分子生物学大题.docx

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分子生物学大题

分子生物学大题

一、基因与基因组

1.鉴别蛋白质编码基因的五项标准:

（1）.开放阅读框（openreadingframe,ORF）:

是始于起始密码子并终于终止密码子的一串密码子。

;

（2）.序列特征——密码子偏爱和剪接点;（3）.序列保守性;（4）.转录产物:

寻找基因的表达产物——RNA或蛋白质.;（5）.基因失活。

2.真核生物基因组特点:

（一）分子量很大的DNA与蛋白质形成染色体存在于核内。

（二）转录与翻译不同步，转录产物为单顺反子，功能相关基因分散排布，无操纵子结构。

（三）基因组存在高比例的非编码序列（noncodingsequence,NCS）,NCS可作进化标尺。

（四）大量重复序列（repeatsequence）存在。

（五）基因多为不连续的，被插入序列（IS）所分隔（这种现象称为断裂基因（splitgene）.断裂基因由内含子（intron）（非编码序列）和外显子（exon）（编码序列）交替组成。

（六）功能相关基因构成各种基因家族

3.重复顺序的功能：

1）编码某些重要的功能性蛋白、rRNA、tRNA等;2）与染色体构象、着丝粒形成有关;3）参与基因的表达调控.分类：

1）倒位（转）重复顺序：

指两互补顺序呈反向排列，形成回文结构或发夹状结构；2）串连重复顺序：

由相同的核心顺序（2~70bp）成串（头尾相接）排列而成的高度重复顺序。

3）散在重复顺序。

4.人类基因定位的基本方法:

（1）.家系分析法——发现感兴趣的基因。

通过分析统计家系中有关遗传性状的连锁情况和重组率而进行基因定位的方法。

;

（2）.体细胞杂交——初步的基因定位;（3）.核酸杂交技术——精确的基因定位。

克隆基因定位法；原位杂交法；原位PCR；定位克隆技术。

5.基因论：

1）相引是两个基因位于同一染色体上，相斥则反之；2）同源染色体在减数分裂时发生交换；3）位置相近的因子相互连锁。

6.HGP的主要成果——四张图：

1）遗传图:

第一代遗传标记是RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性酶切片段多态性）;第二代遗传标记是STR（shorttandemrepeat，简短串连重复序列），6000个标记;第三代遗传标记是SNP（restrictionfragmentlengthpolymorphism，单核苷酸多态性），不再是分析长度，而是直接测序

2）物理图:

以一段已知序列的DNA片段（STS，sequencetaggedsite，序列标记位点）并有染色体定位为路标，以Mb或Kb为图距的基因组图。

3）转录图又称表达序列图或cDNA图的路标:

是以部分5’端或3’端cDNA序列（即表达序列标签，EST）为路标，根据表达顺序的位置和距离作图

4）序列图：

测定总长约30亿个核苷酸组成的全染色体序列。

7.五大模式生物：

E.coli、酿酒酵母、黑腹果蝇、秀丽线虫和小鼠，其序列分析被列为HGP的内容；

8.DNA多态性及其意义：

DNA多态性:

除同卵双生的两个体外，没有两个人的DNA组成是完全相同的，即人类DNA组成具有多态性。

如果比较随机的十个人的常染色体的非编码区,就会发现约200~400bp就有一个核苷酸不同,这些可变区域即称为DNA多态性（DNApolymorphism）位点。

DNA多态性标记的价值：

1）为路标，构建DNA标记的遗传连锁图谱;2）使遗传图谱从直接可见的表型多样性标记进步到DNA分子本身多态性标记。

DNA多态性的种类：

1）DNA位点的多态性；2）串连重复顺序多态性；3）单核苷酸多态性

二、细胞凋亡

1.细胞凋亡与细胞坏死的区别:

项目细胞凋亡细胞坏死

诱导因素生理性、弱刺激性强烈刺激

细胞数量单个细胞丢失成群细胞死亡

膜完整性保持至晚早期即丧失

染色质凝聚呈半月状稀疏呈网状

细胞核早期固缩、断裂晚期破碎

细胞器无明显变化肿胀、破坏

胞内容物无释放释放

细胞形状形成凋亡小体破裂成碎片

基因组DNA受调控降解随机降解

大分子合成一般需要不需要

基因调控有无

后果不引起炎症反应引起炎症反应

意义生理性死亡病理性死亡

2.细胞凋亡的生物学意义：

1）具有清除个体发育过程及成熟个体中多余细胞及老化细胞的机体调节作用；2）具有消除对机体有害的癌变细胞及病毒感染细胞的机体防御作用。

细胞凋亡是维持个体生存所必需的一种生物学机制。

3.Caspase的性质和种类：

Caspase即天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶。

1）已在哺乳类中发现14种，分为3个亚类：

Caspase-1亚家族，Caspase-2亚家族，Caspase-3亚家族；2）根据前体分子（procaspase）N端的原结构域（prodomain）分为2类:

启始分子（initiator）,如-8、-9、-10等，为蛋白酶级联反应的启始者，其活化后再切割和活化下游Caspase；效应分子（effector）,如-3、-6、-7等，作为上游酶的底物被切割活化，再作用于多种蛋白质或酶，促使细胞凋亡。

4.效应caspase引起细胞凋亡的机制：

1）灭活细胞内凋亡抑制蛋白：

非凋亡细胞中,CDA（caspase活化的DNAase）与其抑制蛋白（ICDA）结合;凋亡细胞中,caspase剪切ICDA;CDA游离并进入核内降解DNA,细胞凋亡.2）剪切细胞结构蛋白：

如Caspase对核板的降解作用;在凋亡过程中,caspase在单一位点剪切核纤层蛋白（lamin）,导致核板塌陷,染色质浓缩.3）剪切效应蛋白:

如参与基因表达蛋白因子,如PARP；4）活化caspase抑制剂。

5.细胞凋亡的信号传递通路的特点:

（1）.同一性：

各种因素引起的凋亡的形态与生化改变均相同。

（2）.多样性：

环境因素不同，细胞类型不同，或刺激因素不同时，从凋亡程序启动到凋亡发生，其信号传递途径是不同的。

（3）.分类：

百余种凋亡调控因子，正逐渐被组装成一条条的信息传导通路，可分为基本传导通路和非专一性传导通路二类。

6.细胞凋亡的信号传递途径:

（1）死亡受体介导的细胞凋亡;

（2）线粒体相关蛋白的凋亡诱导途径：

线粒体跨膜电位（Δψm）的下降，线粒体膜通透性转运孔（MPT）破坏或开放，开放的后果是，Δψm下降、氧化磷化脱偶联、GSH耗竭、ROS产生等，并形成恶习性循环。

;（3）细胞核凋亡诱导途径;（4）粒酶B介导的细胞凋亡：

CrB由CTL分泌进入靶细胞胞浆后,其丝氨酸蛋白酶在胞浆pH7.0条件下发挥最佳活性，切割胞浆和核中的多种底物；Caspase依赖的死亡通路是CrB介导细胞死亡的重要途径之一。

7.P53蛋白的调控作用：

自N端起包括：

转录活化区、DNA结合区、四聚体化区和C-调节区；

1）P53的表达与活性调节。

正常状态下：

胞浆P53水平很低，半衰期很短；胞内P53被严格监控，受HDM2的负反馈调节，并通过泛素降解途径调节P53水平。

异常情况下：

当细胞DNA损伤、纺锤体丝断裂、癌基因异常表达等细胞生存面临威胁时；P53水平迅速升高和活化；

2）P53对细胞凋亡和细胞周期的调节作用：

野生型P53蛋白具维持细胞生长、抑制恶性增殖的作用；P53蛋白作为“基因警卫”负责维持基因组的完整性、DNA损伤修复和细胞周期的正常运转；如果损伤不能修复，P53就激活那些诱导凋亡的基因表达，使细胞进入凋亡状态。

突变型P53蛋白：

丧失抑制细胞恶性增殖功能，p53基因突变是50%以上肿瘤逃逸凋亡的重要原因;并且本身具有癌基因功能。

8.Bcl-2家族的功能:

（1）属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，但对细胞周期和分化无影响.

（2）阻止或减少各种刺激引起的细胞损伤。

如Bcl-2能阻止由r射线和多种化疗药导致的细胞凋亡。

（3）Bcl-2蛋白具抗氧化作用;（4）Bcl-2蛋白抑制细胞器内Ca2+离子向胞质释放，而凋亡必须有Ca2+离子参与。

9.bcl-2家族成员：

1）抑制凋亡：

bcl-2，bcl-xL，Mcl-1。

2）促进凋亡：

bax，bcl-xs，bad。

10.Bcl-2家族对细胞凋亡的调节机制:

（1）Bcl-2、Bax和Bcl-x组成一个凋亡调控系统;

（2）当Bax/Bax同源二聚体形成时，便诱导细胞凋亡；（3）.随bcl-2表达量增加，渐多的Bax/Bax解聚，形成更稳定的Bax/Bcl-2异源二聚体，从而中和了‘Bax/Bax’诱导凋亡的作用。

即Bax和Bcl-2比值调节凋亡；（4）当Bcl-xs存在时，优先形成Bcl-xs/Bcl-2，使Bax/Bax形式保留，诱导细胞凋亡。

11.原位末端标记技术（insituend–lableing,ISEL）：

原理:

ISEL的原理是基于细胞凋亡时，DNA断裂，利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）或DNA聚合酶将带有生物素标记的核苷酸（biotin-16-dUTP）掺入到断裂的DNA的3’端，再使其与带有辣根过氧化物酶的抗生物蛋白结合，经DAB显色后，便可观察到细胞内是否存在DNA片段端存在。

主要方法有2种:

1）.TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）；2）.DNA聚合酶I或klenow大片段介导的原位的缺口平移（ISNT）。

该法特异性和敏感性较高，可检出早期的凋亡细胞.

12.与细胞凋亡减少有关的疾病：

1）.癌症；2）.自身免疫性疾病，红斑浓疮，免疫介导的肾小管肾炎。

3）.病毒感染

与细胞凋亡增加有关的疾病：

1）.AIDS；2）.神经退行性病变，帕金森病，老年痴呆；3）再生性障碍贫血；4）.缺血性损伤，心肌梗塞，脑卒中，再灌注损伤；5）.酒精肝

13.细胞凋亡自身免疫性疾病：

正常情况下：

1）90%以上的淋巴细胞在胸腺内发育都会发生凋亡，那些能识别自身抗原的细胞都应被清除，确保被选择生存下来的淋巴细胞不至于对自身抗原产生免疫应答；2）如果这种选择性清除失败，在靶细胞存在下，淋巴细胞被激活，产生大量的效应细胞攻击靶细胞，导致发生自身免疫性疾病。

发病的分子机制：

1）淋巴细胞中调节细胞凋亡的一个关键分子是细胞表面受体Fas（又称APO或CD95），Fas受体与FasL（配体）结合即可激活凋亡信号传导途径，细胞凋亡；2）T细胞表面受体Fas和FasL发生突变时，T细胞不能发生正常凋亡，导致自身免疫性疾病。

3）除系统性红斑狼疮外，还证实类风湿性关节炎、自身免疫性糖尿病、牛皮癣均与淋巴细胞凋亡敏感性改变（Fas和FasL突变）有关。

14.细胞凋亡病毒性疾病：

病毒的溶解性感染所产生的细胞病变变作用与引发细胞凋亡有关；而病毒的持续性感染与病毒抑制细胞凋亡有关。

1）病毒感染引发细胞凋亡：

牛疱疹病毒、鸡白血病毒和HIV等，均能通过诱导细胞凋亡而引起宿主细胞缺失。

如HIV感染后引起CD4+T细胞凋亡而缺失。

2）病毒感染抑制细胞凋亡：

许多病毒具有抑制细胞凋亡的机制，有利于建立持续感染、延长病毒复制时间、以最大限度产生子代病毒。

如EB病毒产生LMP-1，使Bcl-2基因上调；牛痘病毒产生crmA,可抑制由caspase所介导的细胞凋亡。

15.细胞凋亡与肿瘤：

肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常疾病，同时也是细胞凋亡异常疾病。

1）大多数肿瘤P53突变、而有些肿瘤过度表达Bcl-2蛋白，这些可有效地以避免细胞凋亡发生。

2）P53蛋白作为“基因警卫”负责维持基因组的完整性、DNA损伤修复和细胞周期的正常运转。

如果损伤不能修复，P53就激活那些诱导凋亡的基因表达，使细胞进入凋亡状态。

3）Bcl-2属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命。

三、细胞周期调控：

1.细胞周期：

1）间期：

G1期（合成前期）；S期（DNA合成期）；G2期（合成后期）。

2）分裂期：

前期；中期；后期；末期。

2.细胞周期调控的主要分子机制：

细胞周期引擎——异二聚体蛋白激酶复合体，包括二个亚单位：

1）调节亚单位：

细胞周期蛋白，其浓度随细胞周期不断变化，不仅起激活CDK的作用，还决定了CDK何时、何处、将何种底物磷酸化；2）催化亚单位：

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK），单独存在时无活性，与cyclin结合才具有蛋白激酶的活性。

参与细胞周期调控的分子：

1）异二聚体蛋白激酶复合体；2）生长因子；3）泛素与APC：

泛素由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素；泛素相当于蛋白质被摧毁的标签。

4）周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）

3.细胞周期的运行：

1）细胞周期的启动（G0→G1）；2）DNA复制（G0→S）；3）进入M期（G2-M）；

1）细胞周期的启动：

细胞在生长因子的刺激下，CyclinD表达，与CDK4、CDK6结合而活化激酶下游蛋白质磷酸化促进基因的转录

2）DNA复制：

CyclinE与CDK2结合-S-CDK触发前复制复合体（pre-RC）启动，同时阻止DNA再次进行复制.

3）进入M期（G2-M）：

CyclinA、CyclinB与CDK1结合，形成M-CDKCDK-Cyclin能够积累CDK1使底物蛋白磷酸化细胞分裂.

4.检验点由感受异常事件的感受器、信号传导通路和效应器构成，主要检验点有4个：

1）G1/S检验点:

在哺乳动物中称R点（restrictionpoint），控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：

DNA损伤？

细胞外环境适宜？

细胞体积足够大？

2）S期检验点：

DNA复制是否完成？

3）G2/M检验点：

是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：

DNA损伤？

细胞体积足够大？

4）中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：

任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会抑制APC的活性，引起细胞周期中断。

四、蛋白质分离纯化

1.蛋白质的含量测定方法：

1）紫外光谱（A280）吸收法：

色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近。

大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。

注意事项：

石英比色杯；调零所用溶液；配制标准蛋白所用溶液；光密度范围。

2）Bradford检测法：

考马斯亮蓝G-250在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。

蓝色复合物在595mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595mn的光吸收值大小计算蛋白的含量。

缺点：

对各种纯化蛋白质反应不同；这种测定方法对蛋白质引起不可逆的变性。

注意事项：

标准曲线在2.5ug～15ugBSA浓度范围内保持线性关系；反应10～15min后开始出现沉淀，尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条件下易发生沉淀；若选用目的蛋白来做标准曲线或用另一种方法来校正，所测蛋白浓度较准确。

3）Lowry检测法：

在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin-酚试剂），产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在745～750nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅（吸收值）与蛋白质浓度成正比，可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量。

缺点：

干扰物质多；反应速度慢；某些试剂不稳定；使蛋白质发生不可逆变性。

注意事项：

在加入试剂30min后呈色达到饱和，时间延长颜色信号减弱；许多干扰物质降低颜色反应；高盐浓度可引起沉淀。

4）BCA（二喹啉甲酸）检测法：

改进的Lowry测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质的影响。

原理：

在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。

而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562nm处有高的光吸收值。

颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量。

注意事项：

与Lowry相比，采用BCA法时，如果样品中含有脂类物质将明显提高光吸收值；为促进BCA法的反应进程，可将样品适当加热。

2.经典的细胞蛋白质分离纯化流程由下述主要步骤组成：

（1）.清洗组织或细胞;

（2）.裂解细胞;（3）.离心除去膜组分等获得可溶性蛋白质;（4）.离心、层析、电泳等进一步纯化;（5）.获取产物蛋白。

3.包涵体的成份：

包涵体是表达蛋白非天然形式的混合物，包括目的蛋白、宿主细胞蛋白及膜蛋白片段，DNA、RNA和质粒编码蛋白以及LPS。

4.包涵体的形成原因：

表达蛋白不适当的中间折叠体高浓度聚集在一起形成的不溶物。

5.影响包含体形成的因素：

除分子伴侣和折叠酶外；还与蛋白质本身的性质（形成转角的残基数目及平均带电性等）和生长条件（宿主、培养温度、培养基和pH等）有关。

6.防止包涵体形成：

降低细胞生长温度；共表达分子伴侣；改变渗透压；融合蛋白

7.包含体中蛋白质的提取：

用变性剂使之成为可溶性的伸展的肽链，然后再在适当的条件下复性折叠成天然的、有活性的蛋白质分子。

8.分离纯化细菌包涵体蛋白的基本步骤：

破碎细胞-分离包涵体-溶解包涵体（用6～8mol/L或9～10mol/L尿素或pH2.0～4.5酸性溶液）-蛋白质产物的构型复原

9.影响电泳迁移率的主要因素：

（1）带电颗粒的性质：

即净电荷数量、颗粒大小及形状;

（2）电场强度：

指每厘米的电位降，也称电位梯度，或电势梯度;（3）溶液的pH值：

决定带电颗粒的解离程度，亦即决定所带净电荷的多少;（4）溶液的离子强度：

影响电动电位，缓冲液离子强度越高，电动电位越小，泳动速度慢;（5）电渗：

在电场中，由于多孔支持物吸附水中的正或负离子使溶液相对带电，在电场作用下，溶液就向一定的方向移动.（6）支持介质的选择：

（7）其它因素：

10.不连续系统原理概要:

（1）．在不连续电泳系统中，含有三种离子，两种不同孔径的凝胶，两种或两种以上不同pH的缓冲溶液.

（2）．所谓不连续就是指凝胶浓度不一样，缓冲液离子成分及pH不一样。

（3）．在不连续电泳系统中，有三种物理效应，即样品的浓缩效应、分子筛效应及电荷效应。

由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。

11.以下为四个不连续性：

（1）凝胶层的不连续性：

浓缩胶（stackinggel）；分离胶（separatinggel）

（2）缓冲液离子成分的不连续性：

快离子（前导离子,leadingion）；慢离子（尾随离子,trailingion）；缓冲配对离子（缓冲抗衡离子,thebuffercounterion）;（3）电位梯度的不连续性：

在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形成的。

（4）pH的不连续性：

浓缩胶pH：

6.7：

分离胶pH：

8.9；缓冲液pH：

8.3。

在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性，是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率。

由于电泳基质的上述四个不连续性，使样品在电泳开始时得以浓缩，然后再被分离。

12.SDS-PAGE：

SDS作用：

1）与蛋白牢固结合，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异；2）SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同，而且具有相同的荷质比，因此在SDS-PAGE中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与菌、酵母等的破碎。

2）物理法：

A.超声法：

在处理少量样品时操作简便、效率高，液量损失少，适于实验室使用。

注意:

超声波产生的化学自由基团能使敏感的活性物质变性失活，另外噪声也比较大。

B.反复冻融法：

由于在此过程中易使活性蛋白失活，故适用于提取非常稳定的蛋白质。

C.冷热交替法：

绝大多数细胞被破坏，一般适用于从细菌或病毒中提取蛋白质。

D.低渗裂解：

是指无胞壁细胞在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解

3）化学法：

A.有机溶剂法：

有些有机溶剂（如苯、甲苯等）可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性的渗透出来。

B.表面活性剂：

常用的有十二烷基磺酸钠、TritonX-100、去氧胆酸钠等。

C.酶解法：

必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶

15.分离方法：

1）利用溶解度的差异分离：

A.盐析法。

B.有机溶剂沉淀法：

有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子之间不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。

C.温度。

2）根据分子量的不同分离：

.A.透析和超滤；B.平衡离心法；C.凝胶过滤。

3）根据电荷的不同分离：

A.电泳；B.离子交换层析。

4）亲和层析。

16.分配定律：

1）假设有两种互不混溶的溶剂S和M，将A物质溶于一定量的S溶剂中，再加入一定量的M溶剂；2）A物质在两相中相互扩散；3）A物质在两相中达到了平衡（在同一时间内，进出两相的A物质的分子数完全相等）时，其分配系数为常数K=CAS/CAM。

17.塔板理论的要点：

1）分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为一理论塔板，其高度为理论塔板高度。

在一定的条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的；2）在分配层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩散，而且在两相间达到分配平衡的速度很快；3）体系中其他物质的存在不影响待分离物质的分配。

待分离物质的存在也不影响其他物质的分配；4）在分配层析柱上，物质在各个理论塔板中的含量可通过计算求得。

18.区带电泳的优点：

1）是带电的物质，都可采用某种电泳技术，分离成不同位置的区带，对区带可进行定性或定量分析；2）样品用量少；3）设备简单；4）可在室温进行；5）操作简便，化时间不多；6）不同类型的电泳，有不同的用途；7）改进或找到更好的支持介质，就有可能大大提高分辨率。

19.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：

聚丙烯酰胺凝胶的性能：

1）机械强度好，有弹性透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的；2）没有吸附和电渗作用.通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变化在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性好；3）由于纯度高及不溶性，还适合于少量样品的制备，不致污染样品。

制备：

1）原料：

丙烯酰胺（Acr）和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）；2）催化剂：

引发剂（过硫酸铵,（NH4）2S2O8），加速剂（四甲基乙二胺,TEMED；3）化学聚合和光聚合两种；4）凝胶浓度和交联度；5）不连续系统制备。

可能出现的问题及解决措施：

1）条带过淡：

上样量不足；染色操作错误；2）条带丢失：

电泳时间过长，小条带已跑出胶；胶浓度不正确。

3）多余条带：

还原剂过量。

4）条带模糊：

被降解;药品不纯。

5）条带位置错误：

被降解；上样量过大；电泳条件不正确；上样前加热不够；还原剂失效。

6）条带不整齐：

孔径不均一；胶聚合太快，不均一；可能有气泡；样品离子强度过大。

7）条带扩散：

电压过低，电泳时间过长；缓冲液离子强度太低；样品本身结构不均一。

8）条带弯曲：

电泳过程产热过多；染色、固定时间短。

9）拖尾：

样品溶解不充分；胶板不干净。

20.蛋白质的浓缩：

1）超滤法；2）冷冻干燥法；3）吸收法：

聚乙二醇（PEG）、蔗糖、凝胶等；4）沉淀法。

五、酵母细胞双杂交系统

1.研究蛋白质相互作用的常用方法：

1）酵母双杂交；2）亲和层析；3）免疫共沉淀；4）蛋白质交联；5）基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法；6）噬菌体显示系统筛选。

2.酵母双杂交系统的基本原理：

转录激活因子上有DNA结合结构域（BD）与转录激活结构域（AD）;单独的BD虽然能和启动子结合,但不能激活转录;单独的AD也不能激活转录;与调控目的基因有关的两个蛋白质X蛋白与Y蛋白,将X蛋白的编码基因与BD结构域基因融合（表达所得的融合蛋白为”诱饵”蛋白）,,Y蛋白的编码基因与AD结构域基因融合（表达所得的融合蛋白称为”猎物”蛋白）;如果X蛋白与Y蛋白之间存在相互作用,那么分别位于这两个融合蛋白（”诱