水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定 分光光度法编制说明.docx

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水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法编制说明

国家标准《水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法》编制说明

（一）工作简况，包括任务来源、协作单位、主要工作过程、国家标准主要起草人及其所做的工作等；

1、任务来源

本标准根据国标委公布的2018年第四批国家标准计划项目（国标委发[2018]83号），本项目计划编号为20184458-T-469，名称为水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法。

本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。

本标准由等联合起草。

2、目的和意义

水溶性壳聚糖是由壳聚糖水解得到的一类具有生物活性的低聚合度壳聚糖,具有抗氧化、提高免疫力、抑菌、降血糖等生物学作用,它不仅溶于酸性溶液，还可溶于中性溶液和碱性溶液，因此被广泛应用于食品、医药、农业、化妆品等领域。

3、协作单位

4、标准编制过程和主要工作过程

（1）2017年9月至2018年2月，标准起草单位组织相关技术人员对“水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法”标准项目进行了预研。

根据国家制修订有关程序和要求，2017年12月下旬，青岛科技大学主持在青岛召开了《水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法》国家标准制定研讨会。

会上，组成了标准起草工作组，进一步明确了任务要求，根据研究内容详细安排了工作进度，并成立了标准起草工作小组。

会议研究讨论了《水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法》初稿，对起草小组在标准起草过程中的一些思考及难点问题进行了深刻讨论，各单位代表结合各自的优势和特长就标准内容及方法选择进行了讨论，为“水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法”标准制定奠定了必要的基础。

课题组成员广泛收集了国内外标准、文献，了解了国内外相关技术动态，并且明确了工作思路和进程安排。

（2）2018年3月标准起草单位在收到全国生化检测标准化技术委员会文件后，提交了项目建议书以及国家标准草案。

（3）2019年1月收到全国生化检测标准化技术委员会生检标[2019]1号文件以及该标委会转发的国标委发[2018]83号《国家标准委关于下达2019年第四批国家标准制修订计划的通知》立项文件，计划编号：

20184458-T-469。

5、国家标准主要起草人及其所做的工作　

5.1青岛科技大学的张永勤、吕兴霜、张凤国、邢明霞、许文廷、王家林负责该标准项目的前期调研、方法建立及优化以及标准中方法的起草工作；

5.2中国测试技术研究院的周李华，青岛科技大学的张永勤负责方法验证和标准修订工作；

5.3青岛市计量技术研究院的夏春、李剑负责实验过程的量值溯源工作；

5.4青岛正大农业发展有限公司、武汉新华扬生物有限责任公司、青岛蔚蓝生物基团有限公司的毕毅奋、王斐、詹志春、邵静、张菁、周樱、徐丽、宋雅丽、李玉奎、刘安邦等人负责样品测试工作。

（二）国家标准编制原则和确定国家标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等）的论据（包括试验、统计数据），修订国家标准时，应增列新旧国家标准水平的对比；

1、标准编制原则

（1）依据：

本标准的编制依据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：

标准的结构和编写》，并参照GB/T6379.1-2004《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分总则与定义》和GB/T6379.2-2004《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》。

（2）科学性

壳聚糖是最有应用价值的糖类之一，目前它已广泛应用于医药、食品、环境、纺织、化妆品、生物技术、环境治理、生物医学材料等领域，其降解产物水溶性壳聚糖，即，壳聚糖的低聚、寡糖糖，则显示了更高的生物学活性，如有抗菌、抗肿瘤、抗氧自由基、抗癌、降脂、抗血凝、抗酸、抑菌、抗溃疡、增强免疫等生物活性。

该类分子结构中含有大量氨基基团，使得该类产品在应用和保藏期间较易被氧化而变质，并失去生物活性。

所以，糖类分子中还原性端基糖的含量是该类产品的关键质量和技术指标，另外也是壳聚糖酶的酶活力测定的重要技术指标，因此，糖类分子中还原性端基糖含量测定方法的准确性、可靠性是至关重要的。

我国最新修订的食品中还原糖的测定方法“GB5009.7-2016食品安全国家标准食品中还原糖的测定”共包含直接滴定法、高锰酸钾滴定法、铁氰化钾法和奥氏试剂滴定法四种滴定法。

实验步骤繁琐冗长，不利于还原性端基糖的大批量测定，而已沿用半个世纪的可见分光光度法中的DNS法则可弥补这些缺陷，然而由于该法存在灵敏度较低、标准曲线远偏离原点、非化学计量等问题已严重影响了测定的准确性，因此，该法并未被纳入国家标准，这实际上已经成为阻碍糖类行业发展的瓶颈问题。

而本标准项目“水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法”则可解决上述问题。

（3）前瞻性

在标准编制的设计中，将“还原性端基糖”的概念引入标准以代替传统意义上的“还原糖”的概念，以满足不同聚合度的水溶性壳聚糖样品的检测需求。

这是因为，目前所采用的还原糖的测定方法一般是以某种还原性单糖作为还原糖的代表，以还原性单糖，如氨基葡萄糖的质量浓度或质量分数作为待测样品中还原糖含量的计量方法，而实际上，所测得的还原糖的量包含了所有具有还原性末端的糖类分子的量，因此，mol/g或mol/L既可以代表还原性端基糖的量又可以代表具有还原性末端的糖类分子的量，而非传统意义上人们由于惯性思维而想到的葡萄糖或其它还原性单糖。

既然以摩尔来计量，即可用于测定和比较所有具有不同聚合度的还原性端基糖的水溶性壳聚糖样品，对其他水溶性糖的还原端基糖的测定具有借鉴价值，从而提高了测定方法的普适性和前瞻性，避免标准的重复制定。

（4）适用性

该标准方法的优点在于：

1.更准确，符合化学计量规则，其摩尔吸光系数不因底物聚合度的改变而改变，明显优于DNS法；2.非还原性杂质干扰小，超高的稀释倍数使得杂质浓度极低而免于对测定的干扰，可用于食品级市售壳寡糖的还原性端基糖的测定。

（5）可操作性

与现行的“GB5009.7-2016食品安全国家标准食品中还原糖的测定”中所采用的滴定法相比，更便于大批量测定，节省人力物力和财力。

2、确定国家标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等）的论据（包括试验、统计数据）

2.1指标的建立

水溶性壳聚糖是一类既可以溶于酸溶液，又可以溶于中性和碱性水溶液的壳聚糖的降解产物，其聚合度为为2~30。

该类分子结构中含有大量氨基基团，使得该类产品在应用和保藏期间较易被氧化而变质，并失去生物活性。

所以，糖类分子中还原性端基糖的含量是该类产品的关键质量和技术指标，另外也是壳聚糖酶的酶活力测定的重要技术指标，因此，糖类分子中还原性端基糖含量测定方法的准确性、可靠性是至关重要的。

该项目主要研制内容包括分析方法的选择、显色剂及其浓度和加量、显色温度和时间、测定波长及测定时间、公式和计算方法等。

2.2分析方法及其条件的选择与优化

2.2.1分析方法的选择

根据文献调研和报道，可见分光光度法适用于水溶性壳聚糖中还原端基糖含量的检测。

我国最新修订的食品中还原糖的测定方法“GB5009.7-2016食品安全国家标准食品中还原糖的测定”共包含直接滴定法、高锰酸钾滴定法、铁氰化钾法和奥氏试剂滴定法四种滴定法。

实验步骤繁琐冗长，致使测定效率低下，不利于还原性端基糖的大批量测定，而可见分光光度法中的DNS法则可弥补上述缺陷，然而，该法标准曲线远偏离原点（如图1所示）、且不同聚合度的还原糖存在非化学计量问题，因而，国标并未将该法纳入国标还原糖的测定。

而经本起草工作组研制的“水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法”则可解决上述问题，该法在已报道的还原糖测定方法的基础上，对反应时间、DTT浓度、测定波长及测定时间进行了优化，图2为经各参数优化后制作的标准曲线。

MBTH法与DNS法相比，标准曲线过原点，不会因待测样品稀释倍数不同而造成测定值的明显差别。

图1.DNS法氨基葡萄糖标准曲线（左图为各波长下标曲的斜率、R2和截距，右图为540nm所测标曲）

图2MBTH法氨基葡萄糖标准曲线

（左图为各波长下标曲的斜率、R2和定量限，右图为590nm所测标曲）

2.2.2氨基葡萄糖测定条件的选择

本起草工作组所研制的方法（图2中的右图）是在显色剂及其浓度和加量、显色温度和时间、测定波长及测定时间的优化基础上获得的，利用图2中的左图即可确定测定波长。

水溶性壳聚糖的还原性端基糖可以与MBTH试剂以及硫酸铁铵试剂生成青蓝色化合物，还原端基糖的浓度在一定范围内与其颜色强度呈正比例线性关系。

根据前期试验结果，本方法设定MBTH反应温度范围为80℃、反应时间范围为13分钟，其中MBTH试剂中DTT的浓度为0-1.4mg/mL，通过水溶性壳聚糖还原端基糖的测定分析确定最终体系的DTT浓度。

DTT的优化结果如图4所示，该图为采用酶标板来研究DTT浓度对盐酸氨基葡萄糖标准曲线的斜率、R2、截距、显色时间稳定性的影响。

另外，定义SEN=斜率，COR=1000*（1-R2），INT=1000*截距；定义

，

，

，其中t1为40min，i=2-15（ti分别对应50min-180min）。

其中，SEN表示斜率，斜率越大，灵敏度越高，COR表示R2，COR越小，标准曲线线性越好，INT表示截距，INT越小，标准曲线更过原点，△SEN、△COR、△INT分别表示斜率稳定性、R2稳定性、截距稳定性，这些量越小，稳定性越好。

根据图3，并依据SEN越大，COR、INT、△SEN、△COR、△INT越小，所得到的标准曲线斜率更高，线性更好，更过原点，时间稳定性好，将优势组的选择总结成表1，综合各方面考虑，最终选择5号即DTT为0.8mg/mL用于盐酸氨基葡萄糖标准曲线的实验，测定时间以显色后60-100分钟测定为宜。

图4DTT浓度对盐酸氨基葡萄糖标准曲线的斜率、R2、截距、时间稳定性的影响

表1DTT优化的优势组

波长（nm）

630

SEN

2,3,4,5

COR

2,3,4,5,7

INT

2,3,5,7

△SEN

5,6,7

△COR

2,3,4,5,7

△INT

2,5,6,7

综合优势组

5

图4为在该优化条件下所得显色产物的扫描波谱，其标准曲线如图2所示。

图4.最有条件下所测显色产物的扫描波谱

2.2.3水溶性壳聚糖的还原端基测定波长的优化

氨基葡萄糖的标准曲线和水溶性壳聚糖的还原端基的回归曲线必须都过原点才能得到较准确的测定值。

水溶性壳聚糖的显色产物与氨基葡萄糖的显色结果基本一致，在590nm附近，其线性回归参数R2达到最高，此时，本底对测定干扰最小，回归方程的截距基本接近0，结果如图5所示。

图5.水溶性壳聚糖的还原端基测定（上图为测定波长对不同浓度水溶性壳聚糖的回归曲线各参数的影响，下图为590nm下所测得的水溶性壳聚糖浓度的回归曲线）

（三）主要试验（或验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果；

1实验材料及仪器

1.1试剂

3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物（MBTH）和二硫苏糖醇（DTT,D-0632）均购自Sigmaalderich公司，其它均购自国药集团。

1.2仪器

分析天平：

精度为0.0001g和0.01g。

恒温震荡水浴锅（或带磁力搅拌的普通水浴锅）：

精度为±0.2℃。

分光光度计：

波长范围380~780nm吸光度值精度为0.001。

1cm石英比色皿或玻璃比色皿。

2实验方法

2.1溶液配制方法

本方法所用试剂均为分析纯，除特殊说明外，实验用水为GB/T6682规定的三级水。

2.1.1120μg/mL盐酸氨基葡萄糖标准溶液

称取盐酸氨基葡萄糖0.1000g，用水溶解并定容至100mL。

充分混匀后，从中取12mL，用水稀释并定容至100mL。

2.1.20.5mol/LNaOH溶液

称取NaOH2.00g。

加水溶解，定容至100mL。

2.1.3MBTH试剂

3mg/mLMBTH（3-甲基-2-苯并噻唑酮腙）溶液：

称取MBTH0.300g，加水搅拌溶解并稀释定容至100mL。

于4℃冰箱避光贮存，有效期为10天。

0.8mg/mLDTT（二硫苏糖醇）溶液：

称取0.080g，加水搅拌溶解并稀释定容至100mL。

于4℃冰箱避光贮存，有效期为10天。

将上述MBTH溶液和DTT溶液等体积混合，即得MBTH试剂。

现用现配。

2.1.4硫酸铁铵试剂

称取5.00g硫酸铁铵（NH4Fe（SO4）2·12H2O）、5.00g氨基磺酸，加水溶解，然后移入41.8mL浓盐酸，待充分溶解后，加水搅拌溶解并稀释定容至1000mL。

于4℃避光保存，有效期为30天。

2.1.51mg/mL水溶性壳聚糖溶液

称取水溶性壳聚糖0.1000g，加入水使其溶解，定容至100mL。

2.2标准曲线及其样品测试方法

2.2.1标准曲线

分别移取120μg/mL盐酸氨基葡萄糖标准溶液0μL、250μL、500μL、750μL、1000μL、1250μL、1500μL、1750μL、2000μL与分别2000μL、1750μL、1500μL、1250μL、1000μL、750μL、500μL、250μL、0μL水混合，配成盐酸氨基葡萄糖质量浓度分别为0μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、45μg/mL、60μg/mL、75μg/mL、90μg/mL、105μg/mL、120μg/mL的盐酸氨基葡萄糖标准工作溶液。

分别移取上述溶液400μL，加400μL0.5mol/L氢氧化钠溶液和400μLMBTH试剂于试管中（每个浓度做三个平行）充分混匀，于80ºC水浴13min，趁热迅速加入800μL硫酸铁铵试剂，混匀显色1小时，用1cm比色皿在590nm波长下测定，即得各不同浓度的氨基葡萄糖溶液和空白溶液的吸光度值。

以氨基葡萄糖的摩尔浓度为横坐标，以减去空白吸光度值的氨基葡萄糖的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，获得线性回归方程，回归系数（r2）在0.999以上时方可使用。

2.2.2样品测试

取适当稀释的水溶性壳聚糖溶液（2.1.5.1）400μL（三个平行样），加400μL0.5mol/L氢氧化钠溶液和400μLMBTH试剂于试管中，充分混匀，于80ºC水浴13min，趁热迅速加入800μL硫酸铁铵试剂，混匀显色1小时。

以水为空白代替水溶性壳聚糖溶液（三个平行样），如上操作。

将二者分别用1cm比色皿在590nm波长下测定吸光度值AE和AB。

2.3含量定义及计算方法

含量：

每克水溶性壳聚糖中含有的还原端基糖的量，单位是mmol/g。

2.2.1公式与计算方法说明

样品中还原端基糖含量按式⑴计算，计算值保留三位有效数字。

……………………………………………⑴

X----试样中还原端基糖的浓度，mmol/g

AE----样品管的平均吸光度值；

AB----样品空白管的平均吸光度值；

k----标准曲线的斜率，L/mmol；

C0----标准曲线的截距；

N----稀释倍数。

m-----水溶性壳聚糖的质量浓度（mg/mL）

4.方法验证

其线性范围在0-0.12mg/mL（0-0.577mmol/L）,R2=0.9996,检测限（LOD）为0.026mmol/L,定量限（LOQ）为0.079mmol/L。

三种水溶性壳聚糖样品的还原端及糖含量分别为1.018±0.006mmol/g、0.985±0.010mmol/g、1.001±0.008mmol/g，平均回收率为99.4%。

根据标准要求，标准起草小组对氨基葡萄糖和水溶性还原性端基糖等关键指标参数进行了验证，实验验证样品由本标准起草单位提供，将验证样品分别委托至，使用本文件规定的方法进行检测，结果见表，从表可知，产品符合本文件技术要求。

课题组对还原性端基糖的测定方法进行了验证，实验验证样品由本标准起草单位提供，将验证样品送至，使用本文件规定的方法进行检测，结果见表，家验证单位在重复性条件下获得的两次独立测定结果与起草单位测试结果一致，满足该标准要求。

说明该方法稳定可靠。

5、经济与社会效益

水溶性壳聚糖分子中的氨基是发挥其高效生物活性的关键物质基础，但由于其化学稳定性较差，会使水溶性壳聚糖发生褐变现象，随着温度、相对湿度的升高，其褐变速率加快，且时间越长，褐变越严重，尤以在碱性条件下褐变最更严重。

水溶性壳聚糖的产品稳定性问题一直是该行业普遍关注的焦点问题，品质的下降将直接影响该类产品的有效应用。

本标准的制定，旨在国内相关企业、研究机构、大专院校提供有效的应用、研发工具，为其更深入的研究和质量控制提供基础资料和有力的理论依据，这将具有重要的经济和社会效益。

（四）采用国际标准和国外先进标准的程度，以及与国际、国外同类标准水平的对比情况，或与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况；

迄今为止，未见相关内容的国际标准以及其它国家的相关标准。

（五）与有关的现行法律、法规和强制性国家标准的关系；

本标准与我国现行法律、法规和强制性国家标准是协调的，不存在任何抵触现象。

（六）重大分歧意见的处理经过和依据；

目前尚无。

（七）国家标准作为强制性国家标准或推荐性国家标准的建议；

本标准不属于强制性标准的范畴，所以建议作为推荐性国家标准进行发布。

（八）贯彻国家标准的要求和措施建议（包括组织措施、技术措施、过渡办法等内容）；

为了贯彻实施本国家标准，建议开展本标准应用技术的宣传工作。

（九）废止现行有关标准的建议；

无相关现行标准。

（十）其他应予说明的事项。

无

标准起草组

2019年12月