原位杂交手册.docx
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原位杂交手册
第1章共用程序
引言:
本章介绍了本实验最基本的实验程序,包括中期染色体制片;质粒的转化与DNA的提取;探针标记检测以及基因组总DNA的提取
第1节原生质体染色体制片
试剂:
饱和a-溴萘、0.075MKCl、固定液(新鲜3:
1甲醇冰乙酸)、酶解液(20%纤维+2%果胶酶)、INHCl、95%酒精
实验步骤:
浸种室温下浸种约一天(也可1-2h)
发芽培养皿中垫湿滤纸三层,利子分散其上,间留间隔,勿堆积,种子上层覆盖一层水浸湿的滤纸,25-30℃下发芽,每天水洗一两次,约2-3天可取根。
NOTE:
换水是很重要的,水不能过多,以不留流动水为好,水分过多易长芽而根长不好。
预处理
方法1:
根长至1.5-2cm长时切取1.5mm左右的根尖,饱和a-溴萘约25℃处理2-3小时,水稻一般不预处理。
方法2:
根长好后将种子置于4℃冰箱处理一个晚上,第二天在25℃下恢复2-3h,也可得到许多分裂相。
NOTE:
何进取根尖最好具随机性,与季节以及细胞分裂时期很有关系。
(玉米8:
00AM,水稻11:
00-12:
00AM)
水洗反复几次
前低渗ddH2O或0.075MKCl(0.6KCl溶于100mlddH2O)低渗30min(室温)。
固定新鲜3∶1甲醇冰乙酸固定2-3小时或4℃过夜。
NOTE:
一定要用新鲜固定液;如果用于石蜡切片组化显色,甲醇固定的材料会导致很高背景,应换用4%多聚甲醛。
水洗反复几次,洗净。
酶解2%纤维素酶+2%果胶酶混合(1∶1),28℃下处理3小时左右。
NOTE:
酶解是最至关重要的一步,首先是酶的质量,很多酶都可导致分裂相少,以SERVA公司的果胶酶为最好,根据材料不同,酶解时间会有所变化。
洗载片载片一定要干净,以防材料脱落和保持清洁的背景。
洗片步骤:
1)INHCl中3min以上
2)自来水洗(每片单独漂洗)接着用双蒸水洗
3)95%酒精浸泡30min以上(每片单独放入)
制片小心吸去酶液,水洗几次,吸取1-2个根尖于干净的干载玻片上,滴半滴固定液,用镊子敲至浆状,滴2-3滴固定液使材料分散,火烤至着火。
NOTE:
敲得越碎越好,敲至固定液干后,再滴固定液,迅速涂开,火焰干燥,干燥后肉眼观察应为规则干净的小雨点状,若小雨点上像有一层不透明的薄层,说明酶解时间不够。
镜检检后将符合要求的制片储存于-20℃下备用。
NOTE:
每张制片上至少应有150个左右分散良好但背景干净的分裂相方可用于杂交。
REFERENCES
第2节质粒的转化与扩增
若寄来的探针是插在质粒中cDNA克隆或基因片段,首先要对其进行转化,一般利用E.Coli作为载体,转化的关键在于如何制备感受态的E.Coli细胞,本实验利用CaCl2来制备感受态细胞,此方法简便、快速。
试剂:
LB培养基,0.1MCacl2,70%甘油
实验步骤:
感受态E.Coli的制备
从-20℃下取2-5µlE.Coli,涂在平板上,37℃培养16-20h。
挑取单个菌落于20ml已预热至37℃的LB培养基(不含Amp)中,37℃,300rpm剧烈振摇约3h。
培养物转移至4支预冷的5mlEppendorf管,冰上放10min,4000rpm离心3-5min,回收细胞(4℃);倒出培养液,倒置lmin。
以5ml预冷的0.1MCacl2重悬每份沉淀,冰浴30min。
4000rpm离心5min(4℃);倒出培养液,倒置lmin。
每管加预冷的0.1MCaCl20.25ml,重悬细胞,冰浴lh
每管100µl分装,保存于-20℃下,长期保存转化效率会有所下降。
质粒DNA的转化
取-20℃保存的感受态细胞二支,冰上溶解10min,一支加质粒cDNA(<10µl,<30ng),混匀,另一支作为对照,冰浴30min。
42℃水浴放置90秒,保持1-2min。
快速置于冰浴,保持1-2min。
每管加200-300µl培养基,用水浴加热至37℃。
37℃摇床温育45min。
扩增(无菌操作)
将温育后的转化细胞转移至含抗生素(100µg/mlLB)的LB平板上。
当液体被培养其吸收后,倒置平板,37℃培养12-16h,时间不宜过长。
菌落生成后,挑取单个菌落,37℃于LB液体培养基中培养24h左右。
加70%甘油,-20℃保存。
第3节质粒DNA的提取
试剂:
LB固体培养基,LB培养基,Sol.Ⅰ,Sol.Ⅱ(当配当用),Sol.Ⅲ,Sol.VI,异丙醇,70%酒精,RNaseA,100%EtOH,TE溶液
实验步骤:
活化含重组质粒细菌用划线法接种在LB固体培养基上,37℃培养箱培养过夜。
扩增挑选单个菌落接种在含20µlAmp的20mlLB培养基中,摇床,250rpm,37℃培养16-18小时,至溶液混浊,但不能培养过久。
离心两支5mlEppendorf分装一半,8,000rpm(过高速度的离心会导致沉淀物难以悬浮Sol.Ⅰ)离心10-15min,去上清液,再倒入另一半,重新离心,去上清,沉淀合并。
裂解
Sol.Ⅰ,200µl,振荡混匀。
(确使细菌沉淀完全分散)
Sol.Ⅱ,300µl,(当配当用)振荡5秒钟,然后冰上10min。
(快速颠倒离心管5次,以混合管内容物)
Sol.Ⅲ,400µl,振荡5秒钟,置冰上10-15min以上。
(盖紧管口,将管倒置后温和振荡10秒,冰上3-5分钟)
离心13,000rpm离心10min,上清液转入1.5mlEppendorf管中。
抽提加入等体积Sol.VI,至乳浊状,10,000离心5min。
沉淀吸上层水相至新的Eppendorf管中,加等体积异丙醇(或无水乙醇两倍体积),振荡30秒钟,然后置于-20℃下沉淀DNA,至少2h。
收集12,000rpm离心10min后,去上清液,37℃干燥。
洗涤加70%酒精洗涤2-5min,12,000rpm离心10min,同上干燥。
NOTE:
用于DNA原位杂交的探针,从此步骤直接进入最后一步(溶解保存),但用于RNA原位杂交的探针,必须还经后续RNaseA处理及抽提步骤。
溶解加入50µlddH2O溶解,在4℃下溶解30-60min。
RNaseA处理加入2.5ul10mg/ml,37℃处理1h。
抽提再加入50ulddH2O,加入100ulSol.VI混匀,10,000离心5min。
沉淀吸上层水相至新的Eppendorf管中,加2×体积100%EtOH沉淀过夜。
收集12,000rpm离心10min后,去上清液,37℃干燥。
保存加入20µlTE溶液,在4℃下溶解30-60min(一般20ulTE溶解5ml菌液提取的质粒最终探针浓度约为0.4ug/ul,不计载体),然后转入-20℃冰箱保存,或用75℃水浴15min后转入-20℃冰箱保存。
NOTE:
为了使双色FISH一定体积杂交液中探针浓度达一定值,此处控针浓度不能太小。
酶切反应体系
质粒DNA1ug(约3-4u1)
ddH2O至终体积15ul
10×Buffer1.5ul
Enzyme2.5U
混匀,适当温度下(一般为37℃)反应45~60min
电泳鉴定1~2%的琼脂糖电泳鉴定,每条泳道两条带说明酶切完全。
碱变性提取质粒用So1.I-IV的配制
So1.I100ml(灭菌10磅15min.4℃保存)
成份
用量
终浓度
分析纯葡萄糖(glucose)
1.0MTrisCl-8.0
0.5MEDTA-8.0
ddH2O
0.9g
2.5m1
2.0ml
至100ml
50mM
25mM
10mM
Sol.II包括a,b两种,用时掺合
成份
掺合比
工作浓度
10%SDS
SDS
4g
100ul
1%
ddH2O
约35ml
稀碱调Ph7.2(变化快)
ddH2O
至40ml
10MNaOH
NaOH
40g
20ul
0.2M
ddH2O
至100ml
ddH2O
880ul
Sol.III(3MKAc)100ml
KAc25.2g
H2O80ml
冰乙酸(约11.5ml)Ph5.5
H2O 至100ml
(灭菌,4℃保存)
NOTE:
[K+]为3M,[Ac]为5M
Sol.IV
平衡酚:
氯仿:
异戊醇=25:
24:
1(可改为氯仿:
异戊醇=24:
1)
附:
平衡酚步骤:
重蒸酚在68℃左右溶解后,加入等体积0.1MTris-C1-8.0(含0.2%β-巯基乙醇),激烈振荡,加入固体Trisbase调pH。
待分层后,测得上层水相pH在7.0以上(可在加入1g/100ml左右Tris后,pH仍在7.0以下时去水相,再加1MTris反复萃取直至水相pH至7.0以上)。
收集下层有机相于量筒,迅速测定体积后,再迅速转移至棕色瓶中,并覆以1/10体积的0.1MTris-Cl(含0.2%β-巯基乙醇)。
第4节探针标记
基本知识
标记应考虑的总是主要有两点:
标记物和标记方法。
一般原位杂交中标记物都是用非放射性标记,而Southern杂次中用放射性标记,非放射性标记的标记稀常见珀有三种,Fluorescein-dUTP,Bio-dUTP和DIG-dUTP,Fluorescein-dUTP标记称直接标记,快速、简便、背景低、但灵敏度不高,适于检测重复序列。
后二者标记称间接标记,可以在杂交后对信号进行级联放大,适于检测单/低拷贝序列。
标记方法主要有四种:
DNaseⅠ/DNAPolymeraseⅠ介导的切口平移法(NickTranslation);Klenow介导的随机引物法;末端转移酶(TdT)介导的末端标记法以及Taq酶介导的PCR法,对于>lkb的探针,建议采用切口平移法;随机引物法标记效率比切口平移高,更适合于100bp-lkb探针的标记;而对于<100bp的探针,则需要用末端标记法;但如果你手头的探针量很少(少至50ng),相应引物的话,PCR是最佳选择,简便快速,可制备大至4kb的探针。
实验步骤
4.1切口平移标记法(Biotin)
本实验室用于中期染色体原杂交的探针一般用生物标记。
依次加入下列试剂于1.5mlEppendorf管中:
探针数
1
2
3
终浓度(50ul中)
dNTP
10
20
30
30uMofeach
10×Buff
5
10
15
1×
Bio-11-dUTP
4
8
12
30uM
ddH2O
26
52
78
DNaseⅠ(0.75ng/ul)
2.5
5
7.5
1.88ng
DNAPol.Ⅰ
12U(2.5ul)
24U
36U
12U
质粒DNA(~0.4ug/ul)取上述混合液45ul,加相应探针5ul
1.5~2ug
15℃下反应2.5h,加5ul终止液(Stopsolution)终止。
NOTE
DNAPol.Ⅰ的量应参照各厂家提供的浓度,以每50ul标记液中含12U为准。
原位杂交探针的合适长度为300~600bp,照此系统标记中DNaseⅠ用量,一般可达到这一目的;若为NT试剂盒,其提供的浓度应已考虑这一参数,因此酶量应已优化。
现在标记一般用华美公司试剂盒[包括10×Buffer、消毒三蒸水、dNTP、stopsolution(0.5MEDTA)]。
4.2纯化已标记的探针:
制作柱子
在0.5ml微Eppendorf管底部用青霉素皮试探头刺孔,将少量硅化玻璃丝加在底部,套入去底的1.5ml微Eppendorf管中,再置于15ml培养管中,加入750µlSepharoseCL-6B于穿孔微Eppendorf管中,25,00rpm离心5mim。
用另一新1.5ml微Eppcndorf管更换,贴上Prode标签。
在作好的新鲜柱子上,立即加入已标记的Probe(注意柱子一定要当作当用),25,00离心10mim。
测定纯化后Probe的体积,储存于-20℃下备用。
4.3其它探针标记方法:
用于多色FISH或Fiver-FISH,除用生物素标记外,至少还要用到另一种标记物,一般也为地高辛(Digoxigenin/Digoxin,DIG);而用于SouthernBlotting时,则一般用同位素(Isotope)标记,也可用DIG标记。
介绍两种试剂盒的标记方法(试剂盒上有)
DNaseⅠ/DNAPolⅠ介导的切口平移标记
法(32P)(NickTranslationLabelingKit,Promega)
Klenow介导的随机引物标记法(DIG)
(DIGLabelingandDetectionKit,B.M.)
反应体系(50ul)
反应体系(50ul)
dNTP(dATP,dTTP,dGTP)
10×Buff
回收的Probe(不含载体)
ddH2O
DNaseⅠ/DNAPolⅠ
32P-dCTP(最后加)
10ul
5ul
5ul(约1ug)
21ul
5ul
4ul
dNTP(dATP,dTTP,dGTP)
10×Buff
回收的Probe(不含载体)
6merPrimers(0.09U/ul)
ddH2O
DNaseⅠ/DNAPolⅠ
32P-dCTP(最后加)
10ul
5ul
5ul(约1ug)
3ul
21ul
5ul
2ul(5U)
15℃下反应1.5h,Stopsolution终止
37℃下反应1.5h,Stopsolution终止
NOTE
应用于SouthernBlotting的探针应为不含质粒载体的插入片段,因此应先用相应的限制性酶进行酶切,而后用低熔点琼脂糖对探针进行回收。
相比之下,PCR标记的优点是只须极少量(50ng)的插入片段(模板)便可扩增出大量高效标记的探针(Friedman,1990),并且一般直接可用少量细菌裂解液做模板。
缺点是必须要有目的插入片段的特异性引物和相应的仪器设备,并且,人们总是发现一些克隆,它们不能用这种方法扩增,原因不明。
探针标记用溶液配制
20×生物素稀释液10ml
成分
用量
工作浓度
1MTris-7.5
0.5MEDTA
ddH2O
1ml
2ul
9ml
5mM
5uM
NOTE:
每管1ml分装,-20℃保存。
使用时稀释20倍。
Bio-11-dUTP购进时一般为储存浓度10mM(如果为固体,则0.1mg溶于11.6ul稀
释液中)。
分装成1ul/管储存,用时每管加入19ul稀释液稀释成工作浓度0.5mM。
稀释后的Bio-11-dUTP不适合长期保存,反复冻溶5次后将影响标记效果。
DNaseⅠ稀释液=10×SA-HRP稀释液
DNaseⅠ贮存液(1mg/ml)10ml
成分
用量
贮存液中浓度
1MTris-7.5
甘油
1MMgCl2
ddH2O
DNaseⅠ
200ul
5.0ml
10ul
4.8ml
1.0mg
20mM
50%
10mM
1mg/ml
NOTE:
此贮存液要先用DNaseⅠ稀释液按以下方法稀释。
DNaseⅠ稀释贮存液(0.75ng/ul)
取1mg/mlDNaseⅠ贮存液2ul,加入198ulddH2O,振荡混匀,取混匀后的液体3ul,加入7ulDNaseⅠ稀释液,振荡混匀;再取混匀后的液体5ul,加入15ulDNaseⅠ稀释液,振荡混匀,每管0.5ml分装,-20℃保存。
第5节点印渍检测标记效果(NBT/BCIP显色程序)
基本知识
检测和定位抗原一般是通过抗原-抗体反应完成。
在通用的二级抗体上连接荧光分子或酶,便可进行荧光装置直接检测或经酶底物显色后间接检测。
后者称酶联免疫显色反应(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssayELISA),在许多领域都占有重要应用。
常用的酶是辣根过氧化物酶horseradishperoxidase(HRP),常通过底物DAB来显色;另一种是碱性磷酸酶alkalinephosphatase(AP),通过底物NBT/BCIP来显色(Ruzen,1995)(如下图)
应用
①检测探针标记效果;②检测ISH信号;③基因表达原位分析(切片上的mRNA定位;蛋白质定位);④检测细胞凋亡中DNA特异片段化;⑤DIG或Biotin标记的SouthernBlotting,WesternBlotting;⑥ELISA
实验步骤:
生物素标记的探针
DIG标记的探针(详见KIT,B.M.)
点膜
1ulProbe点于2cm×3cm硝酸纤维上,同时点对照
烤膜
80℃下20min
封阻
55-60℃下在小培养皿BufferⅡ中用摇床摇30min(60℃以上BSA会变性)
洗膜
BufferⅠ洗膜2min(5mlEppendorf管)
偶联
偶联SA-AP溶液5ml(SA-AP2.5ul,BufⅠ5ml),37℃摇床,30min(黑色5mldorf管)
0.05MTris-7.5中以1∶5000稀释抗DIG-AP(B.M.),并以此代替SA-AP溶液。
洗膜
BufferⅠ2min,BufferⅢ2min(5mlEppendorf管)
显色
加显色液(NBT/BCIP),20℃(或37℃)下10min(黑色5mldorf管)
烘膜
80℃10min,然后贴在记录本上
第6节CTAB法提取植物总DNA
第2章中期染色体原位杂交
引言
通过原位杂交(insituhybridizationISH)对特异DNA序列在植物染色体上进行物理定位,现在在植物分子生物学的许多领域变得日益重要。
ISH可以给人们提供基因或DNA序列在染色体上的真实物理位置和次序信息(Heslop-Harrison,1992;Leitch,1994;Bennett,1995)。
有助于通过染色体步查分离目的基因的研究,也可使人们对物理图谱和遗传图谱进行比较(Gustafson,1990;Pedersen,1995),架起了两者之间的一座桥梁(deJong,1999)ISH在方法上也逐步形成了从繁琐到简单、从放射性标记到非放射性标记、从DAB检测向荧光(FISH)再向多色荧光检测、从常规杂交向原位PCR以及Fiber-FISH的发展格局,灵敏度和分辨率正在由Mb向kb、百分距离向碱基对、多拷贝向单拷贝、大片段向小片段再向BAC/YAC的方向迈进。
DNA原位杂交的载体有以下几种:
间期(interphase)染色质;减数分裂粗线期(pachytene)染色体;中期(metaphase)染色体;DNA纤维(DNAFiber)。
应用
基因定位
分析DNA序列位置与基因组高级结构、基因活性及遗传重组之间的关系
转基因植物的确定、鉴定基因插入位点
鉴定外源渗入染色体片段(GISH)
基因克隆(Fiber-FISH)
物种间的亲缘关系
多倍体形成研究
第1节原位杂交
NOTES
本章介绍的是生物素标记探针的原位杂交程序
整个操作中,除非特别指明,应注意保持载玻片湿润
除非特别指明,均应在20-25下操作。
一、所需试剂及仪器:
水浴锅、温箱、烘箱;
70%、95%、100%EtOH,去离子甲酰胺,2×SSC,20×SSC,RnaseA,SDS(10%),Probe。
二、实验步骤:
简单描述为:
制片干燥RNaseA处理变性脱水探针变性杂交
1、设置37℃,70℃水浴锅,37℃温箱,60℃烘箱
梯度乙醇脱水染缸(各50ml):
染缸1:
70%EtOH
染缸2:
95%EtOH(保存在-20℃下)
染缸3:
100%EtOH
2、干燥:
在60℃烘箱中烤一小时或在室温下干燥。
前者有助于染色体在载玻片上固定,更难脱落。
但就是在空气中干燥,染色体一般也不会脱落。
3、准备变性染缸:
染缸4:
35ml去离子甲酰胺(不灭菌)在70℃水浴中保温
染缸5:
15ml2×SSC,加盖
Note:
此时不能把两种溶液混在一起预热,染色缸随水浴锅一起升温,否则易引起染色缸破裂
4、准备RNaseA溶液(1µg/ml)染缸:
染缸6:
原液5µl(10mg/ml)37℃水浴保温
2×SSC50ml(灭菌)
5、RNaseA处理,37℃一小时。
Note:
也可直接吸取RNaseA溶液50µl左右,用干净盖玻片盖好,保温皿内37℃保温1h。
6、敲一盒冰,取出-20℃下配制杂交液的药品,冻融后配制杂交液
片子数(不同探针)
123456
终浓度
FAD(Sigma)(100%)
硫酸葡聚糖(50%)
20×SSC
SDS(10%)
sssDNA(华美,10mg/ml)
25.050.075.0100.0125.0150.0
10.020.030.040.050.060.0
5.010.015.020.025.030.0
2.55.07.510.012.515.0
0.51.01.52.02.53.0
50%
10%
2×SSC
0.5%
0.2%
Probe
每张片子取混匀溶液43µl,加相应probe7µl
(30-40ng/µl,计载体),混匀,短暂离心,置于冰上
~5ng/µl(不计载体)
NOTES:
所有药品应始终放在冰上
配制好的杂交混和液可在-20℃下保存6个月
SDS是一种湿润剂,可帮助探针穿透进入,使用浓度一般为0.05~1.0%
7、配制70%FAD:
在RnaseA处理完成前,将在70℃下的去离子甲酰胺加入热的2×SSC中继续保温。
(70µlFAD+30µl2×SSC/片,70℃烘箱)
8、变性:
RNaseA处理完后,片子在70℃70%FAD中处理3.5min。
9、脱水(-20℃):
取出后立即放入
-20℃70%乙醇-20℃,95%乙醇,-20℃,100%乙醇,
中,5min5min5min
10、制片取出后,空气中干燥20min以上,直至表面完全不留水珠。
NOTE:
最好在脱水后检查一下染色体形态,如果已经变形,就不必再往下做了。
11、杂交液变性:
在用冷无水酒精处理的同时,将配好的杂交液在沸水中煮10min,取出后立即置于冰上,不可怠慢,在冰上至少保持5min,方可杂交。
12、制作保湿皿:
大培养皿底部放三层滤纸,加2×SSC湿润,直至可看到少量可以流动的溶液,上面加两根玻棒,以支持制片,避免与2×SSC接触。
13、杂交:
玻片干燥后,杂交液在冰上已放置10min以上,这时就可以将制片放入保湿皿中,在冰上用枪头搅匀杂交液,接着将杂交液等量(约40µl)加入制片,使杂交液成一大滴,滴在片子淡红中间,盖上盖片,如有气泡用枪头轻轻赶出,盖上保