分子生物学常用实验指南.docx

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分子生物学常用实验指南

生命科学系

2011-2012学年度分子生物学实验

（0801班）

2011-2012学年度分子生物学实验指导

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备

一、实验目的：

掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术

二、实验原理：

感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。

我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。

因而具备了吸收外源DNA的能力。

三、仪器：

1.超净工作台2.低温离心机3.恒温摇床4.紫外分光光度仪

四、材料与试剂：

1.大肠杆菌top10菌株

2.0.1mol/LCaCl2溶液500mL、LCaCl2溶液50mL

3..LB液体及固体培养基

%甘油500mL（灭菌）

五、实验操作步骤：

1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mLLB液体培养基中，37℃振荡（200r/min）培养过夜。

2.次日早上取菌液转接到40mLLB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.（A600应在～之间）

3.将菌液置冰浴中10min。

（同时将LCaCl2溶液、50%甘油预冷）

4.取菌液，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液，4℃再离心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。

5.用冰冷的LCaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保温30min。

6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100µL冰冷的LCaCl2溶液、100µL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。

实验二质粒DNA的转化

一、实验目的：

掌握质粒DNA的转化技术

二、实验原理:

DNA能够黏附于感受态细胞的表面，经过42℃短时间的热激处理

可以促进DNA的吸收。

转化菌在非选择培养基中保温一段时间后，质粒DNA所携带的抗性基因（Ampr）得到表达，然后再在选择培养基上培养，使转化的菌株得以正常生长。

三、仪器：

1.超净工作台2.恒温摇床3.恒温水浴

四、1.材料与试剂：

LB培养基（液体、固体平板）

2.感受态

3.无菌水

五、实验操作步骤：

µL新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2µL（约5～50ng）混匀，冰上放置30min。

同时做一对照试验：

200µL感受态+2µL无菌水，其他操作同上述实验完全一样。

2.将上述管放到42℃水浴中，精确计时90秒。

3.冰浴2min。

4.复苏：

管中加入LB液体培养基800µL，37℃培养1h（50r/min）

5.涂平板：

取200µL复苏细胞，涂布于含AMP的LB培养基上。

待大约30min，让菌液被培养基吸收。

6.菌落培养：

倒置平皿，37℃培养12～16h，转化子即可长成菌落。

照相。

实验三质粒DNA的提取

一、实验目的：

掌握碱裂解法提取质粒的技术和方法

二、实验原理

  碱裂解法提取质粒利用的是环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH值介于这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。

当加入的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低至中性后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。

通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。

三、仪器、材料与试剂

（一）仪器

  1．恒温培养箱  2．恒温摇床  3．小型高速离心机  4．漩涡混合器

（二）材料与试剂

 材料：

带有pGEM-T质粒的大肠杆菌

 试剂：

1. SolutionI[50mmol/L葡萄糖，25mmol/L（）,10mmol/LEDTA]

2..  SolutionII（LNaOH+2%SDS用前等体积汇合）

3.  SolutionIII（5mol/L乙酸钾60mL,冰乙酸mL,

4.  TE缓冲液[10mmol/L,1mmol/LEDTA]

5.0.5mo1／L（EDTA）

6.氯仿：

异戊醇（24：

1）

7.Tris饱和酚：

氯仿：

异戊醇（25：

24:

1体积比）

8. RTE（含20µg/mLRNA酶A的TE缓冲液）  

四、实验步骤

1. 将3mL含Amp的LB液体培养基加入到试管中，接入含pGEM-T质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜；

2.将菌液加入离心管中，4000r/min,5min,弃上清；重复一次，增加菌的收集量；

3.在离心管中加入100µL溶液I,涡旋混匀，室温放置10min；

4.加入200µL溶液II，轻轻混匀（颠倒5～10次），待逐渐变清亮后，冰浴2min（操作要轻柔，裂解时间不要超过5min）；

5.加入150µL溶液III（冰上预冷的）加盖，轻轻颠倒混匀数次。

在冰上静置15min让质粒DNA复性；

min离心10min，将上清移入另一个的离心管中；

7.向上清中加入等体积（约450µL）的酚：

氯仿：

异戊醇（25：

24：

1）（去蛋白质和脂肪），手摇混匀，12000r/min离心5min，将上清移到另一个新的离心管中（操作要平稳，不要将下边的有机相带上来）；

8.向上清中加入等体积的氯仿：

异戊醇（24：

1）（去微量酚和脂肪），轻轻颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清移入另一个的离心管中（不要将下边的有机相带上来）；

9.向上清中加入2倍体积的无水乙醇（冰冷的），混匀后，室温放置10min。

12000r/min离心10min，弃上清；

10.加入1mL冰冷的70%乙醇，吸打悬浮，12000r/min离心2min，再重复一次。

将离心管中的乙醇倒净，倒扣在滤纸上吸干，再置超净台上15min，让酒精挥发干净；

11.加20µLRTE（含有RnaseA20µg/mL的TE缓冲液），使质粒溶解，-20℃保存。

实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA

一、实验目的：

掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的技术与方法

二、实验原理：

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双涟DNA几乎具有等量净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子（以质粒为例，一般情况下迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环）。

三、仪器、材料与试剂

（一）仪器

  1.琼脂糖凝胶电泳系统2.凝胶成像系统

（二）材料与试剂

材料：

1.pGEM-T质粒DNA（含PODa基因3’片段）（是实验三的回收产物）

2.琼脂糖

3.ＥＢ（溴化乙锭）

试剂：

1.5×TBE

2.6×loading-buffer（加样缓冲液）

四、实验步骤

1.制备1%琼脂糖凝胶：

称取0.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入×TBE缓冲液，置微波炉中加热至完全融化，取出摇匀，室温下降温至60℃左右，开始制胶板；

2.胶版制备：

将有机玻璃内槽洗净晾干，放置一水平制胶器中，并放好样品梳子，待凝胶放凉至60℃左右时，缓缓倒入有机玻璃内槽（注意，不要形成气泡）即成胶板，室温下凝固约30min，将有机玻璃内槽放入电泳槽内（注意方向：

加样孔远离电泳槽的正极端）。

3.加电泳液：

将×TBE缓冲液加入电泳槽内，刚好淹没凝胶平面，轻轻拔出梳子。

4.加样：

取DNA2µL+DDH2O3µL+6×loading-buffer1µL，混匀后用移液枪加入加样孔。

记录加样的顺序。

通常第一泳道加样为DNAMark。

5.电泳：

电压一般不超过5V/cm，注意电极的方向不能错了，DNA向正极移动。

当溴酚蓝移动到凝胶前沿约2cm时，停止电泳，切断电源。

6.染色、照相：

戴上手套，将凝胶移入盛有µg/mLEB的染色盘中，染色5min，在移入蒸馏水中漂洗5～10min，洗掉多余的燃料，然后转入凝胶成像系统照相。

操作中谨防EB污染。

五、试验结果注意观察DNA的分子量大小，估计DNA的含量，推测出样品DNA的浓度，观察质粒的3种构型，分析质粒DNA的质量，判断可否作为下一步基因重组的材料？

实验五PCR基因扩增

一、实验目的：

掌握PCR反应的基本原理和实验技术

二、实验原理：

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。

可用于基因分离，序列分析，基因表达调控等许多方面。

三、仪器、材料与试剂：

仪；凝胶电泳及凝胶成像系统；Taq酶及其Buffer；PCR管

2.PCR反应成分：

.模板DNA：

实验三提取的质粒DNA（含Poda3’）2ul（浓度高的稀释5倍后）

.引物:

poda3’P1（10umol）1ul

.引物：

poda3’P2（10umol）1ul

.dNTP：

（each）4ul

.反应缓冲液：

10×plusBuffer5ul

.DNA聚合酶：

TaqplusPolymerase2ul

.DDH2O35ul

四、PCR反应基本步骤：

.94℃预变性5min；

.94℃变性40S；

.61℃退火40S；

.72℃延伸60S;

.重复

～

步35次；

72℃延伸5min；

4℃保存4min；

end。

五、电泳检测PCR结果

取PCR产物5ul+6×loadingbuffer1ul

于1﹪琼脂糖凝胶中电泳（恒压120V），产物预计为421bp大小。

其余产物纯化回收，-20℃保存，准备下一个实验——DNA重组。

实验六DNA重组

一、实验目的：

掌握DNA重组的实验技术

二、原理：

DNA重组是将外源DNA与载体分子连接，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。

重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子连在一起，而且能使平末端的双链DNA分子连接起来，但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

本实验利用了Taq酶的PCR产物DNA末端自动加A的特点，与pGM——T载体末端的T正好互补，再在T4DNA连接酶作用下相连接，从而实现了快速链接重组。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这样的温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。

一般的连接条件是在12-16℃，反应12-16小时（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。

本实验采用4℃条件下链接过夜。

载体用的是pGM-Tvector和T4链接酶，外援DNA为PODa3’的PCR产物。

三、实验操作：

1.纯化目的DNA

取PODa3’PCR的产物，转入离心管，加入1/10体积的3mol/LNaAc，混匀后加入倍体积的冰冷无水乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成沉淀。

15000rpm离心10分钟,去上清，沉淀用预冷的70%乙醇500µL漂洗，12000rpm离心5分钟收回，彻底倾倒乙醇后，45℃烘箱干燥约15min或超净台无菌风吹干15min后，加入20µLDDH2O使其溶解。

准备连接用。

2.链接重组

反应液：

目的PCR片段（PODa3’的）1ul

pGM-Tvector1ul

10×T4LigationBuffer1ul

T4DNALigase1ul

DDH2O6ul

至冰箱中4℃条件下链接过夜。

准备下一步——转化与蓝白斑筛选实验。

实验七蓝白斑筛选实验

一、实验目的：

掌握重组子（阳性克隆）的筛选技术

二、原理：

蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。

现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。

在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。

因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。

这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。

由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。

然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。

这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。

经连接产物转化的大肠杆菌工程菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。

三、实验操作：

1.实验材料：

top10感受态；目的DNA与pGM-T载体的链接产物；LB固体平板培养基（含AMP100ug/ml）；IPTG（0.1M）;Xgal（50mg/Ml）

2.操作步骤

转化平板的制备：

向含有AMP的固体培养基平板表面加入40µLIPTG（0.1M）+16µLX-gal（50mg/Ml）,使用无菌的玻璃棒均匀涂开。

避光37℃放置1～3小时，使溶解X-gal的二甲基甲酰胺尽量挥发干净。

转化：

.取50～100µL感受态细胞，加入5µL链接产物（加入量不要超过感受态细胞体积的1/10）,轻轻混匀，冰浴30min；

.将上述离心管置42℃水浴中，精确90秒，取出后立即冰浴3min，期间不要摇动离心管；

.向离心管中加入500µLLB培养基，150rpm、37℃振荡培养60min，使质粒上相关抗性基因表达，使菌体复苏；

.在超净工作台上，将离心管中的菌液混匀，取出200µL菌液加到LB琼脂培养基（含Amp）上，用无菌玻璃棒将其均匀推开，待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12～16小时。

3.检测：

常规检测：

未转化的菌将不能在培养基（含Amp）上生长；空载体的转化子为蓝色菌斑；重组子的转化子为白色菌斑。

可进一步挑取白色菌斑，LB液体培养基（含Amp）37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切鉴定插入的片段是否正确（由下一个实验--DNA酶切技术来完成。

或以质粒为模板PCR检测亦可。

实验八DNA酶切技术

一、实验目的：

掌握DNA的酶切技术，了解它在DNA重组中的应用。

二、DNA酶切实验原理：

　　限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。

它可分为三类:

Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。

Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。

Ⅱ类由两种酶组成:

一种为限制性内切核酸酶（限制酶）,它切割某一特异的核苷酸序列;另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。

Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:

5'-G↓AATTC-3'）,有少数酶识别更长的序列或简并序列。

Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段（如SmaⅠ:

5'-CCC↓GGG-3'）;有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端,如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

　　5'…G↓AATTC…3'→5'—GAATTC---3'

　　3'…CTTAA↑G…5'→3'—CTTAAG---5'

　　DNA的酶切技术应用十分广泛，如构建DNA限制性内切酶图谱和DNA重组等。

　　DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。

在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性）技术就是建立在它的基础上。

　它是重组DNA的基础，又是对重组结果的一种鉴定方法。

本实验六重组的结果，经实验七的筛选之后，通常还要做进一步的酶切鉴定。

三、实验操作：

1.从实验七蓝白斑筛选的平板上挑选白色菌斑，LB液体培养基（含Amp）37℃振荡培养过夜，提取质粒（参考实验三），并电泳检测。

2.酶切反应液：

置微型离心管中，总体积20ul。

配方如下：

10×NEBBuffer2ul

　DNA≤1ug

EcoRI1ul

DDH2O至20ul

3.37℃保温（6～14h.）或过夜

4.取5ul反应液，琼脂糖凝胶电泳检测分析结果。