ，另一组加入质粒pGＥＸ。
1．取1０0ｕｌ新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ｕｌ混匀,冰上放置30min。
同时做一个对照管，仅加入100ul感受态细胞，不加质粒。
2.将管放到42℃热激９０ｓ。
3.冰浴2mｉn。
4.每管加400ulＬＢ液体培养基，37℃培养1h（1５0r/min）
５.将适当体积（200ul）的复苏细胞，涂布在含有氨苄青霉素的ＬＢ培养皿中,正置平皿3０min。
6．倒置平皿3７℃培养12-１6h,出现菌落。
实验结果
实验安排
这整个大实验从质粒提取到转化需一天,第二天早晨观察结果。
实验二外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测
Ⅰ外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
实验目的
通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。
实验原理
将外源基因mreB克隆在含有Tac启动子的表达载体pGEＸ中,让其在Ｅ．coｌi中表达。
先让宿主菌生长，lａcI产生的阻遏蛋白与ｌaｃ操纵基因结合,从而不能进行外源基因的转录及表达,此时宿主菌正常生长。
然后向培养基中加入ｌac操纵子的诱导物IPＴG（异丙基-β－Ｄ-硫代半乳糖苷）,阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。
表达蛋白可经ＳＤS-PAGE进行检测,或做蛋白质印迹，用抗体识别表达蛋白。
Tａc启动子:
Ｔac启动子是一组由Lac和ｔrp启动子人工构建的杂合启动子,受Lac阻遏蛋白的负调节,它的启动能力比Lac和trp都强。
其中Tａc1是由Trp启动子的-35区加上一个合成的４6bpDNA片段（包括Ｐribnow 盒）和Lac操纵基因构成，Taｃ12是由Trp的启动子－35区和Lac启动子的-10区,加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。
Ｔac启动子受ＩＰTG的诱导。
仪器材料和试剂
（一）仪器
1.恒温摇床
2.离心机
3.超净工作台
4.分光光度计
（二）材料与试剂
1．含pGEＸ-6P-1-mreB表达质粒的表达菌株E.coliBL２1（DE3）plｙｓS
2.含pGEX－6Ｐ-1表达质粒的表达菌株E.cｏliＢＬ21（DE３）ｐlysS
2.液体ＬB培养基
3.100mg/mL氨苄青霉素Amp
４.１mol／LＩＰTG
实验步骤
1.挑取一含有pGEX-6P-1－ｍｒeB表达质粒的单菌落到1.5mL含有10０μg/mLＡmｐ的液体LB培养基中，37度摇12小时。
2.挑取一含有ｐGEX-6P-1表达质粒的单菌落到1．5mL含有100μg/mLAmp的液体LＢ培养基中,37度摇１2小时。
（这是不含目的基因仅含载体的对照）。
3.将培养的菌液1mL接种于 200mL含有100μg/mLＡmp的液体LB培养基中,３7度摇至A6000．6。
4.向其中一瓶加入IPＴＧ至终浓度0.4mｍol／L，另一瓶不加（对照），转至２8度诱导过夜。
5. 80００r／min离心收集菌体细胞沉淀,四种类型分别做好标记,-２０度保存。
注（四种类型分别为：
ｐGEX-6Ｐ-1－ｍreＢ转化菌诱导，ｐＧEＸ－6P－１－ｍrｅB转化菌 未诱导，不含目的基因的ｐGＥX-６P-1转化菌 诱导,pGＥX－6P-１转化菌未诱导。
）
ⅡSDS-PAGＥ检测表达蛋白
实验目的
通过本实验了解和掌握SDS－PAGE检测蛋白的基本原理和操作。
实验原理
SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂,在溶液中能与蛋白质分子的疏水部分定量结合,把大多数蛋白质拆成亚单位，并带上阴离子。
这些阴离子掩盖了蛋白质分子本身所带的电荷差异，所以ＳDS-ＰAGE消除了电荷效应，只有分子筛效应故蛋白质电泳迁移率完全取决于相对分子质量，迁移率与相对分子质量对数呈线性关系,在电场下，按相对分子质量大小在板状胶上排列。
仪器材料和试剂
（一）仪器
1．垂直板电泳槽及配套的玻璃板、封胶条、梳子
2.恒压恒流电泳仪
3.脱色摇床
（二）材料与试剂
PBS缓冲液
2×LaｅmmLi样品缓冲液：
100mmol/ＬTｒis-HＣｌ（pH6.８），4％SＤS,0.02%溴酚蓝,２０%甘油，临用前加入1００μＬ巯基乙醇到９00μL上样液中。
30%丙烯酰胺储液:
丙烯酰胺：
甲叉双丙烯酰胺＝29：
１ （W/W）,置于棕色瓶中于4℃，隔几月需重配。
分离胶缓冲液：
1．５ｍol/L Triｓ-ＣlpＨ8.8
浓缩胶缓冲液:
1ｍｏl/LTris－ClｐH６.8
１0%ＳDＳ（W/V）（十二烷基硫酸钠）
10％ＡPＳ（W/V）（过硫酸胺）：
取0.1gＡPS定容至１mL，少量配制,隔周新配。
电泳缓冲液:
３.03ｇＴris-ｂase，1４.4gＧlｙcine，1ｇ SDS，加蒸馏水至1L。
固定液:
40％乙醇，10％乙酸
Bluｅsilvｅr染色液:
０.12％考马斯亮蓝G-250，10％（NH４）2SO4，10%H3ＰO4，２0%甲醇。
实验步骤
1.
（1）按上述方法诱导的菌，离心收集菌体，用PBS悬浮菌体；
（2）超声破碎细胞,12,000 r／min离心分离上清和沉淀;
（3）上清和沉淀与2×上样缓冲液1:
１混匀,并在100℃水浴中煮10miｎ，取出待用。
（４）上清和沉淀分别跑ＳDＳ-PAGE，观察目的蛋白处于哪个组分，若在上清中则为可溶性表达，若在沉淀中则为包涵体。
2.配置1２%分离胶
双蒸水
分离胶缓冲液
３０%胶贮液
10％SDS
ＴEMＥD
10%AＰ
2.５6mL
2．0８mＬ
3.2mL
８0uＬ
uＬ
8０uL
（1）把玻璃板放入制胶架上，架好胶板,用琼脂封底。
（2）按如下比例配好分离胶，混匀后立即加入到两玻璃板之间,到上口大于梳子插入的长度止，再加一层异丙醇,约3０ｍiｎ等胶自然凝聚后倾斜倒出异丙醇，并用蒸馏水洗三次，倒干净蒸馏水。
3.配置4%的浓缩胶
双蒸水
分离胶缓冲液
30%胶贮液
10%SDＳ
ＴEＭED
１0%ＡP
2.8mＬ
0．５mL
0.6６mL
4０uL
ｕL
40uL
混匀后立即加到分离胶上,在两玻璃板夹缝中水平插入1.５mm的梳子,用琼脂封住梳子两端。
聚合后，把玻璃板放入电泳槽中，装好电泳缓冲液后小心拔出梳子。
4.丄样、电泳:
将样品和标准蛋白分别加到样品孔中开始电泳,先恒压80V，样品进入分离胶后恒压120Ｖ，直至溴酚蓝走至前沿为止。
5．固定染色：
电泳完毕，将胶板从电泳槽中取出,小心从玻璃板上取下凝胶，将凝胶在固定液中固定30ｍin，用蒸馏水洗三次,每次1０min,再将凝胶在染色液中染色2h。
实验结果
实验安排
第一天晚上挑菌落预培养
第二天:
诱导表达
第三天：
制胶，跑SDS－PAGＥ电泳检测。
实验三蛋白质印迹
实验目的
通过本实验了解蛋白质印迹的方法和操作要点。
实验原理
印迹法一般由:
凝胶电泳;样品的印迹和固定化；各种灵敏的检测手段如抗原抗体反应等三大实验部分组成。
1.生物大分子凝胶电泳分离:
蛋白质印迹法的第一步一般是将蛋白质进行SＤS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－ＰAＧE）,使待测蛋白在电泳中按分子相对质量大小在板状胶上排列。
2.分子区带的转移和固定：
第二步就是把凝胶电泳已分离的分子区带转移并固定到一种特殊的载体上,使之形成稳定的、经得起各种处理及容易检出，即容易和各自的特异性配体结合的固定化生物大分子。
现用的最多的载体材料是ＰVDＦ聚偏氟乙烯膜，它们和生物大分子是非共价结合的。
3.特异性谱带的检出:
印迹在载体上的特异抗原的检出依赖于抗体抗原的亲和反应。
即将酶、荧光素或同位素标记的特异蛋白分别偶联在此特异抗体的二抗上,再分别用底物直接显色、测荧光、放射自显影等方法检测我们感兴趣的抗原，考虑到如果无合适抗体用来检测抗原时，可用一般的蛋白染料，如丽春红，检测转移到膜上的蛋白，验证转移是否成功。
ⅠSDS-ＰAGE（见实验二Ⅱ）
Ⅱ电转移
仪器材料与试剂
（一）仪器
1.电泳仪
2.半干式转移电泳槽
3.脱色摇床
4.恒温振摇器
（二）材料与试剂
１．电转缓冲液：
４8mｍｏl/LＴriｓ-HCl，３9mmoｌ/LＧLｙ，０.0３１％SDS，20％甲醇。
2.TBS缓冲液（pＨ ７.5）:
0.02ｍol/LTrｉs－HCl，０.5mol／LNaCl。
3.ＴTBS缓冲液（pH7．5）：
在TＢS基础上再加入０.０５％（v／ｖ）Twｅen-２0。
4．封闭液:
含5％（W/V）脱脂奶的ＴTBS缓冲液。
5.ＰVDF膜
6.DAB染色试剂盒
7.山羊抗小鼠IgG－HRP
8．抗MreB-GＳＴ多克隆鼠抗
实验步骤
1.电泳结束后,取出凝胶，切角做标记，浸泡于电转缓冲液中。
2．剪取与凝胶等大的PVDF膜，在甲醇中浸泡1０s,再转至电转缓冲液中。
取6张与海绵等大的滤纸和转移装置中的海绵浸泡于电转缓冲液中备用。
3．将3张滤纸整齐置于海绵上,再依次放上凝胶、PVDF膜、滤纸（３张）,注意赶尽气泡,边界对齐,然后用海绵、筛孔板固定，插入电转移槽中,并加入电转移缓冲液，保证凝胶在阴极方向，ＰVDF膜在阳极方向。
１０0V电转１.5h。
4．取下胶和膜，倒扣于滤纸上,用铅笔在膜上描出胶上点样孔位置,揭去胶，取下膜。
Ⅲ特异性普带的检出
实验步骤
1．封闭：
将膜从电转槽中取出，TBＳ稍加漂洗，浸没于封闭液中３7℃缓慢摇荡2h。
2．结合一抗：
一抗用含4%脱脂奶粉的TTBS按适当比例稀释。
倾去封闭液,加入一抗,室温（25℃）轻摇１ｈ；
3．洗涤:
一抗孵育结束后,用TTBS洗膜三次，每次5-10min。
4．结合二抗:
二抗按1:
８000用含４%脱脂奶粉的TTBS稀释,室温轻摇１h。
5．洗涤:
同步骤（3）
6．用DAB显色液显色,到显色清晰时,用蒸馏水终止反应。
实验结果
实验安排
第一天：
制好SDS-PＡGE胶置于冰箱4℃。
第二天:
ＳDS-PAGE,电转移，封闭
第三天：
杂一抗，杂二抗,显色。
图3．融合蛋白表达纯化的SDS-ＰAGＥ分析
Fｉg３.EｘｐｒessionAnａｌｙsｉｓofGST-ｔａｇｇeｄpｒoｔｅiｎｓbyＳＤS-PAGE
M：
蛋白质分子量标准
１、2:
分别为pGEＸ-6Ｐ－１转化菌诱导前、后总蛋白;
3、4:
分别为pＧEX－6P-1-mｒｅB转化菌诱导前、后总蛋白;
5、６：
分别为转化菌菌体裂解物上清、沉淀；
7：
割胶纯化后的ＧＳＴ-MｒｅB
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