天然药物化学实验.docx
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天然药物化学实验
实验一天然产物化学成分系统预试验
天然产物中所含的化学成分种类很多,在深入研究之前应首先了解其中含有哪些类型的化学成分,如生物碱、皂苷、黄酮类等等。
这就需要进行各类化学成分的系统定性预试验。
或根据研究的需要进行单项预试法来初步判断。
一、实验目的与要求
掌握未知成分的天然产物是怎样初步提取分离的,熟悉各主要成分的试管试验、沉淀反应和纸层析、薄层层析的方法并根据试验结果判断含有什么类型的化学成分。
二、基本原理
利用各类成分的颜色反应和沉淀反应,对天然产物的提取液进行检查可以初步判断其中的化学成分。
由于提取液大多数颜色较深,影响对颜色变化的观察,可以使用薄层层析(TLC)或纸层析(PC)等方法对天然产物的提取液进行初步分离,再进一步检查。
三、实验内容:
利用不同成分在各种溶剂中的溶解度的不同,一般可采用以下3种溶剂分别提取,试验。
1.水浸液:
取中草药粗粉5g加水60ml,在50~60℃的水浴上加热1小时,过滤,滤液进行下列试验。
检查项目
试剂名称
糖
*1、酚醛缩合反应
*2、菲林试剂
酚类
△1%FeCl8试剂
鞣质
△1、1%FeCl8试剂
苷类或多糖
*1、酚醛缩合反应
*2、加6NHCl酸化,加热煮沸数分钟,冷后仔细观察有无絮状沉淀
*3、菲林试剂,观察水解前后Cu2O沉淀量有无增加。
皂苷
*泡沫试验
生物碱
*1、碘化铋钾试剂
*2、硅钨酸试剂
*在试管进行,△在滤纸或硅胶CMC-Na薄层板上进行,下同。
糖鉴定
(1)α-萘酚一硫酸试剂检查还原糖。
①溶液I:
10%α-萘酚乙醇溶液。
溶液II:
硫酸。
取1ml样品的稀乙醇溶液或水溶液,加入溶液I2滴~3滴,混匀,沿试管壁缓缓加入少量溶液II,二液面交界处产生紫红色环为阳性反应。
(2)斐林试剂检查还原糖。
溶液I:
6.93g结晶硫酸铜溶于100ml水中。
溶液II:
34.6g酒石酸钾钠、10g氢氧化钠溶于100ml水中。
取1ml样品热水提取液,加入4滴~5滴用时配制的溶液I、II等量混合液,在沸水浴中加热数分钟,产生砖红色沉淀为阳性反应。
如检查多糖和苷,取1ml样品水提液,加入1m110%盐酸溶液,在沸水浴上加热10min,过滤,(成盐去除杂质)再用10%氢氧化钠溶液调至中性,按上述方法检查还原糖。
或者直接用高效液相色谱看色谱图。
酚类鉴定试剂
(1)三氯化铁试剂检查酚类化合物、鞣质1%~5%三氯化铁水溶液或乙醇溶液,加盐酸酸化。
取1ml样品的乙醇溶液,加入试剂1滴~2滴,显绿、蓝绿或暗紫色为阳性反应。
作色谱显色剂用,喷洒后,显绿或兰色斑点为阳性。
2.乙醇提取液
取中草药粗粉5g,加5~12倍量95%乙醇,在水浴上加热回流提取1小时,过滤,滤液留2ml作
(1)项试验,其余回收乙醇至无醇味,并浓缩成浸膏状,浸膏分为二部分,一部分加少量2%HCL振摇溶过滤。
分出酸液,作
(2)项式验,附于滤纸上的一部分再以少量乙醇溶解,溶液作(3)项试验;另一部分浸膏以少量乙酸乙酯溶解,溶液置分液漏斗中加适量5%NaOH振摇,使酚性物质及有机酸等转入下层氢氧化钠水溶液中,剩下的乙酸乙酯为中性部分,用蒸馏水洗去碱性即可备用,将乙酸乙酯液2~3ml,在水浴上蒸干,以1~2ml乙醇溶解作(4)项试验。
(1)项试验
检查项目
酚类
鞣质
试剂名称
△1%FeCl3
△1%FeCl3
结果
(2)项试验
检查项目
生物碱
试剂名称
*1、碘化铋钾试剂
*2、硅钨酸试剂
*3、苦味酸试剂
结果
(3)项试验
检查项目
黄酮
蒽醌
试剂名称
△1、1%AlCl3试剂
*2、盐酸镁粉反应
△1、10%KOH液
△2、0.5%Mg(Ac)2试剂
结果
(4)项试验
检查项目
香豆素与萜类内酯
试剂名称
*1、氨基安替比林—铁氰化钾呈色反应
结果
3、石油醚提取液
取中草药粗粉1g,加10ml石油醚(沸程60~90℃),放置2~3小时,过滤,滤液置表面皿上任其挥发,残留物进行下列试验:
检查项目
甾体或三萜类
挥发油和油酯
试剂名称
*1、醋酐-浓硫酸试验
石油醚提取液滴于滤纸片上,观察有无油斑并在加热后能否发挥
结果
黄酮类鉴定试剂
(1)盐酸-镁粉试剂检查黄酮(醇)、二氢黄酮(醇)类化合物。
取1ml样品的乙醇溶液,加入数毫克镁粉,滴加数滴盐酸,必要时水浴上微热,显红-紫色为阳性反应。
(3)三氯化铝试剂检查具有邻二酚羟基或3-羟基、4-酮基或5-羟基、4-酮基的黄酮类化合物。
1%三氯化铝乙醇溶液或5%三氯化铝乙醇溶液。
喷洒前、后将薄层板置日光下和紫外光灯下观察,呈黄色或黄绿色荧光为阳性反应也可在滤纸上或试管中进行。
(3)醋酸镁试剂检查黄酮类,二氢黄酮类化合物,及羟基蒽醌类衍生物。
1%醋酸镁甲醇溶液。
在滤纸或薄层板上,点1滴样品醇溶液,挥去醇后,点1滴试剂于样品斑点边缘,加热干燥,于紫外灯下观察,黄酮类显黄色荧光,二氢黄酮类呈天蓝色荧光。
显橙红色为大黄素型蒽醌,显紫色为茜草型蒽醌。
生物碱鉴定试剂
(1)改良碘化铋钾试剂
为生物碱通用显色剂。
溶液I:
0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸,加水40ml。
溶液II:
8g碘化钾溶于20ml水中。
溶液I和II等量混合,于棕色瓶中可以保存较长时间。
目前市场上有碘化铋钾试剂可供直接配制:
7.3g碘化铋钾、冰醋酸10ml加水60ml。
取1m1样品的稀酸溶液加1滴~2滴试剂,产生桔红色浑浊或沉淀为阳性反应。
如作薄层色谱显色剂,取混合液1m1、醋酸2ml、水10ml混合即得。
喷洒后呈桔红色斑点为阳性反应
(2)苦味酸试剂为生物碱通用沉淀试剂。
苦味酸1g溶于100ml水中。
取1ml样品中性溶液,加入试剂1滴~2滴,产生黄色晶形沉淀。
(3)硅钨酸试剂为生物碱通用沉淀试剂。
1g硅钨酸溶于20ml水中,加10%盐酸使成pH2左右。
取1ml样品的稀酸溶液,加入1滴~2滴试剂,产生白色至褐色沉淀为阳性反应。
四、药品试剂:
中药饮片每组每种8克
生物碱试剂
(1)碘化铋钾(Dragendorff)试剂:
出现桔红色或黄色沉淀。
(2)苦味酸(Hager)试剂,样品液需调至中性后加试剂,出现黄色晶形沉淀。
(3)硅钨酸(Bertrand)试剂:
出现淡黄色或灰白色沉淀,在薄层板上应时,加热后出现黑色斑点。
酚类、鞣质试剂
1%三氯化铁水或乙醇试剂
氨基酸、蛋白质试剂
茚三酮(Ninnydrin)试剂
糖、多糖和苷试剂
(1)α-萘酚试剂、Molish试剂
(2)菲林氏反应(Fehling试剂):
溶液Ⅰ:
69.3克结晶硫酸铜溶于1000毫升水中。
溶液Ⅱ:
349克洒石酸钾钠及氢氧化钠100克,溶于1000毫升水中。
皂苷试剂
浓硫酸试剂
黄酮类试剂
盐酸——镁粉反应
醋酸镁反应
1%三氯化铝乙醇液
香豆素试剂
1%三氯化铁水溶液
Gibb氏反应:
4-氨基安替比林-铁氰化钾(Emerson)
4、玻璃仪器:
(每2人或3人一组,每组一套)
(1)试管10个,滴管2个,玻棒1支
(2)100ml圆底烧瓶一个,250ml圆底烧瓶一个,25cm球型或蛇型冷凝管一个,有机溶剂蒸馏回收装置1套,50ml烧杯3个,25ml具塞锥形瓶,
(3)有孔白瓷板1个
(4)滤纸,乳胶管、药勺
仪器:
(1)普通天平,
(2)分析天平,(4)电水浴锅
5、思考题
实验学时:
9学时
实验二芦丁的提取、分离及鉴定
一、目的要求
1.以芦丁为实例学习黄酮类成分的提取分离方法。
2.掌握用黄酮苷水解制取黄酮苷元的方法。
3.了解黄酮类化合物的一般性质。
二、基本原理
槐米系豆科属植物槐树SopHorajaponica.L.的花蕾,历来作为止血药,治疗痔疮、子宫出血、吐血、鼻出血,并有清肝泻火,治疗肝热目赤,头痛眩晕的功能。
其主要化学成分为芸香苷(芦丁),含量高达12%~20%,芸香苷广泛存在于植物中,现已发现含有芸香苷的植物高达70种以上,尤以槐米和乔麦中含量最高。
药理实验证明芸香苷有调节毛细血管渗透作用,临床上用作毛细血管性止血药,常作为高血压症的辅助用药。
槐米中主要成分的物理性质
1.芸香苷(芦丁,rutin):
,淡黄色针状结晶,mpl74℃~178℃,无水物为188℃~190℃。
溶解度:
冷水中1:
8000,热水中l:
200,冷乙醇中1:
300,热乙醇中1:
30,冷吡啶中1:
12,微溶于丙酮、乙酸乙酯,不溶于苯、氯仿、石油醚等溶剂。
易溶于碱液,呈黄色,酸化后又析出,可溶于硫酸和盐酸,呈棕黄色,加水稀释又析出。
UV
:
259,299sh,359。
2.槲皮素(quercetin):
,黄色结晶,mp313℃~314℃,无水物为316℃。
溶解度:
冷乙醇中1:
290,沸乙醇中1:
23,可溶于甲醇、乙酸乙酯、吡啶、丙酮等溶剂,不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚。
UV
:
255,269sh,301sh,
370。
芸香苷(芦丁,rutin)
1.芸香苷分子中具有酚羟基,显弱酸性,在碱水中成盐增大溶解能力,用碱水为溶剂煮沸提取,提取液加酸酸化后又成为游离的芸香苷而析出。
并利用芸香苷对冷水和热水的溶解度相差悬殊的特性进行精制。
2.黄酮苷可通过酸水解得到苷元和糖,并可通过薄层色谱法和纸色谱法进行检识。
3.利用黄酮类化合物对紫外光有特定吸收的特征进行结构测定;也可制备乙酰化物进行结构鉴定。
三、实验内容
1自槐花米中提取芦丁:
(1).提取方法:
称取槐花米粗粉20g(压碎),加沸水300m1,加热煮沸30min,四层纱布趁热过滤,残渣同法再操作一次,合并两次滤液,放置冰箱中析晶,待全部析出后,减压抽滤,用蒸馏水洗涤芸香苷结晶,抽干,得粗制芸香苷,置空气中干燥后,称重。
(2).重结晶方法:
取粗芦丁2g,加去离子水或蒸馏水400ml,加热煮沸,趁热抽滤,放置过夜析晶(或放冷析晶),抽滤,得精制芦丁。
记录:
粗芦丁得率多少?
精制芦丁得率多少?
熔点?
2.芦丁的水解:
取芦丁1g,加2%H2SO480ml,小火加热微沸回流30分钟至1小时。
开始加热10分钟为澄清溶液,逐渐析出黄色小针状结晶,即槲皮素,抽滤取结晶(保留滤液20毫升,以检查其中所含单糖),沉淀物为芸香苷苷元(槲皮素),用蒸馏水洗至中性,抽干水分,晾干,称量。
得粗制槲皮素,再用乙醇重结晶得精制槲皮素。
加50%乙醇(按1克90ml量)加热回流使槲皮素粗晶溶解,趁热抽滤,放置析晶,抽滤得精制品,在减压下110℃干燥可得槲皮素无水物。
测熔点,进行薄层层析鉴定。
取芸香苷水解后的滤液20m1,加饱和氢氧化钡溶液中和至中性(搅拌下进行),滤去白色的硫酸钡沉淀,滤液浓缩至2ml~3ml或蒸于后,加2ml~3ml乙醇溶解,作为糖的供试液。
3.鉴定
呈色反应
取芸香苷及槲皮素精品约10mg,各用5ml乙醇溶解,制成样品溶液,按下列方法进行试验,比较苷元和苷的反应情况。
(1)Molish反应取样品溶液1ml,加10O%α一萘酚溶液1ml,振摇后斜置试管,沿管壁滴加0.5ml硫酸,静置,观察并记录液面交界处颜色变化。
(2)盐酸一镁粉反应芸香苷与槲皮素溶液分别置于两试管中,加入金属镁粉少许,盐酸2滴~3滴,观察并记录颜色变化。
(3)醋酸镁纸片反应取两张滤纸条,分别滴两滴芸香苷、槲皮素的乙醇溶液,然后各加1%醋酸镁甲醇溶液两滴,于紫外光灯下观察荧光变化,记录现象。
(4)利三氯化铝纸片反应在两张滤纸条上分别滴加芸香苷、槲皮素醇溶液后,各加1%三氯化铝乙醇溶液两滴,于紫外光灯下观察荧光变化,记录现象。
(5)锆一柠檬酸反应取样品溶液2ml,加2%二氯氧锆甲醇溶液3滴~4滴,观察颜色,然后加入2%柠檬酸甲醇溶液3滴~4滴,观察并记录颜色变化。
色谱鉴定
(1)芸香苷和槲皮素的薄层色谱
样品自制芦丁、槲皮素
对照品芦丁、槲此素
展开剂
(1)正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5上层或4∶1∶1);
(2)25%醋酸水溶液;
(3)85%醋酸水溶液
显色
(1)可见光下观察,再在紫外光下观察;
(2)经氨气熏后再观察;
(3)喷三氯化铝试剂后再观察
点样:
提取的槲皮素及芸香苷的乙醇溶液和对照品的乙醇溶液。
展开剂:
正丁醇一醋酸一水(4:
l:
5)上层溶液。
展开方式:
预饱和后,上行展开。
显色:
喷洒三氯化铝试剂前后,置日光及紫外光灯(365nm)下检视色斑的变化。
观察记录:
记录图谱及斑点颜色。
(2)芸香苷与槲皮素的聚酰胺色谱
层析材料:
聚酰胺薄膜。
点样:
提取的芸香苷与槲皮素的乙醇溶液和对照品的乙醇溶液。
展开剂:
乙醇-水(7∶3),水饱和的正丁醇一醋酸(10:
0.2)。
展开方式:
上行展开。
显色:
喷洒三氯化铝试剂前后,置日光及紫外灯光(365nm)下检视色斑的变化。
观察记录:
记录图谱及斑色颜色。
(3)糖的色谱鉴定
层析材料:
新华层析滤纸NO.2。
点样:
(三)中糖的供试液及葡萄糖、鼠李糖对照品溶液。
展开剂:
正丁醇一醋酸一水(4:
l:
5)上层溶液。
展开方式:
上行展开。
显色:
氨性硝酸银试液,喷洒后先用电吹风冷吹至于,再吹热风至出现斑点为止。
观察记录:
记录图谱及斑点颜色。
4、药品试剂
药品:
每组槐花米20克
主要仪器及试剂
仪器:
(1)烧杯(100ml,500ml);
(2)圆底烧瓶(100ml,150ml);(3)冷凝管;(4)抽滤瓶;(5)循环水泵;(6)紫外灯
试剂:
(1)0.4%硼砂水;
(2)石灰乳;(3)乙醇,甲醇等;(4)2%硫酸,盐酸;(5);(6)1%三氯化铝乙醇液;(7)正丁醇:
醋酸:
水(4:
1:
5或4:
1:
1);(8)25%醋酸,85%醋酸;(9)乙醇:
水(7:
3);(10)标准品:
芦丁,槲皮素,葡萄糖,鼠李糖,(11)PH广泛试纸(12)聚酰胺薄膜
5、思考题:
1、芦丁水解不完全时将产生什么结果?
2、芦丁和槲皮素用不同展开剂系统展开将出现什么结果?
为什么?
3、芦丁和槲皮素聚酰胺薄层出现什么结果?
为什么?
记录:
主要产物得率?
熔点?
层析示意