高考生物一轮复习 生物技术实践 第2讲 微生物的培养与应用学案.docx
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高考生物一轮复习生物技术实践第2讲微生物的培养与应用学案
第2讲 微生物的培养与应用
考纲要求
全国卷五年考情
1.微生物的分离和培养
2017·卷ⅠT37,2016·卷ⅠT39,2016·卷ⅢT39,2015·卷ⅠT39,2014·卷ⅠT39,2014·卷ⅡT39,2013·卷ⅡT39
2.某种微生物数量的测定
2016·卷ⅠT39,2014·卷ⅡT39
3.培养基对微生物的选择作用
2017·卷ⅠT37,2016·卷ⅢT39,2014·卷ⅠT39,2013·卷ⅡT39
考点一|微生物的实验室培养
（对应学生用书第236页）
[识记—基础梳理]
1．培养基
（1）概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
（2）营养构成：
一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。
此外还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。
（3）①种类：
按照物理性质可分为液体培养基和固体培养基。
②下表为某微生物培养基的成分
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·7H2O
葡萄糖
尿素
琼脂
H2O
1.4g
2.1g
0.2g
10.0g
1.0g
15.0g
1000mL
该培养基中可以为微生物提供碳源的是葡萄糖，因为此培养基中加入了琼脂，故该培养基为固体培养基。
2．无菌技术
（1）关键：
防止外来杂菌的入侵。
（2）不同对象的无菌操作方法（连线）：
[答案] ①—b—Ⅰ ②—b—Ⅱ ③、④—a ⑤—a—Ⅲ、Ⅳ ⑥—b
3．大肠杆菌的纯化培养
（1）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
―→
―→
―→
―→
（2）纯化大肠杆菌的方法
①纯化培养原理：
想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。
②纯化大肠杆菌的关键步骤：
接种。
③接种方法：
下图甲可表示用平板划线法接种获得的平板；下图乙可表示用稀释涂布平板法接种获得的平板。
④纯化原理：
上图甲菌体的分散是通过一系列的连续划线操作实现的；上图乙菌体的分散是通过一系列的梯度稀释和涂布平板操作实现的。
4．菌种的保藏方法
（1）临时保藏法：
对于频繁使用的菌种，先接种到试管的固定斜面培养基上培养，然后放入4℃的冰箱中保藏。
（2）甘油管藏法：
对于需要长期保存的菌种，先将菌液转入灭菌后的甘油中，混匀后放在－20℃冷冻箱中保存。
[教材边角知识] 选修1 P18“旁栏小资料”,微生物的接种方法只有平板划线法和稀释涂布平板法吗？
微生物接种的核心是什么？
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
【提示】 不是，微生物的接种技术还包括斜面接种、穿刺接种等方法，其核心是防止杂菌的污染，保证培养物的纯度。
[运用—考向对练]
考向1 考查无菌技术
1．牛奶中富含蛋白质，长期饮用有助于增强体质，但牛奶同时也是多种疾病的传播载体。
国家标准是每毫升牛奶中细菌数小于30000个。
以下是牛奶消毒及细菌检测实验。
分析回答：
（1）图中步骤①称为________消毒法。
步骤②是________。
（2）培养基中的蛋白胨可以为微生物提供________。
进行步骤③操作时，应选用下列中的哪种工具？
________。
为了避免杂菌污染，此步骤应在________附近进行。
（3）将接种后的培养基和作为对照的________________同时放入37℃恒温培养箱中，培养36小时。
取出后统计各平板的菌落数，结果如下表所示。
应该选择其中稀释倍数为____________的平板进行计数，经过消毒后的牛奶中，细菌数大约是____________/mL。
牛奶稀释倍数
102
103
104
平板1菌落数
87
10
1
平板2菌落数
83
12
1
平板3菌落数
85
10
0
[解析]
（1）80°C恒温水浴15min是巴氏消毒法，步骤②是进行系列稀释（或梯度稀释）。
（2）培养基中的蛋白胨可以为微生物提供碳源、氮源（和维生素），③是接种，因为需要计数，需用稀释涂布平板法，接种工具是涂布器；为了避免杂菌污染，此步骤应在酒精灯火焰附近进行。
（3）统计各平板的菌落数时，应选择菌落数在30～300的计数，经过消毒后的牛奶中，细菌数大约是（87＋83＋85）÷3×102＝8500个。
[答案]
（1）巴氏 系列稀释（或梯度稀释）
（2）碳源、氮源（和维生素） B 酒精灯火焰 （3）一个未接种的培养基 102 8500个
1．考虑无菌技术的效果：
灭菌的效果比消毒要好。
2．考虑操作对象的承受能力：
活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能灭菌。
（2018·湖北省七市高三一调）我国规定1升自来水中大肠杆菌不得超过3个。
在培养基中加入伊红美蓝，可以使大肠杆菌的菌落呈深紫色，并带有金属光泽。
有关部门据此对自来水中的大肠杆菌进行检测。
具体步骤大致如下：
（一）用火焰灼烧自来水龙头3分钟，然后打开水龙头放水5分钟，再用无菌的三角瓶接取1000毫升水样，盖好瓶塞。
（二）将漏斗和抽滤瓶固定好，用镊子夹住滤膜边缘，将水样倒入漏斗中，边抽滤、边加水。
（三）用镊子将滤膜取出、放在无菌平板上进行培养，观察并记录实验结果。
回答下列问题：
（1）实验中所用的醋酸纤维素滤膜、漏斗、抽滤瓶、镊子等实验器材和培养基都需先用______________法进行灭菌。
如需检测培养基灭菌是否彻底，常用的方法是_________________________________________________________
________________________________________________________________。
（2）制作本实验所用的无菌平板时，需要加入________、水、无机盐等大肠杆菌所必需的营养成分，以及加入________，便于统计菌落外；还需要将培养基的pH调整至________性。
鉴别是否有大肠杆菌菌落，需要在培养基中加入________。
（3）按上述步骤制作的3个样品平板上所有的菌落数分别为49、51、47。
能否据此得出每升水样中大肠杆菌数约为49的结论？
________。
理由是________
________________________________________________________________。
[解析]
（1）培养基常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法，检测培养基灭菌是否彻底，常用的方法是将灭菌过的培养基在适宜的条件下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落产生。
（2）培养微生物的培养基需要碳源、氮源、水和无机盐。
统计微生物数目要用固定培养基，因此培养基需要加入琼脂。
大肠杆菌生长的最适合pH为中性或微碱性，伊红美蓝是专一鉴定大肠杆菌的指示剂，利用伊红美蓝培养基可以鉴定大肠杆菌。
（3）该培养基是鉴别培养基，在平板上生长的菌落，只有部分是大肠杆菌形成的菌落，因此大肠杆菌数实际数值应该小于49。
[答案]
（1）高压蒸汽灭菌 将灭菌过的培养基在适宜的条件下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落产生
（2）碳源和氮源 琼脂 中性或微碱 伊红美蓝
（3）不能 培养基表面生长的菌落，只有部分是大肠杆菌的菌落
考向2 微生物的纯化培养
2．（2018·贵州省模拟）生活饮用水已经过沉淀、过滤、加氯消毒等处理，含微生物很少，但当水源不洁净或处理达不到要求时，仍然会含相当量的微生物甚至含有致病性微生物。
供水管道破损及二次供水等环节也可能导致生活饮用水的污染。
因此生活饮用水的微生物安全性日常检测是很重要的。
我国生活饮用水水质标准（GB5749－85）中规定生活饮用水中细菌总数不得大于100个/mL，总大肠菌群不得大于3个/L。
（1）检验细菌的含量时，可以将水样进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，记录菌落数量，进而计算出样本中的菌株数。
这种微生物的计数方法获得的菌落数一般________（填“小于”“大于”或“等于”）活菌的实际数目。
（2）用该方法对微生物进行计数时是否需要设置对照组？
____。
为什么？
___
________________________________________________________________。
（3）分别取0.1mL已稀释102倍的水样分别涂布到三个琼脂固体培养基的表面进行培养，培养基记录到大肠杆菌的菌落数分别为155、158、170，则每升原水样中大肠杆菌数为________。
（4）为了更进一步的研究，需要纯化大肠杆菌。
下图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析接种的具体方法。
获得图A效果的接种方法是________________，图B效果的接种方法是____________。
某同学在用A方法纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是________________________。
为了防止杂菌污染，有同学建议加入抗生素，你觉得可以吗？
________。
[解析]
（1）用这种方法计数时，当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此获得的菌落数一般小于活菌的实际数目。
（2）设置对照的目的是为了排除非测试因素（如培养基是否被污染）对实验结果的影响。
（3）由给定的数据可计算出每升原水样中大肠杆菌数为（155＋158＋170）÷3×102×10×103＝1.61×108。
（4）读题图可知，获得图A效果的接种方法是稀释涂布平板法，图B效果的接种方法是平板划线法。
某同学在用A方法纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是菌液浓度过高。
因为抗生素不但杀灭杂菌，而且也可以杀灭大肠杆菌，因此在培养基上不可以加入抗生素。
[答案]
（1）小于
（2）需要 因为需要判断培养基是否被污染 （3）1.61×108 （4）稀释涂布平板法 平板划线法 菌液浓度过高（土壤溶液稀释不够） 不可以
项目
优点
缺点
平板划线法
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
不能计数
稀释涂布平板法
可以计数，可以观察菌落特征
吸收量较小，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
某研究小组研究了不同浓度的抗生素A对大肠杆菌生长的影响，实验结果见下图1。
回答下列相关问题：
（1）该培养基为大肠杆菌提供的主要营养物质有碳源、水、无机盐、________四类，而配置该培养基时，通常加入________作为凝固剂。
（2）为了确保利用____________法接种大肠杆菌时，形成一层菌膜，则对菌种的稀释倍数________。
另外，在培养和接种大肠杆菌时要特别注意进行________操作。
根据实验结果，选出对大肠杆菌抑制作用最明显的抗生素A浓度的依据是_____________________________________________________
_________________________________________________________________。
（3）为减少实验误差，每一浓度的抗生素A还要制备________。
（4）该研究小组运用上述实验方法还研究了相同浓度的a、b、c三种不同抗生素对大肠杆菌生长的影响。
请在图2中图示这一处理方案（可模仿图1加以必要的注解）。
[解析]
（1）微生物生长繁殖所需要的四类主要营养物质是水、无机盐、碳源和氮源。
该实验所用的培养基为固体培养基，常用的凝固剂是琼脂。
（2）图中接种大肠杆菌时所使用的接种方法是稀释涂布平板法，为了得到菌膜，稀释倍数不能太大。
接种和培养大肠杆菌的关键是无菌操作。
据图1分析，⑤号圆纸片的抑菌圈最大，说明该浓度的抗生素A对大肠杆菌抑制作用最明显。
（3）为减少实验误差，每一浓度的抗生素A还要制备多个圆纸片进行重复实验。
（4）该方案的自变量为相同浓度的a、b、c三种不同抗生素，还应有空白对照，注意在图中要标记清楚，具体图解见答案。
[答案]
（1）氮源 琼脂
（2）稀释涂布平板 不能太大 无菌 透明圈越大，抑制效果越明显 （3）多个圆纸片 （4）图示见下图所示
考点二|微生物的分离与计数
（对应学生用书第238页）
[识记—基础梳理]
1．统计菌落数目的方法
（1）显微镜直接计数法
①原理：
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
②方法：
用计数板计数。
③缺点：
不能区分死菌与活菌。
（2）间接计数法（活菌计数法）
①原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：
每克样品中的菌株数＝（C÷V）×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。
③操作：
设置重复组，增强实验的说服力与准确性。
同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
2．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）分离原理
土壤中细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
（2）统计菌落数目
统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。
（3）实验流程
土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。
（4）鉴定方法：
在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素。
3．分解纤维素的微生物的分离
（1）纤维素酶
①组成：
纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
②作用：
纤维素
纤维二糖
葡萄糖
（2）纤维素分解菌的筛选
①原理
纤维素分解菌
↓
―→红色复合物
红色消失，出现透明圈。
②筛选方法：
刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
③培养基：
以纤维素为唯一碳源的选择培养基。
④实验流程
：
富含纤维素的环境
↓
：
用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度
↓
：
制备系列稀释液
↓
：
将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
：
产生透明圈的菌落
[运用—考向对练]
考向1 微生物的选择培养
1．（2018·吉林长春二模）下面是筛选抗链霉素大肠杆菌的实验步骤及相关图解。
实验步骤：
①把大量对链霉素敏感的大肠杆菌接种在不含链霉素的培养基1的表面，进行培养。
②待其长出密集的小菌落后，用影印法接种到不含链霉素的培养基2上，随即再影印到含有链霉素的培养基3上，进行培养。
③在培养基3上出现了个别抗链霉素的菌落，将其挑选出。
请回答：
（1）配制培养基时除了满足基本的营养条件外，还需满足微生物生长对特殊营养物质、________、________的要求。
（2）从功能上看，含有链霉素的培养基属于________培养基。
若在培养基中加入伊红和美蓝，则培养皿中长出的菌落颜色为________。
由图可知，1号培养基接种的方法为________________。
（3）对2和3进行比较，在2上找到与3上相应的菌落，挑取其中一个菌落接种到________（填“含链霉素”或“不含链霉素”）的培养基上，如果有较多的菌落出现，则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之________（填“前”或“后”）。
（4）3中的菌落比1、2中的菌落少很多，这说明了基因突变具有________的特点。
[解析]
（1）配制培养基时在提供几种基本营养条件的基础上，还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
（2）链霉素是抗生素，对大肠杆菌具有选择作用。
在伊红和美蓝培养基上，大肠杆菌菌落颜色为黑色。
由题图可知，1号培养基接种的方法为稀释涂布平板法。
（3）培养基2和培养基3上相同的菌落，是具有相同性状的大肠杆菌形成的，将培养基2中一个与培养基3相对应的菌落接种到含链霉素的培养基上，若出现较多的菌落，则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之前。
（4）抗链霉素性状是大肠杆菌基因突变后获得的性状，3号培养皿中的菌落比1号、2号中的菌落少很多，这说明了基因突变具有低频性的特点。
[答案]
（1）pH 氧气
（2）选择 黑色 稀释涂布平板法 （3）含链霉素 前 （4）低频性
在调查和分离湖水中耐盐细菌的实验中，先将10升湖水水样浓缩至10毫升，然后各取浓缩水样1毫升，涂布到多个培养皿中培养。
请回答：
（1）可以通过提高培养基中____________的浓度，筛选被调查细菌，这种培养基被称为____________培养基。
（2）要提高实验结果的可靠性，排除培养基未彻底灭菌的可能性，应该设置的对照组是____________。
为检验
（1）中筛选方法的效果，可以设置的对照组是____________。
（3）在微生物的培养过程中，实验室对培养基灭菌常用的方法是____________。
为防止冷凝水影响细菌的生长，需将培养皿____________培养。
在培养基上产生的单个菌落在生态学中可以被称为____________。
（4）根据培养皿上菌落的平均数可以计算湖水中该种细菌的密度，但计算的数据要比实际活菌的数目少，原因是
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________。
[解析]
（1）此实验的目的是调查和分离湖水中耐盐细菌，因此可通过提高培养基中NaCl的浓度，从而筛选出被调查细菌，而其他耐盐性较低或不耐盐的细菌则被杀死，这种培养基被称为选择培养基。
（2）要提高实验结果的可靠性，排除培养基未彻底灭菌的可能性，应该设置一个未接种的培养皿作为对照组。
（1）中筛选耐盐细菌是通过加入高浓度的NaCl实现的，因此要检验
（1）中筛选方法的效果，可以设置的对照组是未加高浓度的NaCl培养基进行培养。
（3）对培养基灭菌常用的方法是高压蒸汽灭菌。
微生物极有可能进入培养皿中附在冷凝水中，为防止冷凝水影响细菌的生长，需将培养皿倒置培养。
在培养基上产生的单个菌落为同一种生物的总和，在生态学中可以被称为种群。
（4）观察培养皿上菌落数时，若两个或多个细胞连在一起时，视为一个菌落，则计算的数据要比实际活菌的数目少。
[答案]
（1）盐（或NaCl） 选择
（2）未接种（或接种等量无菌水）的培养皿 未加高浓度盐的培养基培养 （3）高压蒸汽灭菌 倒置 种群 （4）当两个或多个细胞连在一起时在平板上观察到的是一个菌落
考向2 微生物的分离与计数
2．（2018·黄冈市高三联考）水污染是全球性的环境问题，微生物降解是水污染治理的有效手段之一。
聚乙烯醇（PVA）是存在于化工污水中的一种难以降解的大分子有机物，PVA分解菌能产生PVA酶分解PVA，PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑，请回答下列问题：
（1）要从土壤中筛选出能高效分解PVA的细菌，应采用以________作为唯一的碳源的选择培养基，实验中还应设置对照组。
将菌液稀释相同的倍数，对照组培养基上生长的菌落数目应明显________（填“多于”或“少于”）选择培养基上的数目，从而说明选择培养基具有筛选作用。
（2）要测定土壤稀释液中微生物的数目，可在显微镜下用________计数板直接计数。
若将100mL含有PVA分解菌的土壤样品溶液稀释104倍后，取0.1mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为160个，空白对照组平板上未出现菌落，则100mL原菌液中有PVA分解菌________个，该方法的测量值与实际值相比一般会________（填“偏大”“偏小”或“相等”）。
（3）要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养PVA分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外还需要加入________用于鉴别PVA分解菌。
要比较不同菌株降解PVA能力的大小，用含相同PVA浓度的上述培养基来培养不同菌株，一定时间后，通过测定________来确定不同菌株降解PVA能力的大小。
[解析]
（1）要从土壤中筛选出能高效分解PVA的细菌，应采用以聚乙烯醇（PVA）作为唯一的碳源的选择培养基，目的是淘汰不能分解聚乙烯醇（PVA）的细菌。
实验中设置的对照组培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因为对照组没有淘汰不能分解聚乙烯醇（PVA）的细菌。
（2）在显微镜下计数微生物细胞的数量可直接用血球计数板计数。
根据题意，100mL原菌液中有PVA分解菌的数量为160÷0.1×104×100＝1.6×109。
由于该方法得到的菌落可能是两个或者多个细菌共同产生一个菌落导致统计的菌落数较实际菌落数偏少，所以该方法的测量值与实际值相比一般会偏小。
（3）根据题目告诉的鉴定PVA分解菌的原理“PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑”可知，要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养PVA分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外还需要加入碘用于鉴别PVA分解菌。
要比较不同菌株降解PVA能力的大小，用含相同PVA浓度的上述培养基来培养不同苗株，一定时间后，通过测定白色透明斑的大小（或直径）来确定不同菌株降解PVA能力的大小。
[答案]
（1）聚乙烯醇（或PVA） 多于
（2）血细胞（血球） 1.6×109 偏小 （3）碘 白色透明斑的大小（或直径）
3．（2018·衡水中学高三调考）为研究“某品牌酸奶中乳酸菌数量及其对抗生素耐药性情况”，某同学进行了如下实验。
请分析回答下列问题：
（1）配制的细菌培养基除了含有水、碳源、氮源和无机盐等主要营养成分外，还应加入适量的________和琼脂。
在培养基各成分溶化与灭菌之间，要进行的是________。
（2）接种微生物的方法有很多，图1中过程①②③所示的方法为______________。
用该方法统计样本菌落数后，所得数据需要乘以10n后，才可表示乳酸菌的数量（单位：
个/mL），这里的n＝________。
用该方法统计样本菌落数时，同时需要做A、B、C三个培养皿，原因是______________
________________________________________________________________。
（3）为了检测乳酸菌对抗生素的敏感性，取该单菌落适当稀释，接种于固体培养基表面，在37℃培养箱中培养24h，使其均匀生长，布满平板。
将分别含有A、B、C三种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A________（填“敏感”或“不敏感”）；含C滤纸片周围
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