隐形阿霉素脂质体的制备及体外细胞试验.docx

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隐形阿霉素脂质体的制备及体外细胞试验

隐形阿霉素脂质体的制备及体外细胞试验

摘要

用转铁蛋白（Tf）修饰盐酸阿霉素隐形脂质体（SL）,以增加药物在肿瘤部位的积蓄,从而增加药物向肿瘤细胞内的转运。

采用薄膜超声法制备空白脂质体,硫酸铵梯度法装载盐酸阿霉素（DOX）;通过膜材DSPE-PEG2000-COOH上的活性羧基末端与Tf上的氨基连接制备Tf修饰的隐形脂质体（Tf-SL）;采用凝胶柱-UV法测定脂质体中DOX的包封率,双辛丁酸试剂盒测定蛋白结合效率;通过流式细胞试验和激光共聚焦显微试验考察肝癌细胞HepG2对SL包封的DOX（DOX-SL）及Tf-SL包封的DOX（Tf-DOX-SL）的结合或摄取情况,并观察两种脂质体对HepG2细胞的体外杀伤作用。

Tf-DOX-SL的平均粒径为（62±17）nm,药物平均包封率为96.4%,蛋白结合效率为100.28µgTf/µmol磷脂。

与DOX-SL相比,Tf-DOX-SL与肝癌细胞HepG2的结合及摄取均增加。

48h细胞毒试验表明Tf-DOX-SL对HepG2细胞的杀伤作用（IC50=20.4µmol/L）明显优于DOX-SL（IC50=166.2µmol/L）（P<0.01）。

Tf修饰的隐形脂质体可作为肿瘤靶向的载体通过受体介导的方式促进DOX向肿瘤细胞内的传递。

考察转铁蛋白修饰的阿霉素（DOX）脂质体在大鼠体内的药代动力学及荷瘤小鼠体内的组织分布。

将DOX注射液（I-DOX）、DOX脂质体（L-DOX）和转铁蛋白修饰的DOX脂质体（Tf-L-DOX）3种DOX制剂静脉给药后,测定大鼠血浆中DOX含量和荷瘤小鼠不同组织中的DOX含量,对3种制剂的体内生物分布特征和靶向性进行评价。

在大鼠血浆中,I-DOX、L-DOX和Tf-L-DOX的半衰期分别为5.48、20.58和22.24h;AUC分别为0.538,1276.5,1221.3μg·h/mL;MRT分别为2.43,23.46和22.59h;CL分别为50.000,0.020和0.020L/（kg·h）。

与DOX相比,L-DOX和Tf-L-DOX在小鼠肝、脾、肺和肿瘤组织中的药物含量明显增加,而在心、肾中的药物含量明显降低。

与L-DOX相比,Tf-L-DOX在肿瘤组织中的药物含量显著增加。

脂质体包载DOX后,可显著改变DOX的部分药代动力学参数,使药物在血浆中能维持较长时间,而转铁蛋白修饰对脂质体本身的药代动力学参数没有影响。

Tf-L-DOX具有较好的肿瘤靶向治疗效果和较低的心脏不良反应,对提高DOX的治疗指数具有较好的临床价值。

前言

在疾病的治疗过程中,为了提高药效和减轻不良反应,药物定向输送和靶细胞特异治疗的研究越来越受到人们的关注。

研究者正在探索药物定点和定向转运系统可能的应用方案,其中配体-受体介导的转运系统备受关注。

隐形脂质体（stealthliposomes,SL）作为一种抗癌药物载体,能够在肿瘤组织中蓄积并显著提高药物的治疗指数。

在隐形脂质体的表面用特异性配体（如叶酸、转铁蛋白或单克隆抗体等）进行修饰可进一步提高靶向性。

转铁蛋白（transferrin,Tf）和转铁蛋白受体（transferrinreceptor,TfR）介导的内吞作用是生物体细胞最具特点的转运过程之一。

由于恶性肿瘤细胞过度表达TfR,利用Tf-TfR转运途径,可明显增强抗癌药物的选择性、毒性和减少耐药性,从而增强疗效。

利用Tf-TfR的转运途径,将药物特异性地转运至肿瘤部位及脑内发挥药效已取得进展。

本实验以DSPE-PEG2000-COOH作为连接脂质,将TfR的配体Tf连接至盐酸阿霉素隐形脂质体,测定脂质体形态、粒径、稳定性、包封率,体外细胞结合、摄取与细胞毒等重要性质,为设计转铁蛋白修饰的主动靶向给药系统提供有效的调控方法。

1材料

1.1药品与试剂

盐酸阿霉素;二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交连物（DSPE-PEG2000-COOH）、胆固醇（Chol）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）（AvantiPolarLipids公司）;1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC.HCl）、转铁蛋白（Sigma公司）;N-羟基硫代琥珀酰亚胺;SepharoseCL-4B（Pharmacia公司）。

其他试剂均为分析纯,实验用水为蒸馏水。

1.2仪器

旋转蒸发仪;高速冷冻离心机;蛋白快速层析系统（美国GE公司）;JEM-2010UHR高分辨透射电镜;Zetasizer3000HSA型粒径分析仪（英国Malvern公司）;FACSCalibur流式细胞仪（美国BectonDickinson公司）。

2方法

2.1转铁蛋白修饰脂质体的制备

分别精密称取DSPC、Chol、DSPE-PEG2000-COOH（物质的量比为6：

3：

0.6）作为制备脂质体的膜材。

膜材溶于有机溶剂（氯仿-甲醇,2：

1）后置圆底烧瓶中于53℃水浴减压蒸发形成薄膜。

加入250mmol/L硫酸铵溶液适量,涡旋振荡,水浴超声。

所得脂质体装于透析袋中,置盛有PBS（pH7.4）100mL的烧杯中,室温下透析5次,每次1h。

DOX用硫酸铵梯度法装载:

将DOX固体粉末加到空白脂质体中,60℃水浴孵育1h,并不时振荡,即得阿霉素隐形脂质体（DOX-SL）。

DOX-SL混悬于柠檬酸-磷酸盐溶液（pH4.0）中,每10微摩尔膜材中分别加入0.5mol/LEDC和0.5mol/LS-NHS的水溶液各360µL,室温下反应10min。

然后用1mol/LNaOH调pH至7.5,每微摩尔磷脂（DSPC和DSPE-PEG2000-COOH）中加入Tf125µg,4℃搅拌8h,即得转铁蛋白修饰的阿霉素隐形脂质（Tf-DOX-SL）。

SepharoseCL-4B去除游离Tf,所得脂质体于4℃冷藏备用。

2.2脂质体包封率的测定

精密量取载药脂质体混悬液0.5mL加至预先用PBS（pH7.4）平衡好的SephadexG-50分子筛凝胶柱上,用PBS洗脱,收集480nm处有吸收的第一峰（DOX-SL）的红色洗脱液直至吸收度接近空白,得到除去游离DOX的含药脂质体溶液共8mL。

取1mL置10mL量瓶中,加入乙醇-异丙醇（1:

4）使脂质体完全破裂,用去离子水定容,摇匀,于480nm处测定吸收度,计算包封率。

并每隔7d取样品,两周内测定脂质体的包封率,计算贮存过程中的渗漏率。

2.3脂质体中磷脂含量的测定

取Tf-DOX-SL200µL,先用乙醇-异丙醇破膜1h,氮气流下吹干,再溶于氯仿2mL中,加显色剂2mL,涡旋离心,硫氰铁铵显色法测定磷脂含量。

2.4BCA试剂盒测定蛋白结合效率

精密量取Tf-DOX-SL0.1mL,加入甲醇0.4mL,涡旋,9000r/min离心10s;再加入氯仿0.2mL,涡旋,9000r/min离心10s;加入水0.3mL,涡旋,9000r/min离心1min,小心除去上层。

在氯仿相和析出的蛋白层中加入甲醇0.3mL。

混合样品,9000r/min离心2min。

除去上清液,氮气流下干燥蛋白。

所得的蛋白溶于PBS（pH7.4）0.1mL中,双辛丁酸（bicinchoninicacid,BCA）试剂盒测定蛋白含量。

蛋白结合效率以µgTf/LmolPL表示。

2.5流式细胞实验考察细胞与DOX的结合

HepG2细胞生长层单层,经胰酶消化后用新鲜的培养液洗1次,吸取一定量的细胞混悬液分别与Tf-DOX-SL、DOX-SL及DOX溶液（DOX质量浓度均为20µg/mL）在37℃水浴中孵育2h,孵育完毕用冷的PBS洗3次,流式细胞仪测定与细胞结合的DOX荧光强度（激发波长为488nm,测定波长为560nm）。

2.6激光共聚实验考察细胞对DOX的摄取

HepG2细胞种植于盖玻片上,贴壁生长至50%汇集,加入T-fDOX-SL、DOX-SL、DOX溶液（DOX质量浓度均为6.0Lg/mL）,置37℃、5%CO2孵箱内培养1h,依次用PBS缓冲液漂洗3次,95%乙醇固定,30%PBS甘油封片。

用激光扫描共聚焦显微镜以480nm波长的激光束激发DOX（激发波长480nm,检测波长540nm）进行图象分析。

2.7体外细胞毒试验

HepG2细胞在37℃、5%CO2孵箱内培养。

取对数生长期的细胞,稀释成每毫升0.4×104个细胞,加在96孔培养板上,每孔100µL;分别加入Tf-DOX-SL、DOX-SL、DOX溶液及RPMI1640（对照组）,DOX每组设6个浓度,分别为100,50,25,12.5,6.25,3.13µmol/L,分别培养8h;用冷的PBS洗3次,继续孵育40h,每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20µL,孵箱内孵育4h,置酶标仪上检测,检测波长570nm。

2.8体内分布

大鼠,雄性,体重190~210g,;ICR小鼠,雌雄各半,体重18~22g,

色谱条件

色谱柱:

DikmaDiamonsilC18柱（150mm×4·6mm,5μm）,检测波长:

激发波长480nm,发射波长550nm;流动相:

乙腈-5mmol/L乙酸铵水溶液（30∶70）,pH3。

5;流速:

1.0mL/min;柱温:

30℃。

　药代动力学研究

2·8·1　血浆样品的处理　吸取大鼠血浆200μL,置离心管中,加入内标盐酸柔红霉素（4μg/mL）50μL及乙腈750μL,涡旋振荡30s后,4℃下15000r/min离心10min,吸取上清液20μL,用HPLC分析。

2·8·2　标准曲线的制备　

分别取空白血浆200μL,精密加入不同量的DOX及等量柔红霉素,使血浆中DOX质量浓度分别为0.02,0.04,0.1,0.2,0.4,1.0,2.0,4.0μg/mL。

按“2·8·1”项下方法进行测定,记录色谱峰。

以DOX峰面积与内标峰面积的比值（ADOX/ADNM）对DOX在血浆中的浓度进行线性回归。

2·8·3　药代动力学　

18只雄性大鼠,随机分为3组,分别尾静脉注射I-DOX、L-DOX和Tf-L-DOX,剂量均为5mg/kg,分别于给药后5,15,30,45min及1,2,4,8,12,24,36,48,72,96h眼眶取血0.5mL,置肝素化试管中,分离血浆0.2mL,置-20℃冰箱保存,供测定血药浓度用。

2·8·4　数据处理　将大鼠血浆药物浓度-时间数据用3P97药代动力学计算程序进行模型拟合,以AIC值为拟合度指标,判断房室模型并计算出药物动力学参数。

2·9　组织分布研究

2·9·1　组织样品的处理　

分别取荷瘤小鼠心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织,精密称定,置塑料试管中,精密加入内标盐酸柔红霉素（5μg/mL）60μL,加入流动相1.44mL,分散匀浆,4℃下15000r/min离心10min,吸取上清液20μL,用HPLC分析。

标准曲线的制备　分别取荷瘤小鼠心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织空白组织（各取0.1g）,精密称定,置塑料试管中,精密加入不同量的DOX及等量内标,使组织中DOX浓度分别为0.6,1.2,3.0,6.0,12.0μg/g。

液相分析记录色谱峰。

以DOX峰面积与内标峰面积的比值（ADOX/ADNM）对DOX在组织中的浓度进行线性回归。

组织分布　将126只荷瘤小鼠随机平均分成3组,分别尾静脉注射I-DOX、L-DOX和Tf-L-DOX,剂量均为5mg/kg,分别于给药后1,3,5,12,24,48,96h时间点取6只小鼠,分别摘眼球取血后,颈椎脱臼处死,取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织,生理盐水洗净,吸湿后称重,置-20℃冰箱保存,供测定组织浓度用。

数据处理　

根据文献,以相对摄取率（relativetissueexposure,Re）为考察指标,评价靶向性。

AUC按梯形法进行计算:

AUC0→t=Σ（ci+ci-1）×（ti-ti-1）/2

AUC0→∞=AUC0→t+cn/λn

Re=（AUCi）c/（AUCi）s

其中cn为最后采样时间点的浓度,λn为末端相消除速率常数,tn为最后采样时间。

式中AUC是由药物经时曲线算得的第i个器官或组织的曲线下面积;c表示在某一器官组织内L-DOX或Tf-L-DOX的药物分布情况;s表示在上述相同器官组织内I-DOX的分布情况。

Re大于1表示脂质体在该组织有靶向性,Re愈大靶向效果愈好,Re小于1则表示无靶向性

3结果

3.1脂质体的形态、粒径和Zeta电位

以纯水适当稀释Tf-DOX-SL,将其吸附于敷有支撑膜的铜网上,自然晾干后置透射电镜下。

结果显示:

脂质体粒度分布较窄,圆整度和分散度均较好。

以纯水为分散介质,利用粒径仪测得Tf-DOX-SL的粒径大部分集中于43--78nm处,平均粒径为（62±17）nm,Zeta电位为-（30.33±2.08）mV。

3.2包封率的测定

按照UV-Sephadex法测定DOX-SL的包封率。

过SephadexG-50柱时,可明显看到DOX-SL色带的快速下移,肉眼未见游离DOX的红色色带。

从洗脱曲线（图1）中可以看出,游离DOX从63min左右开始被洗脱下来,DOX-SL从21min开始被洗脱下来,

两者可以完全分离。

3批样品的包封率分别为96.4%、95.5%和96.8%,样品含药浓度分别为0.540、0.508和0.527mg/mL。

两周内DOX的渗漏率为0.9%,符合脂质体贮藏期间渗漏率检查的要求。

Figure1Elutionprofilesofdoxorubicin-stealthliposomes（DOX-SL）

（1）andDOX

（2）

3.3蛋白结合效率的测定

蛋白结合效率按BCA试剂盒操作说明进行,其标准曲线为A=-6E-08c2+0.0007c+0.0099（r=0.9996,n=9）,检测范围为20--2000Lg/mL。

Tf-DOX-SL的磷脂含量为（7.26±0.20）Lmol/mL,蛋白含量为（760±32.43）µg/mL,转铁

蛋白的结合效率为100.28µgTf/Lmol磷脂。

3.4流式细胞试验

图2可见,HepG2细胞与Tf-DOX-SL、DOX-SL及DOX溶液分别共同孵育2h后,与细胞结合的DOX的荧光强度从大到小依次为:

DOX溶液、Tf-DOX-SL、DOX-SL。

与DOX-SL相比,HepG2细胞与Tf-DOX-SL孵育后,与细胞结合的DOX的浓度增加。

3.5激光共聚焦试验

利用激光共聚焦显微镜法考察HepG2细胞对DOX的摄取,结果见图3。

HepG2细胞与不同DOX制剂共同孵育后,Tf-DOX-SL组HepG2细胞内的DOX荧光强度明显高于DOX-SL组,DOX溶液组细胞内荧光强度最大。

这一结果与流式细胞试验结果相似,表明Tf修饰脂质体后能够促进药物向细胞内传递。

Figure2Flowcytometricmeasurementofdoxorubicin（DOX）uptake

byHepG2cellsafterincubatedwiththreepreparations

Figure3ConfocalmicroscopyofHepG2cellsafterincubationwith

DOX-SL（A）,T-fDOX-SL（B）andDOXsolution（C）for1hat37e.

AllthreeDOXformulationshavingDOXconcentrationof610Lg/mL

3.6体外细胞毒实验

48h细胞毒实验结果（见图4）表明,Tf-DOX-SL对肝癌细胞HepG2的杀伤作用显著优于DOXSL（两者的IC50分别为20.4Lmol/L和166.2Lmol/L,P<0.01）。

在DOX浓度达到100Lmol/L时,DOX溶液对肝癌细胞的杀伤率达96.8%,Tf-DOX-SL则为80.2%,而DOX-SL仅为40.3%。

Figure448hCytotoxicityassayofthethreepreparationsofDOXto

HepG2cells

3.7色谱行为

DOX和柔红霉素的保留时间分别为4·7min和10·7min,DOX与柔红霉素达到完全分离,血浆与组织中内源性物质均不干扰DOX和内标的色谱峰。

3.7.1　药代动力学

以测得的DOX峰面积与内标峰面积的比值（ADOX/ADNM）对DOX在血浆中的浓度进行线性回归:

y=0.7235x+0.0082（r=0.9998）,说明DOX血浆浓度在0.02~4.0μg/mL范围内线性关系良好。

3种DOX制剂在大鼠体内的血药浓度-时间曲线见图1,经房室模型拟合,I-DOX、L-DOX和Tf-L-DOX静脉注射给药后血药浓度随时间的变化均符合三室模型。

各主要药代动力学参数见表1。

Figure1　Meandrugconcentrationversustimeinratsplasmaatdose

of5mg/kgafterivadministrationofdoxorubicininjection（I-DOX）,

DOXliposomes（L-DOX）andL-DOXmodifiedwithtransferrin（Tf-L-

DOX）（x±s,n=6）

c

DOX在心、肝、脾、肺、肾和肿瘤中线性关系均良好。

高、中、低3个浓度的日内、日间差分别为3.1%~6.2%,1.6%~6.3%,方法回收率为97.7%~100.6%,符合测定要求。

荷瘤小鼠静脉注射3种DOX制剂后,用HPLC法于不同时间点测定心、肝、脾、肺、肾、肿瘤中DOX色谱峰,计算各组织中DOX含量。

结果见图5。

Fig.5.Tissuesdistributionofmiceafteri.v.injectionofFreeDOX（_）,SL-DOX（_）andTf-SL-DOX（_）.DOXinsolutionorwithinSL-orTf-SL-liposomes（DOX:

5mg/kg）was

injectedviatailveinsoftumor-bearingmice.Atvarioustimesthereafter,themicewerethensacrificedbycervicaldislocation,andtheheart,liver,spleen,lung,kidneyand

tumorwereimmediatelyexcised.DOXlevelsweremeasuredbyHPLC.Dataareshownasmeansandstandarddeviation（n=5–6）.

由相对摄取率公式计算脂质体组各组织Re参数值见表2。

Re1代表AUCL-DOX/AUCI-DOX,Re2代表AUCTf-L-DOX/AUCI-DOX。

结果显示,Tf-L-DOX与L-DOX在荷瘤小鼠心、肾中的AUC较I-DOX有降低趋势;Tf-L-DOX与L-DOX在荷瘤小鼠肝、脾、肺、肿瘤中的AUC较DOX明显升高,其中Tf-L-DOX在荷瘤小鼠肿瘤中的AUC与Re均较L-DOX也有显著增加。

4讨论

本实验用交联剂将Tf通过共价结合的方式连接到脂质体表面,交联剂选择不合适或反应条件不当,交联率则可能较低,交联过程也可能影响脂质体或药物的稳定性。

本文参照文献方法,利用EDC和S-NHS为交联剂,将Tf连接到脂质体表面。

EDC与脂质体上的羧基反应,形成氨基反应活性的R-酰基脲中间体。

该中间体在水溶液中很不稳定,易水解暴露出羧基以及N-酰基脲。

通过加入S-NHS,可以将该中间体转化为氨基反应活性的S-NHS酯,大大提高了EDC介导的缩合反应的效率,从而提高了蛋白结合效率。

流式细胞分析法测定的是与细胞结合的所有DOX的荧光强度,包括吸附在细胞表面的DOX、细胞内的DOX以及被吸附或被内吞的脂质体DOX。

DOX溶液与细胞共同孵育后所测得的DOX荧光强度远高于与两种DOX脂质体孵育后的荧光强度,需要指出的是,DOX包载入脂质体后,其荧光可能猝灭,结果使实际测得的荧光强度偏低。

细胞毒实验表明在DOX浓度达到100µmol/L时,Tf-DOX-SL对肝癌细胞的杀伤率达80.2%,而DOX-SL仅为40.31%,两者相比差异有显著性（P<0.01）,说明Tf-DOX-SL对肝癌细胞有高效杀伤作用。

虽然体外实验中游离的DOX更容易进入肿瘤细胞,所产生的细胞毒也最大,但在体内情况却不一样,静脉注射游离的DOX或DOX-SL后,游离的DOX在体内迅速被清除,导致血药浓度迅速降低,从而到达肿瘤组织的DOX浓度也远低于其脂质体。

有研究表明,游离的DOX在体内的清除速率是PEG修饰的DOX脂质体的450倍。

运用现代分子设计思想和先进合成技术在DOX-SL表面用Tf进行修饰,使其具有靶器官、靶组织和靶细胞所要求的选择性,是Tf靶向制剂研究的发展趋势。

DOX-SL表面的活性羧基是其化学修饰的最佳位点。

本实验探讨了Tf修饰的DOX-SL形态、粒径、稳定性、包封率、蛋白结合效率、体外细胞结合及细胞毒等性质,为进一步研究Tf-DOX-SL在体内的相关特征等提供了实验依据和参考。

DOX在pH3.0~6.0介质中比较稳定,为保证DOX在色谱柱中的稳定性,流动相须加醋酸调节pH值。

若醋酸浓度过低,DOX经过色谱柱时易分解,而醋酸浓度过高,则DOX峰型变宽。

本实验通过选择,选用冰醋酸调节pH至3·5。

本实验参照有关文献,建立了大鼠血浆和组织中DOX提取方法和HPLC-荧光检测法,该方法简单快速,血浆和组织中内源性杂质不干扰DOX的测定,专属性强。

药代动力学研究结果表明,转铁蛋白修饰的DOX脂质体较游离的DOX在血浆中的药物浓度显著提高体内清除率显著降低,在循环系统内的滞留时间显著延长,提示转铁蛋白修饰脂质体具有药效强、消除慢、药物体内维持时间长的特点,因此其临床给药的间隔时间可以适当延长,以利于提高患者的依从性。

结果还显示,Tf-L-DOX与L-DOX

的药代动力学参数差别不大,说明转铁蛋白修饰对脂质体本身的药代动力学特征没有明显影响,这可能是由于两者在粒径、包封率等药剂学特性差别不大。

从荷瘤小鼠各组织中DOX的浓度可以看出,Tf-L-DOX与L-DOX可使小鼠肿瘤部位的药物含量显著增加,心和肾的药物含量明显降低。

实验结果表明,Tf-L-DOX与L-DOX能够降低DOX对心和肾的毒性,同时与肝、肺、肿瘤组织有较强的亲和力,从而提高了DOX在肝、肺、肿