3工作手册第四章第三节农药残留旧.docx
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3工作手册第四章第三节农药残留旧
第三节农药残留量监测的标准操作程序
一、植物性食品中有机磷农药测定的标准操作程序
植物性食品中有机磷农药测定的标准操作程序如下：
1适用范围
本程序适用于植物性样品中有机磷类农药残留的气相色谱法、气相色谱质谱联用法测定。
本程序的定量限0.01~0.03mg/kg,检出限为0.005~0.01mg/kg。
2原理
试样经乙腈提取，氯化钠分层，有机相浓缩液经CARB/NH2固相萃取柱净化，用GC/MS或者GC-FPD进行定性定量分析
3试剂
3.1乙腈：
分析纯。
3.2丙酮：
色谱纯。
3.3二氯甲烷：
色谱纯。
3.4氯化钠：
分析纯。
3.5无水硫酸钠：
分析纯，600℃灼烧3h。
3.6各农药标准品：
见表1。
3.7标准储备液配制：
称取各农药标准品各0.0500g,用丙酮溶解并定容至50mL，摇匀，浓度为1.00mg/mL。
吸取上述溶液10.0mL于100mL的容量瓶中，用丙酮定容至刻度，摇匀，浓度为100ug/mL。
3.8标准工作液的配制：
按照需要，吸取各农药标准储备液，10倍法稀释至所需浓度，有机磷农药稀释至1.0μg/mL，配制成混合标准工作溶液。
3.9淋洗液配制：
用体积比为1∶1的丙酮和二氯甲烷的混合溶液做为淋洗液。
4仪器设备
4.1气相色谱仪，带Ms或者FPD检测器。
4.2色谱柱：
DB-1701石英毛细管色谱柱（30m×320μm（i.d.）×0.25μm（膜厚））；DB-1石英毛细管色谱柱（30m×320μm（i.d.）×0.25μm（膜厚））或者相当的。
4.3组织捣碎机。
4.4旋转蒸发仪。
4.5高脚烧杯、具塞量筒、平底烧瓶等玻璃仪器。
4.6固相萃取柱：
Carb/NH2规格500mg/500mg/6mL。
5操作步骤
5.1样品采集：
样品采集的标准化是获得准确数据的基础，抽样必须是随机的和有代表性的，能反映出样品的真实情况。
5.2样品的制备和保存：
取一定量（新鲜样品1kg左右，干性样品50g左右），新鲜样品初步切碎混匀（注意：
样品无需洗涤，不要切的太碎，以免果蔬的组织液汁流失），干性样品磨碎过20目筛，四分法取样。
所取的样品平均分为2份，1份供测定，另1份放置于-20℃冰箱中保存，备用。
5.3提取：
称取切碎或磨碎混匀的样品一定量，新鲜样品30g于高脚烧杯中，加入60mL乙腈，用高速组织匀浆机匀浆1min左右；干性样品（如茶叶）5g与具塞三角瓶中，加入30mL丙酮，超声提取30min；新鲜样品提取液经布氏漏斗抽滤，滤液倒入100mL具塞量筒（事先加入10g氯化钠）中，剧烈震荡，待分层清晰后，吸取上层溶液30mL，过无水硫酸钠于100mL平底烧瓶中，45℃水浴中减压浓缩近干，待净化；干性样品滤液直接过无水硫酸钠于100mL平底烧瓶中，45℃水浴中减压浓缩近干，待净化。
5.4净化：
用（1+1，体积比）丙酮+二氯甲烷的混合溶液做为淋洗液，先用5mL淋洗液活化Carb/NH2柱，然后用1mL淋洗液洗涤平底烧瓶3次，并分别把洗涤液转移到Carb/NH2柱上，液面到达SPE柱筛板表面后，再加入淋洗液12mL，收集此15mL淋洗液于50mL平底烧瓶中，45℃水浴中减压浓缩至近干，氮气吹干用1mL丙酮准确定容，待GC/MS分析测定。
5.5仪器条件
5.5.1气相色谱参考条件
色谱柱：
DB-1701石英毛细管色谱柱（30m×320μm×0.25μm）；氮气：
氦气（纯度＞99.99％）；程序升压：
初始压力10Psi（10Psi＝68.966kPa），保持30min，40mL／min升至20Psi，保持10min；柱温（程序升温）：
初始温度：
50℃（保持0min），20℃／min升至200℃（保持20min），40℃／min升至240℃（保持10min）；进样口温度：
250℃；FPD检测器温度250℃；尾吹气：
30mL／min；进样方式：
分流进样；分流比：
5∶1；进样量：
1μL。
5.5.2气质联用参考条件
色谱柱：
DB-1701石英毛细管色谱柱（30m×320μm（i.d.）×0.25μm（膜厚））；
载气：
氦气（纯度＞99.99％）；
恒流：
1.0ml/min，不分流进样；
进样口温度：
250℃；
离子源温度：
230℃；
接口温度：
280℃；
电子能量：
70ev；
柱温（程序升温）：
初始温度：
80℃（保持1min），20℃／min升至180℃（保持2min），10℃／min升至220℃（保持0min）,10℃／min升至280℃（保持20min）；
溶剂延迟：
4min
5.6色谱图
见图1（图中1~27见表1）
图1有机磷农药色谱图
5.7保留时间
有机磷农药保留时间见表1。
表1有机磷农药出峰顺序（色谱柱DB-1701，GC-FPD检测器）
编号
农药
参考保留时间
检出限mg/kg
定量限mg/kg
1
敌敌畏
7.177
0.005
0.015
2
甲胺磷
8.015
0.005
0.015
3
乙酰甲胺磷
10.248
0.006
0.02
4
灭线磷
10.590
0.006
0.02
5
甲拌磷
11.360
0.006
0.02
6
氧化乐果
12.604
0.01
0.03
7
乙拌磷
13.341
0.006
0.02
8
氯唑磷
14.437
0.006
0.02
9
久效磷
14.892
0.006
0.02
10
乐果
14.490
0.01
0.03
11
甲基毒死蜱
15.591
0.01
0.03
12
皮蝇硫磷
16.300
0.01
0.03
13
甲基立枯磷
16.822
0.006
0.02
14
甲基嘧啶磷
18.093
0.006
0.02
15
毒死蜱
18.498
0.01
0.03
16
甲基对硫磷
18.651
0.01
0.03
17
嘧啶磷
19.317
0.01
0.03
18
马拉硫磷
19.624
0.01
0.03
19
杀螟硫磷
20.154
0.01
0.03
20
对硫磷
21.889
0.006
0.02
21
杀扑磷
28.325
0.01
0.03
22
丙溴磷
28.468
0.01
0.03
23
乙硫磷
30.911
0.01
0.03
24
三唑磷
32.496
0.01
0.03
25
哒嗪硫磷
35.299
0.01
0.03
26
亚胺硫磷
35.740
0.01
0.03
27
伏杀硫磷
37.751
0.01
0.03
5.8监测离子
监测离子见表2。
表2有机磷农药GC/MS监测离子
农药名称
英文名称
保留时间
定量离子
定性离子
敌敌畏
Dichlorvos
6.019
109
185
220
—
甲胺磷
Methamidophos
6.796
94
141
126
111
乙酰甲胺磷
Acephate
7.684
136
94
142
183
灭线磷
Ethoprophos
9.923
158
139
126
200
甲拌磷
Phorate
10.569
260
121
231
153
氧化乐果
Omethoate
11.369
110
156
126
141
乙拌磷
Disulfoton
11.963
88
274
186
—
异稻瘟净
Iprobenfes
12.380
204
246
288
—
氯唑磷
Isazofos
13.015
161
257
285
172
久效磷
Monocrotophos
12.586
127
192
223
164
乐果
Dimethoate
12.838
87
93
229
143
甲基毒死蜱
chlorpyrifos-methyl
12.746
286
288
197
—
皮蝇硫磷
Tenchlorphos
13.015
125
285
198
167
甲基立枯磷
tolclofos-methyl
13.101
265
267
250
—
甲基嘧啶磷
pirimiphos-methyl
13.238
290
276
305
—
毒死蜱
Chlorpyrifos
13.552
314
258
286
—
甲基对硫磷
parathion-methyl
13.872
109
125
263
—
嘧啶磷
pirimiphos-ethyl
13.901
304
318
333
—
马拉硫磷
Malathion
14.078
173
158
143
—
杀螟硫磷
Fenitrothion
14.255
277
260
247
—
对硫磷
Parathion
14.661
291
186
235
263
杀扑磷
Methidathion
15.821
145
125
193
—
丙溴磷
Profenofos
15.827
339
374
297
—
乙硫磷
Ethion
16.919
231
384
199
—
三唑磷
Triazophos
17.844
161
172
257
—
哒嗪硫磷
pyridaphenthion
19.073
340
199
188
—
亚胺硫磷
Phosmet
19.479
160
161
317
—
伏杀硫磷
Phosalone
20.182
182
367
154
—
6计算
按公式
（1）计算。
………………………………
（1）
式中：
Rx——待测样品中农药残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
R1——标准品中农药浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；
A1——标准品中农药的峰高或峰面积；
A2——待测样品中农药的峰高或峰面积；
V1——标准品进样体积，单位为微升（µL）；
V2——待测样品进样体积，单位为微升（µL）；
V——待测样品定容体积，单位为毫升（mL）；
G——待测样品量，单位为克（g）。
7精密度
每个样品都应进行平行双样测定，在农药含量为0.50mg/kg及以上时，其平行测定的相对相差应小于20%。
8说明
8.1为最大限度地提高提取效率，试样都应进行完全的破碎。
如果温度等因素对提取效率、被分析物稳定性或溶剂损失等有影响，则必须对这些因素加以控制。
8.2抽出物蒸发时必须非常小心，避免蒸发干导致一些微量的被分析物造成损失。
为防止出现这种情况，可加入少量高沸点溶剂作为“保护剂”，并把蒸发温度控制得尽可能低。
必须避免用发泡、强烈沸腾或喷雾的方法来浓缩抽出物。
对于小规模蒸发，采用干的氮气流或真空离心蒸发一般比空气流更为可取，因为空气更可能导致发生氧化或导入水分和其它污染物。
在对抽提物稀释定容时，避免进一步的蒸发。
也可以采用一个内标，特别对定容容积比较少时更为适合。
8.3不同厂家生产的固相萃取柱的性能不一致，因此需要预先用标准、加标做试验，同时建议不同批次的柱子先测试其性能。
8.4注意固相萃取柱有一定负载，超过负载净化效果不好，特别是色素，对色素含量高的样品可以采用减少上样量，或两根柱子串联解决。
8.5样品提取溶剂应该是澄清，浑浊需要用无水硫酸钠脱水，蒸发温度控制在40℃左右，不宜太高。
8.6固相萃取柱洗脱时流速控制，让其自然下滴。
8.7对阳性样品可以采用下列方法进行确认：
8.7.1用GC-MS或LC-MS联用技术；
8.7.2改变色谱柱,采用双柱保留时间确认，敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化乐果、乐果也可以根据拖尾峰形判断，除上述几种农药外，其他峰形对称，保留时间按照经验控制在0.02min内。
8.7.3改变检测器,改变检测方法；
8.7.4对于相同种类的蔬菜，可以进行图谱比较确认。
8.8回收率要求：
为保证分析结果的准确，要求添加有机磷浓度在0.05mg/kg左右，计算添加回收率，添加回收率应在60-120%范围之内。
二、蔬菜和水果中有机磷类农药残留量测定的标准操作程序
蔬菜和水果中有机磷类农药残留量固相萃取-气相色谱法测定的标准操作程序如下：
1适用范围
本程序适用于大白菜、卷心菜、生菜、空心菜、油菜、扁豆、豇豆、黄瓜、
萝卜、胡萝卜等蔬菜和苹果、梨、西瓜、桃、草莓、葡萄等水果中有机磷类农药残留量的固相萃取-气相色谱法测定。
本程序的检出限和定量限见表1。
表125种有机磷农药在两种色谱条件下的
方法检出限和定量限单位为毫克每千克
有机磷类农药名称
HP-5
DB-1701
方法检出限
方法定量限
方法检出限
方法定量限
甲胺磷
0.02
0.08
0.03
0.1
乙酰甲胺磷
0.03
0.09
0.2
0.6
氧化乐果
0.05
0.15
0.05
0.16
灭线磷
0.008
0.024
－
－
甲拌磷
0.06
0.18
0.04
0.12
乐果
0.05
0.15
0.05
0.15
乙拌磷
0.018
0.050
－
－
氯唑磷
0.08
0.24
－
－
甲基对硫磷
0.05
0.15
0.05
0.15
甲基毒死蜱
0.006
0.018
0.05
0.15
甲基立枯磷
0.08
0.24
－
－
皮蝇硫磷
0.03
0.10
－
－
杀螟硫磷
0.06
0.18
0.05
0.15
甲基嘧啶磷
0.04
0.12
0.05
0.15
马拉硫磷
0.03
0.09
0.05
0.15
毒死蜱
0.09
0.27
0.05
0.15
对硫磷
0.04
0.12
0.04
0.12
嘧啶磷
0.04
0.12
－
－
杀扑磷
0.03
0.09
0.05
0.15
丙溴磷
0.01
0.03
－
乙硫磷
0.06
0.18
0.04
0.12
三唑磷
0.04
0.12
－
－
哒嗪硫磷
0.02
0.06
－
－
亚胺硫磷
0.05
0.15
0.1
0.3
伏杀硫磷
0.02
0.06
0.02
0.06
2原理
样品经乙腈提取、CARB/NH2柱净化，气相色谱FPD检测器测定，保留时间定性，外标法定量。
3试剂
3.1标准品（固体标准品为优）：
甲胺磷、乙酰甲胺磷、灭线磷、甲拌磷、氧化乐果、乙拌磷、氯唑磷、甲基毒死蜱、乐果、皮蝇硫磷、甲基立枯磷、甲基嘧啶磷、毒死蜱、甲基对硫磷、嘧啶磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、杀扑磷、丙溴磷、乙硫磷、三唑磷、哒嗪硫磷、亚胺硫磷、伏杀硫磷。
3.2乙腈：
色谱级或农残级。
3.3丙酮：
色谱级或农残级。
3.4二氯甲烷：
色谱级或农残级。
3.5无水硫酸钠：
分析纯，使用前500℃烘烤4小时。
3.6氯化钠：
分析纯。
3.7标准溶液的配制：
3.7.1贮备液的配制：
以上25种有机磷农药在使用前分别准确称量，并用丙酮配制成含量为1000µg/mL的标准贮备液，分装、密封并置于冰箱冷冷冻保藏。
根据农药种类及性质，其保存期分为临用现配及可保存1至数周。
对甲胺磷、氧化乐果、乙酰甲胺磷、亚胺硫磷等易变农药建议临用现配。
3.7.2混合标准溶液：
用丙酮将上述标准贮备液（3.7.1）在逐级准确稀释成各种农药浓度为10.0µg/mL的混合标准使用液。
3.7.3标准系列：
用混合标准使用液（3.7.2）稀释成0.20、0.50、1.00、5.00、10.0µg/mL的混合标准系列，可根据仪器对目标化合物响应值的高低调整标准系列浓度。
4仪器与耗材
4.1气相色谱仪，附FPD检测器；
4.2色谱柱：
HP-5（30m×0.25mm×0.25µm）和DB-1701（30m×0.32mm×0.25µm）或相当者。
4.3调速振荡器。
4.4氮吹仪。
4.5高速冷冻离心机（不低于10000r/min）。
4.6CARB/NH2固相萃取柱，500mg/6mL，或者性能相当的。
5操作步骤
5.1样品的制备
将采集的样品去除杂物，取可食用部分，用干净滤纸或微湿的纱布轻轻拭去样品表面附着的脏物，切碎，匀浆后取均匀样品，尽快进行样品处理（当日制备的样品须当日完成提取，以防有机磷分解）。
5.2样品处理
5.2.1提取：
称取均浆后的样品20克（准确至0.01g）于50mL具塞离心管中，加入乙腈30.00mL，拧紧盖子，置于振荡器上振荡30分钟（振荡频率为80～100次/分）后，加入氯化钠5克，再振荡15分钟，取出后在冷冻高速离心机上以10000r/min，4℃离心10分钟，使乙腈与水相分开。
取出恢复至室温后，准确吸取乙腈相15.00mL于50mL离心管中，加入无水硫酸钠5克（含水量大的样品需酌情增加），振荡1min脱水，将溶液转移入容积不低于25mL的浓缩瓶中，并用乙腈洗涤数次，洗液一并转入浓缩瓶中，用氮气吹至近干，加1mL丙酮溶解。
5.2.2净化：
取固相萃取小柱，置合适架子上固定好，用丙酮3mL及二氯甲烷3mL先后淋洗萃取小柱。
当二氯甲烷液面即将到达小柱吸附层表面时，立即将5.2.1的样品液沿小玻棒完全转入萃取柱中，另取一个带刻度的小浓缩瓶接收样液，待液面即将到达小柱吸附层表面时，再分别以丙酮6mL及二氯甲烷6mL先后淋洗小柱，用氮气吹至近干，加丙酮定容至2.0mL。
5.3样品分析
5.3.1仪器参考条件
a）柱温：
HP-5柱：
初始温度120℃，以4℃/min的速度上升到200℃后，保持8min；再以10℃/min的速度上升到280℃，保持5min。
DB-1701柱：
初始温度120℃，以5℃/min的速度上升到200℃，保持4min，再以15℃/min的速度上升到250℃，保持14min。
b）进样模式：
进样量为1µL。
c）分流进样，分流比一般设为50:
1。
d）进样口温度：
240℃。
e）检测器温度：
FPD温度为300℃。
f）柱流量：
HP-5柱为1.8mL/min；
DB-1701柱为2.0mL/min。
5.3.2组分定性及色谱图
本实验采用双柱-保留时间定性法。
首先采用HP-5柱对样品中的目标化合物进行初步定性，可疑阳性样品须采用DB-1701柱进一步确证，目标化合物与标准品的保留时间在双柱上均一致时方可定性。
保留时间如表2所示。
25种有机磷组分在HP-5色谱柱及DB-1701色谱柱的分离图谱如图1及图2所示。
本方法的条件下DB-1701柱不能有效分离杀扑磷及丙溴磷，而甲基对硫磷与甲基毒死蜱、杀螟硫磷与甲基嘧啶磷在HP-5色谱柱不能有效分离，遇到此种情况时应严格使用双柱法对其进行定性。
表225种农药在DB-1701柱及HP-5柱上的保留时间
有机磷类农药名称
在不同色谱柱上保留时间/min
HP-5
DB-1701
甲胺磷
3.592
6.525
乙酰甲胺磷
6.951
11.485
氧化乐果
10.960
14.541
灭线磷
12.224
11.934
甲拌磷
13.991
13.024
乐果
14.981
17.377
乙拌磷
17.579
15.551
氯唑磷
18.328
16.548
甲基对硫磷
20.136
19.929
甲基毒死蜱
20.136
17.086
甲基立枯磷
20.380
17.854
皮蝇硫磷
21.034
17.695
杀螟硫磷
21.965
21.005
甲基嘧啶磷
21.965
18.431
马拉硫磷
22.310
20.778
毒死蜱
22.908
19.166
对硫磷
23.339
21.812
嘧啶磷
25.044
20.413
杀扑磷
26.756
23.547
丙溴磷
29.110
23.547
乙硫磷
33.963
25.350
三唑磷
35.398
27.274
哒嗪硫磷
40.230
30.248
亚胺硫磷
40.508
30.990
伏杀硫磷
42.816
32.990
图125种有机磷农药在HP-5色谱柱上的分离图谱
图225种有机磷农药在DB-1701色谱柱上的分离图谱
5.3.3样品中组分定量测定
在定性确认的基础上，针对样品中所含有的农药成分，配制相应的混合标准系列，测定标准系列，制作标准曲线；测定已定性的样品液，以样品中组分峰面积为响应值，标准曲线外标法定量。
6结果计算
试样中农药含量按式
（1）进行计算。
………………………………
（1）
式中：
X——所测样品中农药含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
C——样品测定液中农药浓度，单位为毫克每微升（µg/mL）；
V——定容体积，单位为毫升（mL）；
f——稀释因子（在本方法中为2）
m——取样质量，单位为克（g）。
结果保留三位有效数字。
测定结果的表述：
报告平行样的测定值的算术平均值。
7精密度
每个样品都应进行平行双样测定，在农药含量为0.50mg/kg及以上时，其平行测定的相对相差应小于20%。
8说明
8.1干扰及消除
韭菜、葱、蒜、洋葱等蔬菜进行有机磷类农药残留量检测时应慎重采用本操作规程，因以上类别蔬菜中含有较多干扰成分。
如用此方法检测葱空白样品，所得图谱如下，仪器将把葱中大量的本底干扰物定性为有机磷类农药，因而得到不准确的结果。
图3葱空白样图谱（HP-5色谱柱）
8.2注意事项.
8.2.1由于多数有机磷农药不稳定，因此建议当日样品必须当日处理，至少需完成提取至5.2.1中“……使乙腈与水相分开”。
8.2.2由于有机磷农药不稳定，且多数吸附在试样表面，因此试样不得用水冲洗。
8.2.3固相萃取：
在净化过程中，CARB/NH2固相萃取柱吸咐层上层表面严禁露出液面，否则将导致农药测定结果显著降低。
正确的方法是当前一种液面距吸咐层上表面约1mm时，就立即往萃取柱中加入下一种液体。
11.4浓缩：
浓缩步骤中，样品液严禁完全吹干或挥干，否则回收率将大大降低。
8.2.4如果出现某些目标化合物在上述参考仪器条件下分离度达不到要求的情况，可更换色谱柱或适当改变系统温度。
8.3回收率要求
在取样量为20g，定容量为2mL的条件下，加标量采用0.50mg/kg，回收率以在50-120%为宜。
三、食品中氨基甲酸酯类农药残留量测定的标准操作程序
本操作规程包含A气相色谱法和B液相色谱法两个方法，标准操作程序如下：
A气相色谱法
1适用范围
本程序适用于粮食、蔬菜和茶叶中速灭威、异丙威、残杀威、克百威、抗蚜威和甲萘威六种氨基甲酸酯杀虫剂残留的气相色谱法测定。
本程序的检出限和定量限见表1
表1六种氨基甲酸酯农药的检出限和定量限
农药
速灭威
异丙威
残杀威
克百威
抗蚜威
甲萘威
检出限（mg/kg）
0.0
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