第一章 显微镜技术普通光镜.docx

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第一章显微镜技术普通光镜

第一章显微镜技术

细胞很微小，但结构非常复杂。

绝大多数细胞只能借助显微镜才能观察到，细胞的细微结构要用电镜以及特殊的显微镜才能显示不来。

细胞生物学的发展，正如其他的实验学科一样，在很大程度上依赖于研究技术与工具的改进。

如果说显微镜的出现为细胞学及细胞学说的建立奠定了基础的话，则电子显微镜的应用及其与分子生物学技术的结合在细胞生物学的发展方面则起了决定性的作用。

细胞的发现与光学显微镜的发明是分不开的。

据历史记载，12世纪阿拉伯人阿尔海琴已会磨制透镜。

1604年荷兰眼镜商Janssen（1588-1628）制造了第一台放大率不超过10倍的复式显微镜。

半个多世纪后，英国物理学家Hooke（1663-1703）创制了第一架具有科学研究价值的显微镜，首次观察了木栓的显微图像，并发现了细胞。

真正观察到活细胞的是荷兰科学家Leeuwenhoek（1632-1723），他用自制的显微镜观察到了池塘水中的原生动物，还有人和哺乳动物的精子、细菌等。

显微镜是观察微观世界的重要工具，没有它也就无法打开微观世界的大门。

随着现代科学技术的发展，显微镜的种类越来越多，性能更加完善，使用范围也越来越广泛，不仅可以用来观察细胞形态和内部结构，而且，还可以通过与其他技术的结合，进行细胞化学成分的定位、定性、定量以及物质代谢、细胞生理、免疫和遗传等功能方面的研究。

可以说，显微镜是生物学、医学研究中用途最广的一类仪器。

因此，学习和掌握普通光学显微镜的结构原理和操作方法，是每个现代生物学、医学等专业学生必须掌握的基本技能。

本章将介绍常用的普通光学显微镜和特殊显微镜的结构、原理、应用等。

实验一普通光学显微镜的使用

背景知识：

1、显微镜的发展历史

很早以前，人们就知道某些光学装置能够“放大”物体。

如《墨经》中记载了能放大物体的凹面镜。

光学显微镜是利用光线照明使微小物体形成放大影像的仪器。

显微镜的发明和使用已有400多年的历史。

1595年，荷兰人Janssen发明了第一个简陋的复式显微镜，由三个镜筒连接而成，放大倍数是3~10倍。

复式显微镜在性能上明显优于单式显微镜。

一是它的放大率可以做得很高；二是制造工艺较简单。

复式显微镜的发明，是科学史上的里程碑，人类从此开始认识微观世界。

2、细胞的发现

1665年，英国科学家Hooke用其自制的显微镜观察软木切片的时候，惊奇的发现其中存在着一个一个“单元”结构。

Hooke把它们称作“cell”，即细胞。

真正观察活细胞的是荷兰科学家列文·虎克（AnthonyvonLeeuwenhoek，1632-1723）。

他在1677年观察池塘水中的原生动物、蛙肠内的原生动物、人类和哺乳类动物的精子；后又在鲑鱼的血液中看到红细胞的核。

他最先发现了细菌，从而开创了微生物学。

他还指出：

在所有露天积水中都可以找到微生物。

这是人类认识微生物的分布的一次进步。

他又通过事实证明了当时流行的生物自然发生论的错误，改变了人们的观念。

3、现代显微镜技术

图1-1ErnstRuska、GerdBinnig和HeinrichRohrer（从左至右）分别因发明电子显微镜和扫描隧道显微镜而分享1986年的诺贝尔物理学奖

二十世纪物理、数学和材料科学等领域取得了非常大的进展，各种新型的显微镜应运而生，如倒置显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、微分干涉显微镜等、电子显微镜、共焦激光扫描显微镜（CLSM）和扫描隧道电子显微镜（STM）。

各种新的实验技术也相继出现。

细胞的精细结构如细胞骨架，遗传物质、各种病毒粒子和蛋白质分子也被人们看到。

一、实验目的

1．熟悉普通光学显微镜的主要结构和各部件基本性能。

2．掌握低倍镜、高倍镜的正确使用方法，熟悉油镜的使用方法。

3．初步了解光学显微镜的维护方法。

二、实验原理

图1-2显微镜的成像光路图

普通光学显微镜（microscope）是最通用的一种光学显微镜。

利用光线照明，标本中各点依其光吸收（即光的振幅发生变化）的不同而在明亮的背景中成像。

它由物镜、目镜、聚光镜、光源、载物台和支架等部件组成。

显微镜的基本放大原理如图1-2。

其放大作用主要由两组放大系统组成，一组为焦距很短的物镜，另一组为焦距较长的目镜。

为了减少像差，显微镜的目镜和物镜各由多组透镜构成，其中物镜的构造尤为复杂，有的由16个透镜组成。

为便于说明，图中的物镜和目镜都简化为单透镜。

物体AB位于物镜的前焦点外但很靠近焦点的位置上，首先经过物镜形成放大的倒立实像A'B'，这个像位于目镜的物方焦距内但很靠近焦点的位置上，作为目镜的物体。

目镜将物镜放大的实像又二次放大成虚像A''B''，位于观察者的明视距离（距人眼250mm）处，供眼晴观察。

在视网膜上形成的是实像A''B''。

由于显微镜所要观察的标本往往几何尺寸很小，小至可与光波的波长相比较；根据光的电磁波理论，此时不能再近似地把光线看成是直线传播，而要考虑衍射的影响。

因此显微镜的成像过程是个比较复杂的衍射相干过程。

由于衍射因素的影响，显微镜的分辨能力和放大率都受到一定限制。

因此显微镜一般最小可观察到0.2μm的标本，有效放大率最大为1500～1600倍。

三、实验材料

1．材料

动植物切片标本1套

2．试剂

香柏油（cedarwoodoil），二甲苯（xylenol）

3．仪器

复式显微镜（带油浸物镜）（microscope），擦镜纸（lenspaper）；记号笔，目镜测微尺及镜台测微尺四套

四、实验步骤

（一）显微镜的构造

复式显微镜的种类繁多，但其基本构造大致相同，包括机械部分、光学系统两大部分。

1．机械部分

支持和调节光学系统。

由下列部件组成：

（1）镜座（base）：

起稳定和支持整个镜身的作用。

一般镜座内装有照明光源等构造。

（2）镜柱（pillar）：

连接镜座和镜臂的短柱。

（3）镜臂（arm）：

镜座上方弯曲部分，支持镜筒和载物台，拿镜时手握此臂。

某些镜筒直立式光镜在镜臂和镜柱之间有一可活动的倾斜关节，可使镜臂适当倾斜（一般不超过45度），便于观察。

镜筒倾斜式显微镜无此关节。

图1-3普通光学显微镜结构示意图

（4）镜筒（1ighttube）：

位于镜臂前方的部分，上端安装目镜，下端装有旋转盘。

根据镜筒的数目，光镜可分为单筒式和双筒式两类，单筒式又分直立式和倾斜式两种，而双筒式的镜筒均为倾斜的。

（5）载物台（stage）：

在镜筒下方，方形或圆形，放置标本片。

载物台中央有一圆形通光孔，两旁装有标本移动器，移动器上的弹簧夹用于固定标本片。

移动器的右侧有两个旋钮，转动旋钮可使标本片前后左右移动。

移动器上还装有主副两套游标尺。

主标尺的刻度为1mm，副标尺刻度为0.9mm。

利用主副标尺可以粗测标本的大小，并可估计标本的位置。

（6）物镜转换器（旋转盘）（nosepiece）：

圆盘状，在镜筒下方，其上装有3～4个放大倍数不同的物镜。

旋转物镜转换器可更换物镜。

（7）调节旋钮（regulator）：

组装在镜臂前方或镜柱两侧的一对大小旋钮，转动调节钮可使载物台升降，为调节焦距之用。

大旋钮为粗调旋钮，旋转一周可使载物台升降10mm，一般用于低倍镜调焦。

小旋钮为细调旋钮，每旋转一周约使载物台升降0.1mm，适用于高倍镜、油镜或分辨物像清晰度调焦。

2．照明部分

由光源、聚光器等组成。

（1）光源：

位于镜座的内部，其亮度可以调节。

以钨丝灯和卤钨灯为多，卤钨灯优于钨丝灯，为显微镜的主要光源。

老式显微镜的主要光源是钨丝灯，具有灯泡体积小、电压低、钨丝团呈点状和照明强度大等特点，常用电压6~12V，功率15~100W。

色光为连续光谱，色温3200~3400K左右，红橙光多，蓝紫光较小，灯光略显黄色。

钨丝灯寿命较短，发光效率极低。

卤钨灯常见为溴钨灯，钨丝似点状，灯壳为石英玻璃。

灯泡体积很小，似一节小手指，一般为12V，50~100W，色光为连续光谱，色温一般为3200~3400K。

溴钨灯的灯壳不要直接触摸，以避免污染。

点燃时，污染处易焦化。

污染物可用酒精擦去。

装卸灯泡时，不可用手直接触摸，要垫以塑料包装或薄纸。

（2）聚光器（condensor）：

聚光器由聚光镜和孔径光阑（apeturediaphragm）构成。

聚光镜属于正透镜系统，由一至数片透镜组合而成，具有会聚作用，可把有光源射来的散光汇聚放大，再集聚成光束，经过标本后再射到物镜中。

孔径光阑位于聚光镜下方。

光阑的孔径可调节，以改变照明光束的直径，调节进光量。

孔径光阑的开度，即聚光器的数值孔径，左右显微镜的成像质量。

物镜的有效数值孔径，其中涵容聚光器的数值孔径，即：

物镜的有效数值孔径=（物镜数值孔径+聚光器数值孔径）/2

孔径光阑的开孔要适度。

开度过小使聚光器和物镜的数值孔径下降，影响影像的分辨率，还可能产生光的衍射，降低成像质量；开孔过大，造成光线充溢，引起眩光，聚光器会出现球差和色差，降低影像的清晰度和反差，因为透镜的边缘残存的像差较中心为大。

聚光器孔径光阑的开孔的最大限度是等同于物镜的光孔，即以两者的数值孔径相等为度。

3．光学系统

为两组透镜：

物镜和目镜。

（1）物镜：

装在物镜转换器上的一组镜头，有各种不同的放大倍数，它是由许多片不同球面半径的凸透镜和凹透镜按严格的尺寸组合起来的。

低倍镜为4×和10×，高倍镜为40×，油镜为100×。

4×、10×、20×和40×物镜属于干燥系物镜，使用时物镜和盖片之间不添加任何液体，只以空气为介质，其折射率为1，所以干燥系物镜的数值孔径小，分辨率亦低。

而油镜为浸没系，常用浸没液为香柏油，其折射率为1.515，与玻片的折射率相近，且不易干涸。

另外还有水浸系物镜，使用时需加水，其折射率1.33。

物镜起着把观察的物体进行第一次放大的作用，它是显微镜性能高低的关键性部件。

镜壳上除注明放大倍数外，通常还刻有焦点距离和镜口率。

物镜壳上的标志：

a．物镜的种类：

如APO（复消色差物镜）、FL（萤石物镜或半复消色差物镜）、PL（平场物镜）、PL·FL（平场萤石物镜）和PL·APO（平场复消色差物镜）。

b．放大倍数：

用数字表示，如4、10、20、40和100等。

c．数值孔径（Numericalaperture，N.A.，也称镜口率）：

其值多用数字刻在物镜外壳上，如0.25、0.65和1.3等，常和放大倍数写在一起，如10/0.25，40/0.65和100/1.3等。

镜口率反映镜头分辨率的大小，其数字越大，表示分辨率越高。

d．标准机械筒长：

当今主要有两种标准，即160mm和170mm，用数字刻在镜壳上。

∞表示机械筒长为无限大，为某些特种显微镜的筒长。

机械筒长是指从镜筒的目镜管上缘至物镜螺旋肩的距离，以mm表示。

e．需用盖玻片情况：

根据物镜的种类不同，镜检时在被检标本（或样品）上加或不加盖玻片。

凡需加用盖玻片的物镜，在外壳上刻有需盖玻片的厚度（mm），如0.17。

刻值常与机械筒长写在一起，如160/0.17。

160/0或160/：

筒长160mm，盖片厚度为0，即不需加用盖玻片（绝对不用盖玻片）

160/—：

筒长160mm，盖片有无皆可。

f．物镜与被检样品间的介质情况：

油浸物镜oil、oel或Hi等，并在油镜末端刻一黑环，以示油浸。

水浸物镜W或Water。

甘油物镜：

Glyz或Glye等

g．工作距离（workdistance，W.D.）：

工作距离依物镜种类不同而异，通常小于物镜焦距，物镜的放大倍率愈高，镜口率愈大，焦距愈短，工作距离就愈小。

（2）目镜：

有单筒和双筒之分。

双筒显微镜目镜有两个，两目镜间的距离可根据使用者两眼瞳孔距离调整。

目镜通常由两片正透镜组成，上面的透镜叫接目镜或眼透镜，它决定倍数和成像的优劣，下面的透镜叫会聚透镜或场镜，它使视野边缘的成像光线向内折射，进入眼透镜中，使物体的影像均匀明亮。

上下透镜的中点，或场镜下面设有一个光阑，由它决定视野的大小，故叫视野光阑或视场光阑。

场镜和物镜在这个光阑面上造像，可在光阑的上面装指示针和目镜测微尺。

镜检观察，通过目镜所窥视的圆，即目镜光阑所围绕的范围，称作视场。

视场圆的直径称视场宽度，多用毫米表示。

视场宽度与显微镜总放大率成反比，与物镜的放大率亦成反比。

目镜相当于一个放大镜，起着把物镜放大的物体实像进一步放大的作用，其放大倍数通常为4~16倍，但它并不增加显微镜的分辨率。

（二）显微镜的光学技术参数

显微镜的光学技术参数包括：

数值孔径、分辨率、总放大率、焦深、视场宽度、复盖差、工作距离、图像亮度、视场亮度。

这些参数有的直接标在光学部件上，使用时必须根据实验目的和实际需要充分考虑显微镜的各项技术指标及参数的关系。

而每个参数本身都有一定的合理极限，它们之间是相互联系又相互制约的，并不是每个参数越高越好，使用时应选择及调节好显微镜各个部件。

才能充分发挥显微镜应有的性能，获得满意效果。

1．数值孔径（Numericalaperture）

数值孔径又称“镜口率”，简写NA或A，一般标刻在物镜和聚光镜的外壳或转盘上。

数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参效，尤其物镜的孔径数值大小是判断显微镜性能高低的重要标志。

物镜的数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（2α）半数的正弦之乘积，用公式表示为：

图1-4物镜孔径角

n：

物镜和被检物体之间介质的折射率

2α：

物镜的孔径角，又称“镜口角”，（见图1-4）是从物镜光轴上的物点所发出的光线与物镜前透镜有效直径边缘所张的角度。

孔径角越大，进入物镜的光通量就越大。

它与物镜前透镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。

干燥系统物镜的NA值一般在0.85以内，因为物镜前透镜与被检物体之间的介质为空气，空气的折射率为1，而孔径角总是小于180°，否则物镜的工作距离等于零。

假设孔径角很大，大到近似于平角180°，那么孔径角的一半的正弦为sin90°=l，但是实际值永远小于1。

因此干燥系统的物镜的NA值始终小于l。

显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率。

基于这一原理，就产生了水浸系物镜和油浸物镜。

数值孔径最大值为1.4，这个数值在理论上和技术上都达到了极限。

目前，有用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为1.66，所以NA值可大于1.4。

为了充分发挥物镜数值孔径的最大作用，要注意调节聚光镜的孔径光栏。

作为一般观察时，使其数值孔径NA值等于或大于物镜的NA值，在显微照相及数码采集时，则应小于物镜的NA值。

数值孔径还与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响其他各项技术参数，它与分辨率成正比，与放大率（有效放大率）成正比，与焦深成反比．NA值的平方与图像亮度成正比，NA值越大，视场宽度与工作距离就越小。

2．分辨率（Resolvingpower）

显微镜的分辨率是指两点能清楚分开的极限距离。

在显微镜的设计中，规定如果一个圆斑像的圆心刚好落在另一个圆斑像的圆周上，则认为两物点的像刚好能够被分开，就是分辨的最小距离。

分辨率大小决定了显微镜分辨试样上细节的能力，具有高分辨率的高质量的物镜是产生清晰准确图像的关键。

前面已经提到，显微镜的物镜使物体放大成一倒立实像，目镜的作用是使这个实像再次放大，这就是说目镜只能放大物镜已分辨的细节，物镜未能分辨的细节，绝不会通过目镜放大而变得可分辨。

因此显微镜的分辨率主要取决于物镜的分辨率。

物镜分辨率的表达式如下：

R：

分辨率（分辨的两个点的最短距离），R值愈小，分辨率越大。

λ：

照明光线的波长（可见光平均波长约550nm）。

N.A.：

物镜的数值孔径。

由式中可知，对于一定波长的入射光，物镜的分辨率完全取决于物镜的数值孔径；数值孔径越大，分辨率越高。

为了提高分辨率，即减少R值，根据数值孔径及分辨率公式可采用

（1）降低波长值，使用短波长光源；

（2）使用折射率较大的介质；（3）消色差；（4）增加明暗反差。

下面是几种物质的折射率和550nm下不同物镜的分辨率列表。

表1-1几种物质的折射率

介质

折射率（n）

空气

1.003

水

1.33

石蜡油

1.47

香柏油

1.515

加拿大树胶

1.515

光学玻璃

1.54

表1-2在550nm光波下不同物镜的分辨距离

放大倍数（×）

镜口率（N.A.）

分辨率

10

0.28

1μm

40

0.65

0.42μm

100

1.25

0.22μm

在显微镜下我们看到的图像，不论是什么结构，都可以看做是由亿万个物体点所组成，各点的颜色、位置、亮度各有不同、由于光波的衍射特性、光学系统残留的像差、玻璃的质量以及杂散光等多种因素的影响，每个物体点经物镜成像后．不可能是一个清晰的点像，而是呈现一定大小衍射斑的弥散圆像，这种衍射效应是提高分辨率的严重障碍。

3．放大率（Magnification）

放大率就是放大倍数，是指被检物体经物镜放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图像的大小与物体原大小的比值，是物镜和目镜放大倍数的乘积。

物镜和目镜的放大倍数均标刻在其外壳上。

即：

总放大率=物镜放大率×目镜放大率

显微镜的放大倍数是指长度的放大，而不是指面积的放大。

例如lμm的物体，在显微镜下放大100倍，则长度为l00μm，若以面积计算，则为10000μm2。

显微镜的放大率存在一定限度。

其最适当的总放大率，原则上是在标准筒长下，所使用的物镜NA值的500~1000倍，这个范围内的总放大率称为“有效放大率”或“合理放大率”；超越这个范围的放大率则称为“无效放大”或“空虚放大”。

观察时应在有效放大率的范围内来选择物镜和目镜的配合。

例如使用NA为1.44的（100×）的物镜时，应在700~1400倍放大率的范围内选用目镜的放大倍数，即（7~14）×的目镜比较合适。

若用5×的目镜则达不到人眼所能分辨的大小；用（15~20）×的目镜则为无效放大。

因此在观察时，一般使用10×的目镜为好，高级的研究用显微镜常只配一对10×的目镜。

10×目镜为“标准目镜”。

做高倍镜检时，应首先考虑更换物镜，而不要盲目更换过高倍率的目镜。

4．焦深（Depthoffocus）

焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体点时，不仅位于该点各平面上的点都可看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清晰部分的厚度就是焦深。

焦深大，可看到被检物体的层面后甚至全层；而焦深小，则只能看到被检物体的某一薄层。

显微镜焦深的计算公式为：

D：

焦点深度；

K：

常数，约为240μm；

n：

被检物体周围介质的折射率；

M：

总放大率；

NA：

数值孔径。

从公式可以得知：

焦深与总放大率及物镜的数值孔径值成反比。

放大倍率高，数值孔径越大，焦深则越小。

显微镜的焦深一般很小，尤其使用高倍镜进行显微照相时，只能看清几个或几十个μm薄层内的物体。

因此，在使用高倍物镜时（40~100×），往往采用带光栅的物镜，可调节镜口角的大小，从而改变NA值．以调节焦深的大小。

带光栅的物镜在暗视场或透射荧光观察时可限制直射光进入物镜。

尤其做荧光观察时调节光栅大小至关重要。

5．视场宽度（Fieldofview）

视场宽度是指在显微镜中观察到视野内所能容纳被检物体的区域，它的大小，用所观察的圆形视野直径来表示，受目镜里视场光栅直径大小所限制。

也称视场直径。

直径越大，察起来越舒适，所能容纳被检物体区域越大。

但是为了减少像差，目镜的视场光栅直径不能设计太大。

视场直径数等于目镜的视场数FN（FieldNumber）除以所使用的物镜放大倍率。

用公式

表示。

其中Φ：

视场直径；FN：

视场数；Mob：

物镜放大率。

视场数标刻在目镜的镜筒外侧或端面上，不同类型的目镜，其视场数不同，而且倍率高的目镜，视场数则小。

如标有10×／25目镜．其含义是指放大倍率为10倍，视场数为25mm。

由视场直径的计算公式可看出：

视场直径与视场数成正比。

目镜的视场数越大，视场直径也就越大，越便于观察。

若增大物镜的倍率，则视场直径减小。

因此，在低倍镜下可看到被检测物体的全貌，而换成高倍物镜（如100×物镜），就只能看到被检测物体的很小一部分。

为了在高倍镜下看到被检物体的全貌，只有缓慢移动载玻片，使被检物体的不同部位依次进入视场进行观察。

如用10×／25目镜，放大倍率分别为10×、40×、100×物镜观察，其视场直径分别为2.5mm、0.625mm、0.25mnn。

6．覆盖差（Differenceofcovegalss）

显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。

由于盖玻片的厚度不标准，会导致像差的产生，这就是覆盖差。

国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mn，一般允许的范围在0.16~0.18mm。

物镜外壳上标刻的0.17即表明该物镜要求盖玻片的厚度为0.17mm。

如果盖玻片太厚，不该进入物镜的光线会进入物镜；盖玻片太薄，则应该进入物镜的光线却不能进入。

放大倍率越高，NA值越大，覆盖差越明显。

尤其是盖玻片厚了，覆盖差更为严重。

消除覆盖差最理想的办法，是通过带校正环的物镜来调节。

尤其是倒置显微镜的高倍物镜，都装有可校正盖玻片厚度的校正环。

7．镜像亮度与视场亮度

镜像亮度是显微镜的图像亮度的简称，指在显微镜下所观察到的图像的明暗程度。

使用时，对镜像亮度的要求，一般是使眼睛既不感到暗淡，又不耀眼，使眼睛不感到疲劳为好。

镜像亮度与物镜数值孔径值的平方成正比，与总放大率的平方成反比。

镜像亮度与视场亮度是两个不同的概念，镜像亮度是指显微镜下图像的明暗程度；视场亮度则是指显微镜下整个视场的明暗程度。

8．工作距离（Workingdistance）

工作距离指显微镜准确聚焦后物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。

它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦实际上是调节工作距离。

在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。

数值孔径大的高倍物镜工作距离小，如40×物镜，工作距离不超过0.6mmn，100×油浸系物镜，工作距离一般不足0.2mm，所以在使用高倍物镜时，有时不慎而压碎切片，使物镜也受到损害。

故研究用显微镜的物镜透镜前端多带有“弹簧装置”，粗微调部分也设有“限位装置”，应注意调节。

图1-5A柯勒照明成像光路图B柯勒照明法照明光路图

a真实像；b目镜；c目镜光栅；d物镜后焦面；e物镜；f标本；

g聚光镜；h孔径光栅；i视场光栅；j光源聚光镜；k灯丝

（三）柯勒照明法

要将光学显微镜调整到最佳分辨状态。

首要的一步必须调整柯勒照明系统。

在显微照相中至为重要。

作为一般明视野观察，一些简易的显微镜，大多采用临界照明法。

英国人EdwardNelson根据阿贝原理，发明了临界照明法（criticalillumination）或称尼尔逊照明法（Nelsonillumination）。

原理是利用阿贝聚光器，将光源的发光体形状的像聚焦于样品平面上，使样品能接受最高亮度的照明，故称临界照明。

这个方法多用于自然光，这种显微镜一般装置较简单，不具备视场光栅及孔径光栅，随着钨丝灯的发明，这种照明法就逐渐改进，但因钨丝灯的发光体形状是条状，聚焦于样品平面上．有灯丝的部分明亮，其他地方则暗，使照明不均匀。

柯勒照明系统是1893年德国的AugustKöhler在临界照明法的基础上改良而成的照明法，是在聚光器与光源之间，加上一个光源聚光器（LampCondencer）和视场光栏（FieldDiaphragm）。

利用光源聚光器将光源发光体形状的像聚焦于孔径光栏的平面上，而聚光器将视场光栏的像聚焦于样品平面上，由此充分利用了照明光源，使点状的光源达到较大的照明，从而使样品得到均匀的照明，并防止了高温。

这对显微摄影和镜检观察至为重要。

优点：

视场照明均匀，样品不受热，影像清晰。

图1-5是显微镜处于柯勒照明法时的照明及成像光路图，