暨南大学分子生物学实验报告.docx

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暨南大学分子生物学实验报告

EGFP基因在大肠杆菌DH-5α中表达

[摘要]EGFP是增强绿色荧光蛋白基因，利用质粒pEGFP－N1通过PCR扩增其中的EGFP目的基因，使其与从E.coliDH-5α提取的表达载体pUC18进行双酶切。

酶切产物进一步纯化后，将其连接成pUC18-EGFP重组质粒。

把重组后的质粒转化进E.coliDH-5α感受态细胞中。

通过蓝白斑实验筛选出重组转化子，提取质粒进行EcoRI和BamHI双酶切后的电泳鉴定是否为成功克隆的重组转化子。

最后在重组成功的E.coliDH-5α中诱导EGFP表达，并进行Westernblotting转膜分析。

[关键词]EGFP；E.coliDH-5α；pUC18；表达；Westernblotting

1实验目的与设计原理

1.1实验目的

将质粒pEGFP－N1的绿色荧光蛋白基因EGFP亚克隆到质粒pUC18中，再把重组的pUC18导入大肠杆菌DH-5α中使EGFP进行克隆和表达，由此将分子生物学的一些最基本的实验技术包含在整个实验过程中目的基因。

1.2目的基因

目的基因EGFP为pEGFP－N1中的一段序列，是一段绿色荧光蛋白基因。

可通过引物18F－E（sense）和18A－2（anti－sense）扩增pEGFP－N1中的EGFP基因。

上游引物18F－E:

5’CGGGAATTCGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3’31mer

EcoRIEGFP基因起始区域

下游引物18A－2:

5’TCGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC3’32mer

BamHIEGFP基因终止区域

扩增产物的序列如下所示[蓝色序列分别为EcoRI（G↓AATTC）和BamHI（G↓GATCC）位点，红色序列为EGFP基因的起始和终止密码，带下划线的序列是引物配对区域。

]：

5’CGGGAATTCGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGGATCCCGA3’

1.3载体

选择大肠杆菌pUC18作为载体，质粒分子量为2.7Kb。

图11pUC18质粒图谱

质粒主要由Ampr基因、复制起始序列ori和lacZ－α肽基因等序列组成，lacZ－α肽基因的N端含有多克隆位点。

外源基因在多克隆位点插入后可用传统的蓝白筛选法识别重组子，靶基因可在lac启动子下表达，插入片段的阅读框与lacZ－α肽基因的阅读框一致时能进行融合表达

图12pUC18多克隆位点

1.4设计原理

用引物18F－E（sense）和18A－2（anti－sense）扩增pEGFP－N1中的EGFP基因，扩增产物纯化后除去引物和Taq等杂物，然后用EcoRI（G↓AATTC）和BamHI（G↓GATCC）双酶切，同时载体pUC18也进行相同的双酶切。

载体和靶基因的酶切液分别纯化除去小片段，再进行连接克隆，利用lacZ’的起始密码进行表达，所表达的荧光蛋白的N端有一段由7个氨基酸残基（ThrMetIleThrAsnSerMet—EGFP）组成的融合肽，分子量约28K。

图13重组质粒的构建

1.5分步原理

1.5.1质粒DNA制备

细菌悬浮液暴露在高pH值的强阴离子洗涤剂（如NaOH和SDS）中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。

尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为他们在拓扑学上是相互缠绕的（超螺环结构）。

只要碱处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。

在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS包盖。

当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。

离心除去沉淀，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

在较低pH值和高盐浓度环境下，DNA能与硅胶（Silicagel）可逆结合。

DNA双链与硅化材料相互作用的原理普遍认为是DNA分子中磷酸二酯键在较低pH值和高盐浓度环境下脱水，使得暴露的磷酸基团吸附硅胶。

双链的DNA分子一旦被硅胶吸附，则以天然状态或部分变性状态存在，不能用洗脱RNA或碳水化合物等生物大分子的溶剂（如70％乙醇）将其洗脱下来。

但是，经过水溶性缓冲液（通常为TE或水）重新水化后，DNA就能从层析柱上定量回收。

1.5.2琼脂糖凝胶电泳

在高于等电点的pH溶液中，DNA分子带负电荷（由于糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷），在电场中向正极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子在凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，迁移速度取决于DNA分子本身的大小和构型，与相对分子质量的对数值成反比关系。

质粒有三种构型：

①超螺旋的共价闭台环状质粒DNA（covalentclosedcircularDNA，简称cccDNA）；②开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA的一条单链断裂（opencircularDNA，简称ocDNA）；③线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA的两条单链均发生断裂（linerDNA，简称lDNA）。

这三种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。

因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭或SYBRGold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外线激发下，也能直接检测到。

电泳条件主要取决于被分离的DNA片段的大小。

聚丙烯酰胺凝胶最适合分离小片段DNA（5～500bp）。

它的分辨率非常强，长度上相差lbp或质量上相差0.1％的DNA都可以彼此分离。

虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比在制备和操作上还是更繁琐些。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是在恒定电场中垂直方位上进行的。

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，它用于分离、鉴定和纯化DNA片段。

该技术操作简单而迅速，并且能分离用其他方法如密度梯度离心等不能满意分离的DNA片段。

此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭或SYBRGold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外线激发下，也能直接检测到。

需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样的目的。

1.5.3聚合酶链式反应

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应以两种与靶DNA两侧的两条链杂交的寡核苷酸为引物，经酶促合成特异DNA片段，由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA得以迅速扩增，主要过程如。

置待扩增DNA于高温下解链成为单链DNA模板；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，在72℃条件下由DNA聚合酶进行聚合反应，将单核苷酸加到引物3'，按碱基配对原则5'→3'方向延伸，合成DNA新链。

由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。

图14PCR原理

1.5.4靶DNA的纯化、靶DNA和载体DNA的酶切插入

核酸限制性内切酶能够识别和切割DNA双链上特定的碱基顺序，如EcoRⅠ限制酶的识别和切割序列是：

5’…G↓A—A—T—T—C…3’

3’…C—T—T—A—A↑G…5’

因此，用EcoRⅠ酶切环状双链DNA分子，所产生DNA片段两端都有突出的5’AATT末端（粘性末端）。

BamHⅠ的识别和切割序列为：

G↓GATCC，所产生片段的粘性末端为5’GATC。

限制性内切酶作用于底物DNA时，受到许多要素的制约，主要有以下几个：

1.底物DNA样品的纯度：

在制备DNA样品中，由于各种条件的影响，存在着一些非DNA物质，这些物质有的对酶切反应影响较大，如抽提过程中有机物质的残留成份酚、氯仿、酒精，都会破坏酶的活性，另外未除去的蛋白质，也会干扰酶的反应，残留的染色体DNA则会相对降低酶对底物DNA的浓度。

2.离子浓度：

限制性核酸内切酶的专一性需要镁离子作为辅基，并且要求一定的盐离子浓度。

在使用上，通常把限制性核酸内切酶对盐离子的要求分为三类：

高盐、中盐和低盐，它们所需的Na+分别为100mmol/L、50mmol/L和0。

如果离子浓度使用不当，酶反应不完全或会使酶的识别位点发生改变，例如高盐类的EcoRI酶当Na+离子浓度低于50mmol/L时，它的专一性就降低。

只能识别中间的4个核苷酸序列（此活性记为EcoRI*）

当要进行双酶切时，如果两种酶所需的盐浓度近似，可尝试同时进行酶切，如所需盐浓度差别过大，则先进行低盐酶切，然后在进行高盐酶切。

试验表明，本实验可同时进行双酶切。

3.底物DNA的量：

商品限制性内切酶以酶单位计算，一个酶单位的定义是：

在规定的温度和缓冲液内，于20微升反应液内1小时完全消化1微克DNA所需要的酶量。

所以若果底物DNA的量超过酶的酶单位所规定的消化量，则反应不能完全。

不过商品酶多是浓溶液，每微升常含10单位以上，价格昂贵，所以使用时要尽量节省。

4.酶反应温度与酶反应终止：

大部分限制性核酸内切酶最适的反应温度在37℃，极个别在60℃，所以酶反应后要使酶的活性失活时，可把反应液置于65℃内保温10—15分钟，以终止酶反应，但此法对个别酶（最适温度在60℃的酶）不适合。

5.酶反应时间：

酶消化时间通常依酶的浓度，底物的浓度和纯度而定，通常是30分钟到2个小时，甚至更长些，但不能过长。

因为商品酶极有可能含有杂酶，时间过久，微量的杂酶的酶反应也会积累到干扰整个酶反应的程度。

PCR产物中，含有TaqDNA多聚酶、大量引物及其它杂物，它们会干扰酶切反应。

TaqDNA多聚酶是耐高温的，难以用高温灭活，在酶切体系中将严重干扰酶切反应，如它可补平5’粘性末端等等，因此在酶切反应前一定要将其除去；大量引物的存在可能形成引物二聚体，它们与靶DNA争夺内切酶等，也严重干扰酶切反应。

因此，在酶切反应前，一般要纯化PCR产物，将TaqDNA多聚酶和引物及其它杂物除去。

本实验采用试剂盒纯化，然后用EcoRI和BamHI对纯化的PCR产物和pUC18分别进行双酶切。

1.5.5载体pUC18与EGFP基因片段的连接重组DNA的转化

在体外用EcoRI与BamHI两种酶切割pUC18载体与靶DNA，所得片段的两端均含有不同的粘性末端，将载体片段与靶片段混合后，相同的粘性末端之间可以由氢键相连接，但在两个氢键相连的片段之间5，磷酸和3，羟基未能连上，仍有缺口，本实验通过T4DNA连接酶反应，把这些缺口以共价键连接起来，构成完整的嵌合质粒。

T4DNA连接酶：

是由T4噬菌体DNA编码的酶，可以连接双链分子中3，羟基和5，磷酸，补上其缺口。

它的作用步骤如下：

1.T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物（腺苷酰酶）。

2.酶一AMP复合物再结合到具有5’一磷酸基和3’一羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。

3.产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来

1.5.6大肠杆菌感受态细胞制备重组子的筛选与鉴定

目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。

有人根据pBR322质粒DNA对E•coliK——12X1776菌株的转化结果，认为：

1.大肠杆菌受体菌培养时间为OD600=0.3～0.4（5～6107细胞/毫升）最好；

2.菌体用预冷的CaCl2洗涤二次，效果较好；

3.100mmol/LCaCl2处理可获得最高转化率；

4.菌体在pH为6.0的溶液悬浮时最为适宜。

5.经CaCl2处理过的细胞对表面活性剂非常敏感，所用的玻璃离心管等用具必须严格清洗。

近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0的100mmol/LCaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。

1.5.7重组DNA的转化

实验是把外来重组分子和感受态细胞在低温下混合，使其进入受体细胞。

DNA分子转化的原理较复杂：

1.吸附——完整的双链DNA分子吸附在受体菌表面；

2.转入——双链DNA分子解链，单链DNA分子进入受体菌，另一链降解；

3.自稳——外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA；

4.表达——供体基因随同复制子同时复制，并被转录和翻译。

pUC18上带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。

这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。

在各自独立的情况下,pUC18和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性，但在pUC18转化进入DH5α后，pUC18和DH5α分别产生的β-半乳糖苷酶的N端片段和C端片段融为一体，可形成具有酶活性的蛋白质，这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。

由α-互补产生的Lac＋细菌较易识别，当培养基中加入适量的生色底物X-gal（5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）时，IPTG诱导质粒和染色体上的相应的lacZ操纵子，分别表达β-半乳糖苷酶N端多肽和C端多肽，产生有活性的β-半乳糖苷酶，水解X-gal形成蓝色菌落（但本实验所用的受体菌DH5α可能为lacI—，无需IPTG诱导）。

当外源片段EGFP插入到pUC18质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的N端多肽失去α-互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。

由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。

此为α-互补现象筛选。

因此，外源基因EGFP插入pUC18的多克隆位点的转化子在含有Ap、X－gal和IPTG的LB平板上形成白色菌落，多克隆位点无外源片段插入的载体所产生的转化子是蓝色的，对Amp敏感的非转化子受体菌在加Ap的皿上不能形成菌落。

1.5.8重组DNA的筛选与鉴定

蓝白斑实验中的白色菌落并不一定就是我们所需的重组克隆。

连接反应时，特别是当反应液中未除尽各种含相同末端的小片段时，各种片段之间的连接的可能性相当多，连接液电泳时形成很多条带。

所以选择性培养基上长出的白色菌落可以认为是重组转化子，但很可能不是我们所要的重组子，极可能是假阳性菌落。

对这些白色菌落，需要提取其质粒、EcoRI和BamHI双酶切质粒、酶切产物再进行凝胶电泳作进一步鉴定，看看电泳图谱是否与预期的图谱相符，即白色菌落如果是成功克隆的转化子，其电泳图谱中应出现两条带，大小分别为2675bp和727bp。

如果与预期相符，则可初步认为新构建的质粒已基本重组成功。

普通克隆实验时，一般需通过DNA测序来进一步确认，并检测重组质粒所表达的蛋白质来最终确认。

1.5.9Westernblotting转膜分析

Westernblotting一般由凝胶电泳、样品的印迹和固定化、各种灵敏的检测手段如抗体、抗原反应等三大实验部分组成。

第一步：

凝胶电泳，通常将蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺平板凝胶电泳。

蛋白质与SDS结合后，均带有负电荷，在电场下，按相对分子质量大小在板状胶上排列。

第二步：

印迹和固定化。

把凝胶电泳已分离的分子区带转移并固定到一种特殊的载体上，使之形成稳定的、经得起各种处理并容易检出的，即容易和各自的特异性配体结合的固定化生物大分子。

现用得最多的载体材料为硝酸纤维素膜（NC膜）和一种尼龙衬底的膜（ZB膜），本实验用PVDF（聚偏氟乙烯）膜，它们和生物大分子都是非共价结合。

第三步：

特异性谱带的检出。

印迹在载体上的特异抗原的检出依赖于抗原、抗体的亲和反应。

即将酶、荧光素或同位素标记的特异蛋白分别偶联在特异性抗体的二抗上，再分别用底物直接显色，测荧光，放射自显影等方法检测出我们感兴趣的抗原。

如果无合适抗体用来检测抗原时，可用一般的蛋白染料如丽春红、考马斯亮蓝等，检测转移到膜上的蛋白，验证转移是否成功。

2实验材料与设备

2.1仪器与器皿

高速离心机、微量移液器、1.5mLEP管、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或紫外检测仪、PRC扩增仪（PE2400）、微量取样器、一次性指形管、玻片等、电子天平、微波炉、恒温水浴器、手术刀、移液枪（20μL、200μL、1000μL）、三角瓶（100mL）、吸管、离心柱、灭菌锅、生化培养箱、冰箱、保温瓶、恒温振荡器、分光光度计、电动沉淀离心机、旋涡混合器、电热恒温水浴锅、恒温摇床、平皿、涂布棒微量取样器、微波炉、试管、刻度离心管、保温瓶、酒精灯、平板电泳槽及配套的玻璃板、胶条和梳子（北京六一仪器厂DYCZ－24），普通恒压恒流电泳仪、高电流电泳仪（500mA以上），电泳转移槽及转移夹，海棉块，滤纸，水平摇床等。

2.2菌株与质粒

菌株

E.coliDH-5α

质粒

pEGFP－N1

pUC18

工具酶

规格

公司

TaqDNA多聚酶

5U/μL

TaKaRa

限制性内切酶

TaKaRa

EcoRⅠ酶

BamHⅠ酶

T4DNA连接酶

2.3试剂

1）E.Z.N.A.TMPlasmidMiniKit（OMEGA）：

①HiBindDNA结合柱

②2mLMicrofugeTube

③SolutionⅠ／RNaseA混和液（葡萄糖维持渗透压、Tris－HCl维持pH值、EDTA抑制核酸酶、RNaseA1降解RNA）

④SolutionⅡ（NaOH裂解细胞与核酸变性、SDS裂解细胞与蛋白质变性）

⑤SolutionⅢ（乙酸钾置换钠离子、冰乙酸调节pH值）

⑥HBBuffer（乙酸钠洗脱蛋白质、糖类等大分子杂质）

⑦DNAWashBuffer（70％乙醇洗脱盐离子）

⑧ElutionBuffer（TEpH8.5洗脱质粒DNA）

2）LB完全培养基（1%蛋白胨0.5%酵母粉0.5%NaClpH7.5）

3）100mg/mL氨苄青霉素溶液

4）电泳缓冲液TAE：

0.04mol/LTris—乙酸（pH8.0）和0.001mol/LEDTA

5）6×加样缓冲液：

0.25%溴酚兰和40%w蔗糖

6）溴化乙锭溶液：

5mg/mL溴化乙锭（EB）

7）琼脂糖

8）DNA分子量标记

9）10×PCR缓冲液：

100mmol/LTris-HCl（pH8.3）、500mmol/LKCl、15mmol/LMgCl2

10）dNTP混合液（dATPdGTPdTTPdCTP各2.5mmol/L）

11）无菌水

12）酶切缓冲液：

10×Kbuffer

13）纯化试剂盒（E.Z.N.A.Cycle-PureKit）：

a．HiBindTMDNAMiniColumns

b.2mLCollectionTubes

c.BufferCP

d．DNAWashBuffer

e．ElutionBuffer

14）10×T4连接缓冲液

15）LB液体培养基（1%蛋白胨0.5%酵母粉1%NaClpH7.5）

16）100mmol/LCaCl2

17）氨苄青霉素溶液（100毫克/毫升）

18）X-gal储液（20mg/mL）:

用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/mL的储液,包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏,储存于-20℃。

19）IPTG储液（20mg/mL,即0.8M）:

在800μL蒸馏水中溶解20mgIPTG后,用蒸馏水定容至1mL,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃.

20）含X-gal、IPTG和100μg/mLAp的LB固体培养基4皿。

21）0.5MIPTG溶液

22）20%（m）SDS

23）5×SDS-PAGE电极缓冲液（125mMTris,1.25M甘氨酸,0.5%SDS）

24）1×SDS-PAGE电极缓冲液（25mMTris,0.25M甘氨酸,0.1%SDS）

25）4×分离胶缓冲液

26）4×浓缩胶缓冲液100mL

27）30%丙烯酰胺贮存液100mL

28）1.0MTris-Cl（pH6.8）

29）1×SDS上样缓冲液[0.05MTris-Cl（pH6.8），10%甘油，2%SDS，0.25%溴酚蓝]

30）10%（m）过硫酸铵：

31）TEMED：

购买，4°C冰箱中避光储存；

32）预染BluePlusⅡProteinMarker：

购自TRANS。

33）5×Tris-甘氨酸电转缓冲液储存液（125mMTris,0.96M甘氨酸，无SDS和甲醇）

34）1×电转缓冲液（25mMTris,192mM甘氨酸，0.08%SDS,20%甲醇，用于15-60Kd蛋白质）。

35）5×PBS（5.5mMNaH2PO4，44.4mMNa2HPO4，4.5%NaCl）

36）10%Tween-20

37）1×PBS-Tween-20洗膜及抗体稀释液[1.1mMNaH2PO4，8.88mMNa2HPO4，0.05%Tween-20

38）抗体稀释液及封闭液

39）兔抗GFP的特异性抗体（一抗）溶液30mL

40）辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔二抗溶液

41）显色液

3实验步骤

3.1质粒DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳法

3.1.1质粒DNA