培养基验收作业指导书删减版.docx

培养基验收作业指导书删减版.docx

《培养基验收作业指导书删减版.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《培养基验收作业指导书删减版.docx（18页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

培养基验收作业指导书删减版

培养基质量控制作业指导书

1、目的：

为加强我微生物实验室的工作管理，保证实验室的检测质量，特制定此作业指导书；

2、范围：

本规范适用于实验室微生物检测中所使用培养基的质量控制。

3、职责：

3.1检验人员：

按照本规程规对培养基使用前及使用过程中进行质量控制，确保培养基符合相关标准的要求。

3.2科室负责人：

负责指导、监督检验人员对培养基进行质量控制。

4、控制措施：

4．1培养基的购置和验收

4.1.1培养基的购置

试剂管理员在接到批准的采购信息后，从合格供应商中选择厂商采购，同时要求厂商提供每批培养基的批号、使用前的pH值、储藏信息、有效期、性能评价记录（包括测试菌株、技术数据清单、质控证书及必要的安全危害数据）。

4.1.2培养基的验收

购买培养基到货后，由试剂管理员和微生物检测人员共同核对生产企业提供的资料、培养基名称、规格数量、外观特征、批号、保质期是否符合要求。

同时应填写“培养基验收检查记录单”验收符合要求后，交由检测人员接受保管，填写培养基入库记录和建立试剂台帐。

4．2培养基的储存

干粉培养基应保存在阴凉干燥处，要避免阳光直射；开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮并在有效期或6个月内用完。

应每月对储存中的培养基进行常规检查，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查，如果培养基发生结块、颜色异常和其他变质迹象就不能再使用。

开封的脱水培养基，每次使用前应对其质量进行检查，通过粉末的流动性、均匀性、结块情况和色泽变化等判断培养基的质量变化。

若发现培养基受潮或物理性状发生明显改变则不应再使用。

即用性培养基按照产品标识要求进行储存。

4．3培养基的使用

4.3.1配制培养基用水和玻璃器皿　　培养基制备用水应使用电阻率不小于30万Ωcm的蒸馏水或与其同质的水，每周检测电阻率，每三个月检测一次重金属离子含量。

制备培养基所用的玻璃器皿（如吸管、试管、烧杯等）新的玻璃器皿（首次使用）和再次使用的玻璃器皿按规定方法洗涤、干燥

4.3.2称量　　称量时要用专用的角匙，避免交叉污染而影响检验结果；干粉培养基易吸潮，如房间环境湿度较大时，应提高称量速度，完毕后及时盖紧瓶盖。

4.3.3复水　　复水时应注意以下事项：

a）不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物的生长；

b）容器的大小需大于复水后培养基总体积的2倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出；

c）加热培养基时一定要进行搅拌，特别是琼脂类培养基；

d）为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基最好使用沸水浴进行加热；

e）含有琼脂粉的培养基，在加热溶解之前可以浸泡数分钟；

f）对于琼脂类培养基进行再融化时应使用沸水浴或流动蒸汽进行加热，最多只能加热两次，第二次再融化后仍未用完的培养基应弃去；

g）烧糊的培养基营养物质被破坏，并可产生有毒物质，如发现焦化，或未溶解均匀前培养基有溢出，该培养基即不能使用，应重新制备。

4.3.4灭菌　　培养基采用高压蒸汽灭菌（湿热灭菌），通常是121℃15min，含糖或特殊培养基，按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。

已配制好的培养基必须在15分钟内灭菌，避免微生物生长繁殖而消耗养分，改变培养基的酸碱度。

为避免高温破坏培养基的营养成分，降低琼脂的凝胶强度，必须严格控制灭菌温度和时间，不可重复灭菌。

4.3.5pH测定　　在初次使用每批培养基时，均需随同检测配制一个测试培养基，在灭菌或消毒后应在25℃温度下采用精密PH试纸测试PH值，并判断是否符合要求；使用过程中，如果需要调整培养基的pH，应用1mol/LNaOH或lmol/LHCL调整，注意不可反复调pH，否则会影响培养基的渗透压。

4.3.6配制好的培养基标识和保存灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。

同时填写配制记录。

内容：

名称、配制量、配方（比）、操作中的重要参数（时间、压力、温度）、配制日期、配制者、截止使用日期。

在每个已灭菌的培养基容器外做好标记，注明名称、配制日期、使用期限和配制人。

培养基保存注意事项：

1）环境条件：

各种培养基均应在洁净的普通冰箱内保存，以2-8℃左右为宜，不得冻结。

2）保存时限:

基础培养基应在30天内用完。

鉴别培养基应在21天内用完。

选择性分离鉴别培养基制成平板后当日用完,置保鲜膜（袋）密闭保存期限可延长至一周。

从外单位购买的培养基保存时限按照产品标注的时限执行.

4．4培养基批号的的管理

培养基的批号由6位阿拉伯数字组成，批号为年、月、日，各取2位，年份取后2位，月和日不足2位时，分别在数字前加0，表明是本日配制的批号。

如2004年6月4日配制的培养基，批号为040604。

4.5质量检查

购置的同一批次培养基其质量检查应能通过无菌检查（制备好的培养基经30～35℃培养48小时，真菌培养基经20～25℃培养72小时候后，应无菌生长）、新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试，经检查合格的该批次培养基方准许使用，否则不准使用，做好检查记录。

。

成品培养培养基的质量控制应包括物理指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验室培养基质量控制性能测试记录及评估报告

4.5培养基的性能测试

新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试，包括物理指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验室培养基质量控制性能测试记录及评估报告，菌株的选择参考SN/T1538.2-2007《培养基制备指南第2部分：

培养基性能测试实用指南》。

4．5．1物理指标控制

1）测试20℃～25℃的pH值

2）琼脂层厚度；色泽；透明度和（或）是否存在肉眼可见杂质；

4．5．2微生物污染的控制

从每批制备好的培养基中选取至少一个（或1%）平板或试管，置于35-37℃或按特定标准中规定的温度培养48h应无菌生长，真菌培养基经20～25℃培养72小时候后，应无菌生长。

4．5．3微生物学指标控制

可根据要求选用定量方法、半定量方法或定性方法（详见表1-表）对培养基性能进行测试，具体操作方法如下：

（1）生长率

将适量测试菌株的工作培养物接种至固体、半固体和液体培养基中，每种培养基上菌株的生长率应达规定的最低限值。

1）定量方法

生长率PR的计算：

PR=NS/NO

NS：

从一个或多个待测培养基平板上得到的菌落总数。

N0：

从一个或多个规定的参考培养基平板上获得的菌落总数（该菌落总数应≥100cfu）。

要求：

非选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.7，该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.1；每平板（或每试管）的接种水平为10CFU～100CFU。

2）半定量方法

半定量方法采用生态测量技术在平板上划线，平板板连续划线区域得分的总和即为生长指数G，G值不应超过标准规定的允许范围。

3）定性方法

定性方法采用划线法观察。

①选择性

将浓度为104CFU/mL～106CFU/mL的非目标菌工作菌株悬浮液接种至选择培养基和参考培养基中，培养基的选择性应达到规定值。

②定量方法

选择因子SF：

SF=DO-DS

DO：

能在参考培养基上生长至少10个菌落的最高稀释度

DS：

能在测试培养基上显示生长的最高稀释度

要求：

非目标菌在选择性培养基上的SF至少为2；半定量和定量法中，非目标菌应部分或全部被抑制。

③生理生化特性（选择性和特异性）

规定培养基的基本特性，使用一套适当的测试菌株对培养基上的目标菌的生理生化特性（菌落形态、大小等）和非目标菌的被抑制程度进行测试。

（2）性能评价和结果解释

按照规定得到的所有测试菌株的性能均符合规定，则该批培养基品质优良；若只有物理指标和微生物指标符合规定，则该批培养基可被接收。

表1计数用选择性培养基

培养基

用途

培养条件

测试菌株

参考培

养基

控制方法

判定标准

特征反应

Baird-

Parker

[S]

生长率

37℃24-48h

金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923

TSA

定量

PR≥0.5

黑色/灰色菌落，周围为一混浊带，其外有透明带

选择性

37℃48h

大肠杆菌ATCC25922/8739

——

定性

全部抑制

——

特异性

37℃24-48h

表皮葡萄球菌ATCC12228

——

定性

——

黑色/灰色菌落，周围为一混浊带，其外无透明带

MYP

[S]

生长率

30℃24-48h

腊样芽胞杆菌ATCC11778

TSA

定量

PR≥0.7

具沉淀带的粉色菌落

选择性

37℃48h

大肠杆菌ATCC25922

——

定性

全部抑制

——

特异性

37℃48h

枯草芽胞杆菌ATCC6633

——

定性

——

不具沉淀带的粉色菌落

培养基

用途

培养条件

测试菌株

参考培

养基

控制方法

判定标准

特征反应

VRBG（结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂）

[S]

生长率

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922/8739

TSA

定量

PR≥0.5

带有或不带沉淀带的粉红色或红色菌落

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

选择性

37℃20h

粪链球菌ATCC29212/19433

——

定性

全部抑制

——

VRBL（紫红胆汁乳糖）

[S]

生长率

30℃20h

大肠杆菌ATCC25922/8739

TSA

定量

PR≥0.5

带有或不带沉淀带的淡紫色菌落

选择性

30℃20h

粪链球菌ATCC29212/19433

——

定性

全部抑制

——

特异性

30℃20h

铜绿假单胞菌ATCC27853

——

定性

--

无色至浅棕色菌落

CT-SMAC（改良山梨醇麦康凯琼脂）

[S]

生长率

37℃24h

大肠杆菌O157：

H7

ATCC43894/43895

TSA

定量

PR≥0.5

透明菌落，表面淡黄棕色，菌落直径约1mm

选择性

37℃24h

金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923

定性

全部抑制

——

特异性

37℃24h

大肠杆菌ATCC11775/25922

——

定性

——

粉色菌落

BGBLB（煌绿乳糖胆盐肉汤）

[L]

生长率

30℃24-48h

大肠杆菌ATCC25922/8739

TSA

半定量

浊度2+，导管1/3产气

产气并浑浊

弗氏柠檬酸杆菌

ATCC25922/8739

选择性

粪链球菌ATCC29212/19433

定性

不生长

——

EC

[L]

生长率

44℃24～48h

大肠杆菌ATCC25922

——

半定量

浊度2+，导气管1/3产气

产气并浑浊

选择性

44℃24～48h

铜绿假单胞菌ATCC27853b

——

定性

不生长

——

EC-MUG/

LS-MUG

[L]

生长率

44℃24～48h

大肠杆菌ATCC25922

——

半定量

浊度2+，导气管1/3产气

产气并浑浊，产生荧光

选择性

44℃24～48h

铜绿假单胞菌ATCC27853b

——

定性

不生长

——

乳糖胆盐发酵培养

[L]

生长率

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922

——

半定量

导气管1/3产气

产气并变黄色

选择性

37℃24h

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

——

定性

——

不产气、仍为紫色

LST（月桂酸肉汤）

[L]

生长率

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922

——

半定量

导气管1/3产气

——

选择性

37℃24h

福氏志贺氏菌CMCC51572

——

定性

——

——

表2计数用非选择性培养基

培养基

用途

培养条件

测试菌株

参考培

养基

控制方法

判定标准

特征反应

PCA（平板计数琼脂）

[S]

生长率

30℃72h

大肠杆菌ATCC25922/8739

TSA

定量

PR≥0.7

——

金黄色葡萄球菌ATCC6538

枯草芽孢杆菌ATCC6633

表3选择性增菌培养基

培养基

用途

培养条件

测试菌株

控制方法

判定标准

特征反应

EE

[L]

生长率

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922/8739

半定量

VRBG上＞10CFU

粉红至红色菌落，有或没有沉淀带

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

选择性

粪肠球菌ATCC29212

全部抑制

RVS

[L]

生长率

41.5℃24h

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

半定量

XLD或其他选择性培养基上＞10CFU

——

肠炎沙门氏菌ATCC13076

铜绿假单胞菌ATCC27853

选择性

41.5℃24h

大肠杆菌ATCC25922

半定量

TSA上全抑制

——

粪链球菌

ATCC29212

TSA上＜10CFU

SC（亚硒酸盐胱氨酸）

[L]

生长率

37℃24h

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

半定量

XLD或其他选择性培养基上＞10CFU

不同培养基上菌落特征不同（见标准）

+大肠杆菌ATCC25922

+铜绿假单胞菌ATCC27853b

选择性

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922

半定量

TSA上＜10CFU

——

粪链球菌

ATCC29212

TTB（四硫磺酸钠煌绿增菌液）

[L]

生长率

37℃24h

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

半定量

XLD或其他选择性培养基上＞10CFU

不同培养基上菌落特征不同（见标准）

伤寒沙门菌CMCC50071

选择性

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922

TSA上＜10CFU

——

碱性蛋白胨水

[L]

生长率

37℃24h

霍乱弧菌CMCC16109

半定量

TCBS或其他选择性培养基上＞10CFU

不同培养基上菌落特征不同（见标准）

副溶血性弧菌CMCC20001

选择性

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922/8739

TSA上＜10CFU

——

福氏志贺氏菌CMCC51572

7.5%氯化钠肉汤[L]

生长率

37℃24h

金黄色葡萄球菌ATCC6538

半定量

B-P平板或其他培养基上＞10CFU

不同培养基上菌落特征不同（见标准）

表4非选择性增菌培养基

培养基

用途

培养条件

测试菌株

控制方法

判定标准

特征反应

BHI

生长率

37℃24h

金黄色葡萄球菌ATCC6538

定性

浊度1～2

——

蛋白胨盐

[L]

稀释

20～25℃45min

大肠杆菌ATCC25922

定量

+/-50%菌落数/至（+/-50%原始菌落数

——

金黄色葡萄球菌ATCC25923

表4非选择性增菌培养基（续）

培养基

用途

培养条件

测试菌株

控制方法

判定标准

特征反应

乳糖蛋白胨肉汤

[L]

生长率

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922

——

定性

导气管1/3产气

选择性

37℃24h

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

——

定性

——

SCDLP液体培养基

[L]

生长率

37℃24h

铜绿假单胞菌ATCC27853

定性

浊度1～2

——

大肠杆菌ATCC25922

金黄色葡萄球菌ATCC6538

液体沙氏培养基[L]

生长率

26℃5天

白色念珠菌CMCC98001

定性

浊度1～2

——

真菌培养基[L]

生长率

26℃5天

白色念珠菌CMCC98001

定性

浊度1～2

——

表5选择性分离培养基

培养基

用途

培养条件

测试菌株

控制方法

判定标准

特征反应

亚硫酸酸铋琼脂（BS）

[S]

生长率

37℃48h

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

定性

良好生长

（2）

菌落呈黑色，有金属光泽

福氏志贺氏菌CMCC51572

菌落呈棕色

选择性

大肠杆菌ATCC25922/8739

全部或部分抑制（0～1）

无典型菌落

粪链球菌ATCC29212/19433

全部抑制（0）

--

XLD

[S]

生长率

37℃24h

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

定性

良好生长

（2）

菌落呈黑色

福氏志贺氏菌CMCC51573

菌落呈无色

选择性

大肠杆菌ATCC25922/8739

全部或部分抑制（0～1）

无典型菌落

粪链球菌ATCC29212/19433

全部抑制（0）

--

血琼脂平板

[S]

生长率

37℃24～48h

金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923

定性

良好生长

β溶血，透明溶血环

粪链球菌ATCC29212

定性

良好生长

α溶血,草绿色溶血环

TCBS

[S]

生长率

37℃24～48h

霍乱弧菌CMCC16109

定性

良好生长

菌落较大，呈黄色

副溶血性弧菌CMCC20001

定性

良好生长

菌落较大，呈绿色

4号琼脂

[S]

生长率

37℃24～48h

霍乱弧菌CMCC16109

定性

良好生长

菌落较大、扁平透明、湿润、中心带有黑色

非O1群霍乱弧菌CMCC17045

定性

良好生长

菌落较大、扁平透明、湿润、中心带有黑色

选择性

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922/8739

定性

全部或部分抑制（0～1）

——

表5选择性分离培养基（续）

培养基

用途

培养条件

测试菌株

控制方法

判定标准

特征反应

伊红美兰琼脂

[S]

生长率

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922/8739

定性

良好生长

菌落紫黑色带金属光泽

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

定性

良好生长

菌落灰白色半透明

福氏志贺氏菌CMCC51573

定性

良好生长

菌落灰白色半透明

TSI（三糖铁琼脂）

[S]

生长率

37℃24-48h

大肠杆菌ATCC25922/8739

定性

良好生长

斜面及底层均变黄，产气，硫化氢阳性

普通变形杆菌

CMCC49001

定性

良好生长

斜面及底层均变黄，产气，硫化氢阳性

福氏志贺氏菌CMCC51573

定性

良好生长

底层变黄，斜面变红，不产气，硫化氢阴性

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

定性

良好生长

底层变黄，斜面变红，产气，硫化氢阳性

表6非选择性分离培养基

培养基

用途

培养条件

测试菌株

控制方法

判定标准

特征反应

营养琼脂

[S]

生长率

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922

定性

良好生长

（2）

--

鼠伤寒沙门菌ATCC14028c

小肠耶尔森氏菌ATCC23715

8.管理8.1.贮存培养基的冰箱（或冰柜）内不得存放食品、饮料等无关物品。

8.2.使用前，须仔细检查培养基外观和效期，管理员应按规定的时间检查制备好的培养基的外观：

如失水、沉淀、过期、棉花塞松弛或脱落等异常情况，如发现失水、沉淀等异常情况，则同一批号剩余的所有培养基及时全部弃去，不得再用

8.3.对于过了效期、瓶塞松驰或脱落的培养基一旦发现立即弃去。

9、记录

商品化培养基/成品培养基目录清单

培养基试剂入库登记表

培养基配制记录

培养基质量控制性能测试记录及评估报告培养基标签

培养基制备用水检测记录

10引用标准

10.1GB/T27405-2008.实验室质量控制规范食品微生物检测[S].

10.2SN/T1538.1-2005.培养基制备指南第1部分：

实验室培养基制备质量保证通则[S].

10.3SN/T1538.2-2007.培养基制备指南第2部分：

培养基性能测实用指南[S].