分子生物学.docx

分子生物学.docx

《分子生物学.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学.docx（45页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

分子生物学

2010年分子生物学期末复习资料

第二章染色体与DNA

一、染色体

1、染色体是指在细胞分裂期出现的一种能被碱性染料强烈染色，并具有一定形态、结构特征的物体。

它由核酸和蛋白质组成，是生物遗传物质的主要载体。

（DNA、组蛋白和非组蛋白及部分RNA）

2、染色体蛋白主要分为组蛋白和非组蛋白两类。

组蛋白是染色体的结构蛋白，分为H1、H2A、H2B、H3及H4五种。

组蛋白含有大量的赖氨酸和精氨酸，其中H3、H4富含精氨酸，H1富含赖氨酸。

H2A、H2B介于两者之间。

3、真核生物基因组结构特点

①真核基因组庞大，一般远大于原核生物的基因组。



②真核基因组存在大量重复序列。



③真核基因组中大部分为非编码区。



④真核细胞基因转录产物为单顺反子，即一个结构基因转录、翻译成一个mRNA分子，一条多肽链。



⑤真核基因是断裂基因，在真核生物结构基因的内部存在许多不编码蛋白质的间隔序列，称为内含子，编码区则称为外显子。

⑥真核基因组存在大量的顺式作用元件。

包括启动子、增强子、沉默子等。

⑦真核基因组中存在大量的DNA多态性。

DNA多态性指DNA序列中发生变异而导致的个体间核苷酸序列的差异，主要包括单核苷酸多态性和串联重复序列多态性。

⑧真核基因组具有端粒结构。

端粒是真核生物线性基因组DNA末端的一种特殊结构，是一段DNA序列和蛋白质形成的复合体。

4、原核细胞DNA特点：

结构简炼：

原核DNA分子的绝大部分是用来编码蛋白质的，只有很小一部分控制基因表达的序列不转录；

存在转录单元：

原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，往往丛集在基因组的一个或几个特定部位，形成转录单元并转录产生含多个mRNA的分子，称为多顺反子mRNA；

有重叠基因：

一些细菌和动物病毒存在重叠基因，同一段DNA能携带两种不同蛋白质的信息。

二、DNA结构

1、高级结构的连接数的计算

①计算一个240bps的环状DNA在松弛态和w=-2的L和超螺旋密度。

松弛态：

L=T=240/10=24

超螺旋：

T=24；L=T+W=24+（-2）=22；

=-2/24=-0.08

②已知自然界存在大多数DNA分子的superhelicaldensity（超螺旋密度）

是-0.06，一个10000bpDNA分子，假定是B型构像，将形成多少圈超螺旋？

W/T=-0.06W=T*（-0.06）T=10000/10W=60

2、一级结构：

是指四种核苷酸的链接及排列顺序，表示该DNA分子的化学构成。

3、二级结构：

是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。

DNA的二级结构分两大类：

一类是右手螺旋，如A-DNA和B-DNA；另一类是左手螺旋，即Z-DNA。

B-DNA是最常见的DNA构象，也是活性最强的DNA构象。

三、DNA的复制

1、复制的方式：

半保留复制：

DNA在复制过程中，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。

每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式被称为DNA的半保留复制。

DNA的半不连续复制：

由于DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此在复制叉附近解开的DNA链一条是5’→3’方向，另一条是3’→5’方向，两个模板极性不同。

而所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5’→3’，两条链无法同时进行复制。

2、复制叉：

复制时，双链DNA要解开成两股链分别进行，所以，复制起点呈叉子形式。

复制的起点的特点：

复制时呈现复制叉的形式，一个复制子只含有一个复制起始点。

复制起始点是固定的。

复制方向：

移动的方向和速度虽是多种多样但以双向等速方式为主。

3、原核与真核复制叉的区别：

4、复制的几种主要方式：

线性DNA双链的复制和环状DNA双链的复制

5、原核生物和真核生物DNA的复制特点

原核生物DNA的复制特点：

真核生物DNA的复制特点:

6、DNA聚合酶：

共同：

都以dNTP为底物；都需要Mg2+激活；聚合时必须有模板链和具有3'—OH末端的引物链；链的延伸都方向为5'→3'。

大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III的性质比较

种类

特点

DNA聚合酶I

不是复制大肠杆菌染色体的主要聚合酶，它有5'→3'核酸外切酶活性，保证了DNA复制的准确性。

它也可用来除去冈崎片段5'端RNA引物，使冈崎片段间缺口消失，保证连接酶将片段连接起来

DNA聚合酶II

活性很低，若以每分钟酶促核苷酸掺入DNA的转化率计算，只有DNA聚合酶I的5%，所以也不是复制中主要的酶。

目前认为DNA聚合酶II的生理功能主要是起修复DNA的作用。

DNA聚合酶III

包含有7种不同的亚单位和9个亚基，其生物活性形式为二聚体。

它的聚合活性较强，为DNA聚合酶I的15倍，聚合酶II的300倍。

它能在引物的3’—OH上以每分钟约5万个核苷酸的速率延长新生的DNA链，是大肠杆菌DNA复制中链延长反应的主导聚合酶。

DNA聚合酶IV和V

分别由dinB和umuD’2C基因编码，主要在SOS修复过程中发挥功能。

7、DNA复制的调控：

ColEl质粒DNA的复制调控；大肠杆菌染色体DNA的复制调控；真核细胞DNA的复制调控

四、DNA修复

1、修复有以下几种：

错配修复恢复错配

在含有错配碱基的DNA分子中，使正常核苷酸序列恢复的修复方式。

）

碱基切除修复切除突变的碱基

核苷酸切除修复修复被破坏的DNA

DNA直接修复修复嘧啶二体或甲基化DNA

2、AP位点：

所有细胞中都带有能识别受损核酸位点的不同的糖苷水解酶，能特异性切除受损核苷酸上的N-β糖苷键，形成去嘌呤或去嘧啶位点。

3、甲基化酶的作用：

甲基化酶使位于5’-GATC序列腺苷酸的N6位甲基化，一旦在DNA复制过程中发生错配，错配修复系统就会依据Dam甲基化酶识别新合成链中的错配并加以校正，DNA子链中的错配几乎完全被修正。

只要两条DNA链上碱基配对出现错误，错配修复系统就会根据“保存母链，修正子链”的原则，找出错误碱基所在的DNA链，并加以修正。

五、DNA转座

1、DNA转座：

或称移位，是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。

2、插入序列（IS因子）：

是最简单的转座子，不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。

3、自主性因子：

是细胞内的控制因子，具有自主剪接和转座的功能。

4、非自主性因子：

是细胞内的控制因子，具有单独存在时是稳定的，不能转座，当基因组中存在与非自主性因子同家族的自主性因子时，它才具备转座功能。

5、Ac-Ds系统：

是激活-解离系统，它通过复制型机制进行转座。

Ac，是属于自主转座子，能够自主转座，并形成不稳定的基因突变，但不使染色体断裂；它能使Ds因子活化、转座，并通过控制结构基因的表达。

同时可以推迟Ds因子的解离和转座。

Ds元件属于非自主因子，又称解离因子，与Ac属于同一家族的控制因子。

已知所有Ds都是Ac转座子的突变体，其两端有完整的转座特征序列。

6、复合型转座子：

是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列。

第二章生物信息的传递（上）——从DNA到RNA

一、RNA转录的基本过程：

无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括：

模板识别：

主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。

转录起始：

是RNA链上第一个核苷酸键的产生，不需要引物。

通过启动子：

转录的延伸和终止：

RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA

链不断伸长的过程就是转录的延伸。

当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂和物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来，这就是转录的终止（termination）。

二、转录机器的主要成分:

RNA聚合酶转录复合物

1、RNA聚合酶的功能：

是转录过程中最关键的酶，主要以双链DNA为模板，以4种核苷三磷酸作为活性前体，并以Mg2+/Mn2+为辅助因子，催化RNA链的起始、延伸和终止，它不需要任何引物，催化生成的产物是与DNA模板链相互补的RNA。

原生物RNA聚合酶的主要特征：

几乎负责所有mRNA、rRNA和tRNA的合成。

转录的起始过程需要全酶，由σ因子辨认起始点，延长过程仅需要核心酶的催化。

真核生物RNA聚合酶的主要特征：

聚合酶中有两个相对分子质量超过1×105的大亚基；同种生物3类聚合酶有“共享”小亚基的倾向，即有几个小亚基是其中3类或2类聚合酶所共有的。

表-真核细胞中三类RNA聚合酶特性比较

酶

细胞内定位

转录产物

相对活性对

α-鹅膏覃碱的敏感程度

RNA聚合酶I

核仁

rRNA

50%-70%

不敏感

RNA聚合酶II

核质

hnRNA

20%-40%

敏感

RNA聚合酶III

核质

tRNA

约10%

存在物种特异性

2、转录复合物：

模板的识别阶段包括RNA聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物（closedcomplex，此时，DNA仍处于双链状态）。

三、启动子与转录起始

1、启动子：

是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性

即位于–10bp处的TATA区和–35bp处的TTGACA区，它们是RNA聚合酶与启动子的结合位点。

上升突变：

TATAAT变成AATAAT就会大大降低其结构基因的转录水平

下降突变：

如果增加Pribnow区的共同序列，将乳糖操纵子的启动子中的TATGTT变成TATATT，就会提高启动子的效率，称为上升突变。

2、增强子：

在SV40的转录单元上发现其转录起始位点上游约200bp处有两段72bp长的重复序列，它们不是启动子的一部分，但能增强或促进转录的起始，因此，称这种能强化转录起始的序列为增强子或强化子（enhancer）。

3.增强子具有下列特点：

远距离效应一般位于上游-200bp处，即使相距>10kb也能发挥作用

无方向性位于上游、下游或内部

顺式调节只调节位于同一染色体上的靶基因无物种和基因特异性

具有组织特异性增强子的效应需特点的蛋白质因子参与

具有相位性作用与DNA构象有关

有的增强子可以对外部信号产生反应

4、原核与真核生物mRNA的特征比较

（1）、原核生物mRNA的特征

1.半衰期短。

2.原核细胞的mRNA（包括病毒）有时可以编码几个多肽，而真核细胞的mRNA最多只能编码一个多肽

3.原核生物mRNA的5’端无帽子结构，3’端没有或只有较短的多聚（A）结构。

4.原核生物常以AUG（有时GUG，甚至UUG）作为起始密码子，而真核生物几乎永远以AUG作为起始密码子

把只编码一个蛋白质的mRNA称为单顺反子mRNA（monocistronicmRNA），把编码多个蛋白质的mRNA称为多顺反子mRNA（polycistronicmRNA）。

多聚（A）是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式，它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。

刚从细胞核进入细胞质时，其多聚（A）尾巴一般比较长，随着mRNA在细胞质内逗留时间延长，多聚（A）逐渐变短消失，mRNA进入降解过程。

（2）、真核生物mRNA的特征

1.真核生物mRNA的5’端存在“帽子”结构。

2.绝大多数真核生物mRNA具有多聚（A）尾巴。

除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3’末端都有多聚（A）序列.

5.模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。

6、原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处有一被称为SD序列

7、基因存在的形式：

四、终止子的类型

1、终止子：

模板DNA上存在终止转录的特殊信号——终止子，又称为内在终止子。

2、类型

a.）不依赖于ρ因子的终止：

ρ因子是一个相对分子质量为2.0×105的六聚体蛋白，它通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离。

b.）依赖于ρ因子的终止

c.）抗终止：

由于不同的生理要求，在转录过程中有时即使遇到终止信号，仍然需要继续转录，于是出现了抗转录终止现象。

3、内含子：

是指存在于原始转录物或基因组DNA中，但不存在于成熟mRNA、rRNA或tRNA中的那部分核苷酸序列

外显子：

是真核生物基因的一部分，它在剪接后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。

4、GU-AG法则：

是指多数细胞核mRNA前体中内含子的5’边界序列为GU，3’边界序列为AG的保守序列模式。

5、内含子的变位剪接：

在个体发育活细胞分化时可以有选择性地越过某些外显子或某个剪接点进行变位剪接，产生出组织或发育阶段特异性mRNA。

6、HnRNA：

由DNA转录生成的原始产物——核不均一RNA，即mRNA前体。

五、RNA的编辑、再编辑和化学修饰

1、RNA的编辑：

是某些RNA，特别是mRNA的一种加工方式，它导致了DNA所编码的遗传信息的改变，因为经过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化。

2、RNA编辑具有重要的生物学意义：

校正作用有些基因在突变过程中丢失的遗传信息可能通过RNA编辑得以恢复

调控翻译通过编辑可以构建或去除起始密码子和终止密码子，是基因表达调控的一种方式

扩充遗传信息能使基因产物获得新的结构和功能，有利于生物的进化

3、RNA的再编码

有研究发现，mRNA在某些情况下不是以固定方式被翻译，而可以改变原来的编码信息，以不同的方式进行翻译，科学上把RNA编码和读码方式的改变称为RNA的再编码（RNArecoding）。

4、RNA的化学修饰

除了RNA的编辑之外，有些RNA，特别是前体rRNA和tRNA，还可能有特异性化学修饰，如甲基化、硫代、去氨基化等。

六、核酶的类型

1、剪切型核酶：

是将自身RNA或异体RNA切除一段特异的核苷酸序列。

它只剪不接。

2、剪接型核酶：

具有序列特异的内切酶，RNA连接酶等多种酶的活性，它既能切割RNA分子，也能通过转酯化反应形成新的磷酸二酯键，连接切割后的RNA分子。

第四章生物信息传递

一遗传密码的性质

1密码的连续性

2.密码的简并性

简并------------由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy），

UAA、UGA和UAG并不代表任何氨基酸，它们是终止密码子，不能与tRNA的反密码子配对，但能被终止因子或释放因子识别，终止肽链的合成。

AUG是起始密码子

同义密码子--------------对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子（synonymouscodon）。

AUG和GUG既是甲硫氨酸及缬氨酸的密码子又是起始密码子。

3密码的通用性与特殊性

遗传密码无论在体内还是体外，也无论是对病毒、细菌、动物还是植物而言都是通用的。

但是也发现极少数例外，体现了遗传密码的特殊性。

4密码子与反密码子的相互作用

tRNA的反密码子在核糖体内是通过碱基的反向配对与mRNA上的密码子相互作用的。

摆动假说

-------------在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，因而使某些tRNA可以识别一个以上的密码子。

一个tRNA究竟能识别多少歌密码子是由反密码子的第一位碱基的性质决定的，反密码子第一位为A或C时，只能识别一种密码子，为G或U时可以识别两种密码子，为Ⅰ时可识别3种密码子。

如果有几个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不同的密码子都对应于各自独立的tRNA。

原核生物中大约有30~45种tRNA,，真核细胞中可能存在50种tRNA

反密码子第一位是C或A时，只能识别一种密码子

反密码子（3’）X-Y-C（5’）（3’）X-Y-A（5’）

密码子（5’）Y-X-G（3’）（5’）Y-X-U（3’）

反密码子第一位是G或U时可以识别两种密码子

反密码子（3’）X-Y-U（5’）（3’）X-Y-G（5’）

密码子（5’）Y-X-A/G（3’）（5’）Y-X-C/U（3’）

反密码子第一位是Ⅰ时可识别3种密码子

反密码子（3’）X-Y-I（5’）

密码子（5’）Y-X-A/U/C（3’）

二、tRNA

1tRNA的功能

转录过程是信息从一种核酸分子（DNA）转移到另一种结构上极为相似的核酸分子（RNA）的过程，信息转移靠的是碱基配对。

翻译阶段遗传信息从mRNA分子转移到结构极不相同的蛋白质分子，信息是以能被翻译成单个氨基酸的三联密码子形式存在的，在这里起作用的是tRNA的解码机制。

只有tRNA上的反密码子能与mRNA上的密码子相互识别并配对，而氨基酸本身不能识别密码子，只有结合到tRNA上生成AA-tRNA，才能被带到mRNA-核糖体复合物上，插入到正在合成的多肽链的适当位置上。

用14C标记的半胱氨酸与tRNACys结合后生成[14C]-半胱氨酸-tRNACys，经Ni（镍）催化可生成[14C]-Ala-tRNACys，再把[14C]-Ala-tRNACys加入到蛋白质合成系统中，发现[14C]-Ala-tRNACys插入了血红蛋白分子中通常由半胱氨酸占据的位置上，表明起识别作用的是tRNA。

2tRNA的种类

1）.起始tRNA和延伸tRNA

起始tRNA------------能特异性识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，

延伸tRNA-----------其他tRNA统称为延伸tRNA

真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸（Met），原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet），Met-tRNAfMet必须首先甲酰化生成fMet-tRNAfMet才能参与蛋白质的生物合成。

2）.同工tRNA

同工tRNA----------将代表相同氨基酸的不同tRNA称为同工tRNA

在一个同工tRNA组内，所有tRNA均专一于相同的氨基酰-tRNA合成酶。

同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被AA-tRNA合成酶识别

3）.校正tRNA

结构基因中某个核苷酸的改变可能产生终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变称为无义突变，而校正tRNA通过改变反密码子区校正无义突变

表4-7大肠杆菌无义突变的校正tRNA

位点

tRNA

野生型

识别密码反密码

校正基因

识别密码反密码

supD

Ser

UCG

←

CGA

UAG

←

CUA

supE

Gln

CAG

←

CUG

UAG

←

CUA

supC

Tyr

UAC

←

GUA

UAG

←

CUA

supG

Lys

AAA

←

UUU

UAA

←

UUA

supU

Trp

UGG

←

CCA

UGA

←

UCA

如某大肠杆菌色氨酸合成酶基因中的一个甘氨酸密码子GGA突变成了AGA（编码精氨酸）,指导合成错误的多肽（错义突变）。

甘氨酸校正tRNA的校正基因突变使其反密码子从CCU变成UCU，它仍然是甘氨酸的反密码子，单不结合GGA而能与突变后的AGA相结合，把甘氨酸放到原来的位置上。

3氨酰-tRNA合成酶（AA-tRNA合成酶）

1）、AA-tRNA合成酶是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶，其反应式如下：

AA+tRNA+ATP→AA-tRNA+AMP+PPi

包括两步反应：

第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸复合物。

AA+ATP+酶（E）→E-AA-AMP+PPi

第二步是氨酰基转移到tRNA3'末端腺苷残基的2'或3'-羟基上。

E-AA-AMP+tRNA→AA-tRNA+E+AMP

2）、AA-tRNA合成酶既要能识别tRNA,又要能识别氨基酸，它对两者都有高度的专一性。

三、核糖体

---------核糖体是由几十种蛋白质和多种核糖体RNA（ribosomalRNA，rRNA）所组成的亚细胞颗粒。

1核糖体的结构

1）核糖体由大小两个亚基组成:

每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA和许多不同的蛋白质分子。

2）核糖体蛋白:

核糖体上有多个活性中心，每个中心都由一组特殊的核糖体蛋白质构成。

3）核糖体RNA:

5SrRNA16SrRNA23SrRNA5.8sRNA18sRNA

4）核糖体由三个tRNA结合位点（重点P125）

氨基酸由氨酰-tRNA运送到核糖体上并通过这个tRNA与携带上一个氨基酸的tRNA的相互作用，将新的氨基酸加到正在生长的新生蛋白质链上。

核糖体上有3个tRNA结合位点，分别称为A、P、E位点。

其中，A位点是新到来的氨酰-tRNA的结合位点；P位点是肽酰-tRNA的结合位点；E位点是延伸过程中的多肽链转移到氨酰-tRNA上释放tRNA的位点，即去氨酰-tRNA通过E位点脱出，被释放到核糖体外的细胞中去。

所以tRNA的移动顺序是从A到P再到E。

由于tRNA的氨酰末端被定位到大亚基上，而另一端的反密码子与结合小亚基的mRNA结合位点都横跨核糖体的两个亚基，位于大小亚基的交界面。

四蛋白质合成的生物学机制

表蛋白质合成各阶段的主要成分简表

阶段

必需组分

1．氨基酸的活化

20种氨基酸

20种氨基酰-tRNA合成酶

20种或更多的tRNAATP，Mg2+

2．肽链的起始

mRNAN-甲酰甲硫氨-tRNA

mRNA上的起始密码子（AUG）

核糖体小亚基核糖体大亚基GTP，Mg2+起始因子（IF-1，IF-2，IF-3）

3．肽链的延伸

功能核糖体（起始复合物）

AA-tRNA伸长因子

GTP，Mg2+肽基转移酶

4．肽链的终止

ATPmRNA上的终止密码子

释放因子（RF-1，RF-2，RF-3）

5．折叠和加工

参与起始氨基酸切除、修饰等加工过程的酶

1氨基酸的活化

2翻译的起始

3肽链的延伸:

1．后续AA-tRNA与核糖体结合2．肽键的生成移位

4肽链的终止

5蛋白质前体的加工:

1、N端fMet或Met的切除2、二硫键的形成3、特定氨基酸的修饰

6蛋白质的折叠

7蛋白质合成抑制剂

二、蛋白质合成过程

翻译过程从阅读框架的5´-AUG开始，按mRNA模板三联体密码的顺序延长肽链，直至终止密码出现。

整个翻译过程可分为：

●起始（initiation）

●延长（elongation）

●终止（termination）

（一）、肽链合成起始

指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物

原核、真核生物各种起始因子的生物功能

起始因子生物功能

原核生物

IF-1

IF-2

IF-3

占据A位防止结合其他RNA;在70S起始复合物生成后促进IF-2的释放。

促进起始RNA与小亚基结合;对30S起始复合物与50S亚基的链接是必须的。

促进大小亚基分离，提高P位对结合起始RNA敏感性.协助30S亚基专一性的识别和选择mRNA起始位点的性质。

真核生物

eIF-4E

eIF-3

eIF-2

eIF-4G