各基因病的引物及PCR参数.docx

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各基因病的引物及PCR参数

杜氏/贝氏进行性肌营养不良（DMD/BMD）的基因诊断引物及PCR参数

引物

PCR参数

产物长度

（bp）

名称

序列（5’-3’）

变性

退火

延伸

循环数

PmF

PmR

5’gaagatctagacagtggatacataacaaatgcatg3’

5’ttctccgaaggtaattgcctcccagatctgagtcc3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

535

3F

3R

5’tcatccatcatcttcggcagattaa3’

5’caggcggtagagtatgccaaatgaaaatca3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

410

4F

4R

5’ttgtcggtctcctgctggtcagtg3’

5’caaagccctcactcaaacatgaagc3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

196

6F

6R

5’ccacatgtaggtcaaaaatgtaatgaa3’

5’gtctcagtaatcttcttacctatgactatgg3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

202

8F

8R

5’gtcctttacacactttacctgttgag3’

5’ggcctcattctcatgttctaattag3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

360

12F

12R

5’gatagtgggctttacttacatccttc3’

5’gaaagcacgcaacataagatacacct3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

331

13F

13R

5’aataggagtacctgagatgtagcagaaat3’5’ctgaccttaagttgttcttccaaagcag3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

238

17F

17R

5’gactttcgatgttgagattactttccc3’

5’aagcttgagatgctctcaccttttcc3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

416

19F

19R

5’ttctaccacatcccattttcttcca3’

5’gatggcaaaagtgttgagaaaaagtc3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

459

43F

43R

5’gaacatgtcaaagtcactggacttcatgg3’

5’atatatgtgttacctacccttgtcggtcc3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

357

44F

44R

5’cttgatccatatgcttttacctgca3’

5’tccatcacccttcagaacctgatct3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

268

45F

45R

5’aaacatggaacatccttgtggggac3’

5’cattcctattagatctgtcgccctac3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

547

47F

47R

5’cgttgttgcatttgtctgtttcagttac3’

5’gtctaacctttatccactggagatttg3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

181

48F

48R

5’ttgaatacattggttaaatcccaacatg3’

5’cctgaataaagtcttccttaccacac3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

546

49F

49R

5’gtgcccttatgtaccaggcagaaattg3’

5’gcaatgactcgttaatagccttaagatc3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

439

50F

50R

5’caccaaatggattaagatgttcatgaat3’

5’tctctctcacccagtcatcacttcatag3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

271

51F

51R

5’gaaattggctctttagcttgtgtttc3’

5’ggagagtaaagtgattggtggaaaatc3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

388

52F

52R

5’aatgcaggatttggaacagaggcgtcc3’

5’ttcgatccgtaatgattgttctagcctc3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

113

60F

60R

5’aggagaaattgcgcctctgaaagagaacg3’

5’ctgcagaagcttccatctggtgttcagg3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

33

139

可将8号、47号、48号

19号、45号、50号

Pm，44号、51号

3号、13号、52号外显子分成四组，进行多重PCR扩增

PCR反应体积20ul，含MgCl21.5mM、四种dNTP各200uM、单条引物60ng、模板DNA100ng，Taq酶1U。

DMD基因内CA重复序列PCR引物

引物

PCR参数

产物长度

（bp）

名称

序列（5’-3’）

变性

退火

延伸

循环数

3'CAF

3'CAR

5’gaaagattgtaaactaaagtgtgc3’

5’ggatgcaaaacaatgcgctgcctc3’

95℃60s

60℃60s

72℃60s

33

119~137

44CAF

44CAR

5’tccaacattggaaatcacatttcaa3’

5’tcatcacaaatagatgtttcacag3’

95℃60s

60℃60s

72℃60s

33

174~204

45CAF

45CAR

5’gaggctataattctttaactttggc3’

5’ctctttccctctttattcatgttac3’

95℃60s

60℃60s

72℃60s

33

156~184

49CAF

49CAR

5’cgtttaccagctcaaaatctcaac3’

5’catatgatacgattcgtgttttgc3’

95℃60s

60℃60s

72℃60s

33

227~257

50CAF

50CAR

5’aaggttcctccagtaacagatttgg3’

5’tatgctacatagtatgtcctcagac3’

95℃60s

60℃60s

72℃60s

33

233~251

PCR反应体积20ul，含MgCl21.5mM、四种dNTP各200uM、单条引物60ng、模板DNA100ng，Taq酶1U。

眼咽型肌营养不良（OPMD）的基因诊断引物及PCR参数

引物

PCR参数

产物长度

（bp）

名称

序列（5’-3’）

变性

退火

延伸

循环数

OPMD-F

OPMD-R

5’cgcagtgccccgccttaga3’

5’acaagatggcgccgccgccccggc3’

95℃15s

70℃30s

74℃30s

35

242

PCR反应体积15ul，含MgCl21.5mM、250umdCTP、dTTP、dATP、125umdGTP、125um7-deaza-dGTP、单条引物100ng、7.5%DMSO、模板DNA100ng，Taq酶1.5U。

强直性肌营养不良（DM）的基因诊断引物及PCR参数

引物

PCR参数

产物长度

（bp）

名称

序列（5’-3’）

变性

退火

延伸

循环数

MD-R

MD-F

5’gctcgaagggtccttgtagcc3’

5’gggggtgcgtggaggatggaa3’

95℃50s

62℃50s

72℃60s

31

正常大小163~250

异常片段大于298

PCR反应体积20ul，含MgCl21.5mM、四种dNTP各200uM、单条引物80ng、模板DNA100ng，Taq酶1U。

遗传性脊髓小脑型共济失调（SCA）1,2,3,6,7型的基因诊断引物及PCR参数

引物

PCR参数

产物长度

（bp）

名称

序列（5’-3’）

变性

退火

延伸

循环数

SCA1-F

SCA1-R

5’caacatgggcagtctgag3’

5’aactggaaatgtggacgtac3’

95℃50s

60℃50s

72℃60s

30

正常大小185~218

异常片段240~353

SCA2-FSCA2-R

5’gggcccctcaccatgtcg3’

5’cgggcttgcggacattgg3’

95℃50s

62℃50s

72℃60s

30

正常大小107~134

异常片段

167~239

MJD-FMJD-R

5’ccagtgactactttgattcg3’

5’tggcctttcacatggatgtgaa3’

95℃50s

58℃50s

72℃60s

25

正常大小202~270

异常片段

372~402

SCA6-F

SCA6-R

5’cacgtgtcctattcccctgtgatcc3’

5’tgggtacctccgagggccgctggtg3’

95℃50s

62℃50s

72℃60s

30

正常大小113~149

异常片段164~182

SCA7-F

SCA7-R

5’cacgactgtcccagcatcactt3’

5’tgttacattgtaggagggcaa3’

95℃50s

57℃50s

72℃60s

30

正常大小290~320

异常片段384~660

PCR反应体积20ul，含MgCl21.5mM、四种dNTP各200uM、单条引物80ng、模板DNA100ng，Taq酶1U。

另外，SCA2,6,7三型PCR反应体系中需加入5%~10%的DMSO或甘油。

Freidreich’s共济失调的基因诊断引物及PCR参数

引物

PCR参数

产物长度

（bp）

名称

序列（5’-3’）

变性

退火

延伸

循环数

Bam

2500F

5’ggagggatccgtctgggcaaagg3’

5’caatccaggacagtcagggcttt3’

92℃60s

68℃1.5min

68℃1min

37

正常片段1.5kb

异常片段2.1kb以上

FD-F

RD-R

5’cagctcccaatttcctcctgtttag3’

5’ctgttcccggcgcggatacttact3’

95℃60s

58℃60s

72℃2min

32

463

探针PCR反应体积20ul，含MgCl21.5mM、四种dNTP各200uM、单条引物60ng、模板DNA100ng，Taq酶1U。

长片段PCR反应体积50ul，含MgCl21.5mM、四种dNTP各350uM、单条引物300nM、模板DNA100ng，Taq酶4U。

毛细血管扩张型共济失调（AT）的基因诊断引物及PCR参数

引物

PCR参数

产物长度

（bp）

名称

序列（5’-3’）

变性

退火

延伸

循环数

D11S2179H2-CA

D11S2179H2-GT

5’-taggcaatacagcaagaccctg3’

5’-gcactggaatacgattctagcac3’

95℃60s

62℃60s

72℃60s

30

130~144

D11S1819A4LCA

D11S1819A4RGT

5’-gtgaaaggccagatggtccaac3’

5’-cctatttgcagaaaacctactgt3’

95℃60s

62℃60s

72℃60s

30

130~170

D11S1818A2LCA

D11S1818A2RGT

5’-cttccagcctgctcaaaacaa3’

5’-tgcccaggggctttaagagag3’

95℃60s

62℃60s

72℃60s

30

140~170

PCR反应体积20ul，含MgCl21.5~2.0mM、四种dNTP各200uM、单条引物60ng、模板DNA100ng，Taq酶1.5U。

七、儿童型进行性脊肌萎缩症（SMA）的基因诊断引物及PCR参数

引物

PCR参数

产物长度

（bp）

名称

序列（5’-3’）

变性

退火

延伸

循环数

X7-Dra

RIII

5’ccttccttctttttgattttgttt3’

5’acactggtacttttcattgt3’

94℃60s

59℃60s

72℃60s

30

200

541C960

541C1120

5’gtaataaccaaatgaatgtgaa3’

5’ctacaacacccttctcacag3’

94℃60s

55℃60s

72℃60s

30

200

Exon7

内对照

5’acactggtacttttcattgt3’

5’agagaaatgctaggaaaag3’

94℃60s

59℃60s

72℃60s

30

649

C161A

C161B

5’ggcttcctcctgagtatgca3’

5’gtttcactggatggaacggc3’

94℃60s

62℃60s

72℃60s

30

165

C212A

C212B

5’cctccaccctgggtgataag3’

5’gctgatgaagttgtaggaggc3’

94℃60s

60℃60s

72℃60s

30

233

C272A

C272B

5’tagagacggggtttcggcat3’

5’gatctgccttccttcctgc3’

94℃60s

62℃60s

72℃60s

30

220

PCR反应体积20ul，含MgCl21.5mM、四种dNTP各200uM、单条引物60ng、模板DNA100ng，Taq酶2U。

腓骨肌萎缩症（CMT）PMP22、MPZ和CX32基因诊断引物及PCR参数

MPZPCR-SSCP引物

引物

PCR参数

产物长度

（bp）

名称

序列（5’-3’）

变性

退火

延伸

循环数

1F

1R

5’cccgttcagttcctggt3’

5’gtcccaagactcccagagta3’

95℃60s

57℃60s

72℃60s

30

171

2F

2R

5’cttcctctgtatcccttactg3’

5’ctccttagcccaagttatct3’

95℃60s

57℃60s

72℃60s

30

290

3F

3R

5’tcattagggtcctctcacatgc3’

5’gcctgaataaaggtccttaggc3’

95℃60s

57℃60s

72℃60s

30

370

4F

4R

5’ggagtcctacatcctcaatgcag3’

5’cccacccactggagtagtctccg3’

95℃60s

57℃60s

72℃60s

30

310

5F

5R

5’gaagaggaagctgtgtccgc3’

5’cacatcagtcaccgagcgact3’

95℃60s

57℃60s

72℃60s

30

245

6F

6R

5’agtcgctcggtgactgat3’

5’tagctccatctcgatgacca3’

95℃60s

57℃60s

72℃60s

30

225

PCR反应体积20ul，含MgCl21.5mM、四种dNTP各200uM、单条引物60ng、模板DNA100ng，Taq酶1U。

PMP22PCR-SSCP引物

引物

PCR参数

产物长度

（bp）

名称

序列（5’-3’）

变性

退火

延伸

循环数

1F

1R

5’ctcctcgcaggcagaaactc3’

5’ctgaaccagcaggagcacggg3’

95℃60s

60℃60s

72℃60s

30

202

2F

2R

5’tcaggatatctatctgattctc3’

5’aagctcatggagcacaaaacc3’

95℃60s

58℃60s

72℃60s

30

160

3F

3R

5’tggccagctctcctaac3’

5’caccccgcttccacatg3’

95℃60s

64℃60s

72℃60s

30

220

4F

4R

5’gccatggactctccgtc3’

5’cctatgtacgctcagag3’

95℃60s

60℃60s

72℃60s

30

265

PCR反应体积20ul，含MgCl21.5mM、四种dNTP各200uM、单条引物60ng、模板DNA100ng，Taq酶1U。

Cx32基因PCR-SSCP引物序列表

引物

PCR参数

产物长度

（bp）

名称

序列（5’-3’）

变性

退火

延伸

循环数

C1F

C1R

5’ggtgtttgcaggtgtgaatg3’

5’attggtcatagcaaacgctg3’

95℃60s

60℃60s

72℃60s

30

229

C2F

C2R

5’ccttcatctgcaacacactc3’

5’acaccacgctgatgacatag3’

95℃60s

60℃60s

72℃60s

30

273

C3F

C3R

5’gaggtgaagaggcacaagg3’

5’aagacggttttctcggtgg3’

95℃60s

60℃60s

72℃60s

30

215

C4F

C4R

5’ggtcaagtgcgacgtctac3’

5’ctcagcagcttgttgatctc3’

95℃60s

60℃60s

72℃60s

30

264

C4F

C4R

5’ccgcctctcacctgaatac3’

5’agtaatccccagcaggcag3’

95℃60s

60℃60s

72℃60s

30

247

PCR反应体积20ul，含MgCl21.5mM、四种dNTP各200uM、单条引物60ng、模板DNA100ng，Taq酶1U。

CMT重复突变及HNPP缺失突变引物

引物

PCR参数

产物长度

（bp）

名称

序列（5’-3’）

变性

退火

延伸

循环数

disF

proxR

5’gctcaattttggtgtttaaatcag3’

5’atcctctagttacccctttattt3’

95℃40s

55℃45s

72℃3min

30

2185

proxR

disR

5’ttggattcaaagatattagtgttat3’

5’ctcatgtcattagaccaaagagt3’

95℃40s

55℃45s

72℃3min

30

2145

长片段PCR反应体积50ul，含MgCl21.5mM、四种dNTP各350uM、单条引物300nM、模板DNA100ng，Taq酶4U。

CMT-RFLP探针引物序列

引物

PCR参数

产物长度

（bp）

名称

序列（5’-3’）

变性

退火

延伸

循环数

PR

PF

5’tgctctccttgattttgcta3’

5’aggtagtattttctgcccaa3’

95℃60s

56℃60s

72℃60s

30

267

PCR反应体积20ul，含MgCl21.5mM、四种dNTP各200uM、单条引物60ng、模板DNA100ng，Taq酶1U。

九、亨廷顿病（HD）的基因诊断引物及PCR参数

引物

PCR参数

产物长度

（bp）

名称

序列（5’-3’）

变性

退火

延伸

循环数

HD1

HD482

5’atgaaggccttcgagtccctcaagtccttc3’

5’ggctgaggaggaagctgaggag3’

95℃60s

65℃60s

72℃60s

30

HD1

HD3

5’atgaaggccttcgagtccctcaagtccttc3’

5’ggcggtggcggctgttgctgctgctgctgc3’

95℃60s

68℃90s

72℃90s

35

正常片段200

异常片段100

PCR反应体积25ul，含MgCl21.5mM、250umdCTP、dTTP、dATP、75umdGTP、175um7-deaza-dGTP、单条引物100ng、模板DNA50-100ng，Taq酶1.5U。

第二次PCR反应体积25ul，含MgCl21.5mM、250umdCTP、dTTP、dATP、75umdGTP、175um7-deaza-dGTP、单条引物100ng、取第一次PCR反应产物1ul为，Taq酶1.5U。

十、肝豆状核变性（WD）的基因诊断引物及PCR参数

引物

PCR参数

产物长度

（bp）

名称

序列（5’-3’）

变性

退火

延伸

循环数

D13S316

gcagcaatgctttgtgcataa

tgtttcccaccaatcttaccg

95℃50s

62℃50s

72℃60s

34

138~154

D13S133

gctaggactacaggttgcaaaccggcaacatagggaaaccctagc

95℃50s

68℃50s

72℃60s

34

134~187

D13S314

gagtggaggaggagaaaagagtgtgactggatggatgtga

95℃50s

64℃50s

72℃60s

34

137~163

WND5

cctgggtctgtgggattctaaaggtgactacaatttttaatga

95℃50s

60℃50s

72℃60s

32

WND8

tctctggtcatcctggtggt

ctttgccaagtgttggagcc

95℃50s

62℃50s

72℃60s

32

126

WND14

tccatctgtattgtggtcag

cagctaggagagaaggacat

95℃50s

6