重组人干扰素γ对球后成纤维细胞CD40mRNA表达的阻碍.docx

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重组人干扰素γ对球后成纤维细胞CD40mRNA表达的阻碍

重组人干扰素γ对球后成纤维细胞CD40mRNA表达的阻碍

【关键词】成纤维细胞；,甲状腺相关眼病；,干扰素,重组；,抗原,CD40；,细胞,培育的

　　摘要:

目的探讨在重组人干扰素γ（rhIFNγ）作用下，正常人和甲状腺相关眼病（TAO）患者球后成纤维细胞（RF）CD40mRNA的表达情形。

方式用RTPCR法，对不同浓度rhIFNγ及400U/mLrhIFNγ作用不同时刻诱导体外培育的正常人和TAO患者RFCD40mRNA进行半定量分析。

结果经100，200，400，1000U/mLrhIFNγ作用48h后，正常人和TAO患者RFCD40的光密度比值与各自对照组比较，不同有统计学意义（P＜）；二者同一浓度比较不同无统计学意义（P＞）。

经400U/mLrhIFNγ作用12，24，48，72h后，正常人和TAO患者RFCD40的光密度比值与各自对照组比较不同有统计学意义（P＜），二者同一时刻比较不同无统计学意义（P＞）。

结论正常人和TAO患者RF均表达CD40mRNA。

rhIFNγ可上调正常人和TAO患者RFCD40mRNA的水平，呈浓度和时刻依托。

　　关键词:

成纤维细胞；甲状腺相关眼病；干扰素，重组；抗原，CD40；细胞，培育的

　　ABSTRACT:

ObjectiveToquantifythemRNAexpressionofCD40inducedbyrecombinanthumaninterferongamma（rhIFNγ）inculturedhumanretroocularfibroblast（RF）fromnormalsubjectsandthyriodassociatedophthalmophy（TAO）patients.MethodsHalfquantifyingthemRNAexpressionofCD40inducedbydifferentconcentrationandtimerhIFNγinculturedhumanRFfromnormalsubjectsandTAOpatients.ResultsTheabsorbencyvaluesof100,200,400,1000U/mLrhIFNγinRFfromnormalsubjectsandTAOpatientswereincreasedsignificantlythannegativecontroland50U/mLrhIFNγgroup（P<.Bothnotdifferenceinsameconcentration.Theabsorbencyvaluesof12,24,48,72hof400U/mLrhIFNγinRFfromnormalsubjectsandTAOpatients，showedsignificantlydifferentcomparedwithnegativecontrolgroup（P<，andnodifferenceinsametime.ConclusionsTheculturedhumanRFfromnormalsubjectsandpatientswithTAOallexpressCD40mRNA.TherhIFNγcouldupregulateCD40genemRNAexpressionwithdosedependenceandtimedependentinbothhumanRF.

　　KEYWORDS:

fibroblasts;Graves'disease;

　　甲状腺相关眼病（thyroidassociatedophthalmopathy，TAO）在病理组织学特点性表现为眼眶组织内大量亲水性糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）聚集和免疫活性细胞浸润[1]。

免疫活性细胞产生的炎症介质能上调球后成纤维细胞（retroocularfibroblast，RF）的目的基因，进而改变其生物合成活性，引发TAO的发生、进展，但免疫活性细胞浸润眼眶、免疫活性细胞和RF彼此作用最终激活RF的分子机制尚不明确。

RF与球后浸润的免疫活性细胞可否通过CD40/CD40L共刺激通路而彼此作用，取决于RF是不是表达CD40及球后局部微环境对CD40表达的阻碍；同时组织学证明TAO患者球后组织存在细胞因子γ（interferongamma，IFNγ）[2]。

笔者探讨体外培育的正常人和TAO患者RF是不是有CD40mRNA的表达，同时了解重组人干扰素γ（rhIFNγ）对它们表达的阻碍及二者的不同，探讨TAO发病的可能机制。

　　1材料与方式

　　试剂和仪器

　　RPMI1640，DHanks液，胰蛋白酶，EDTA，青霉素，链霉素（均由中南大学分析测试中心、湘雅医学院中心实验室提供）。

rhIFNγ（美国PeprotechECLTD）。

MTT（美国Sigma公司）。

胎牛血清（武汉丽欣生物公司）。

DMSO（美国Sigma公司）。

Trizol提取液（美国Invitrogen公司）。

DNA100标准物，RTPCR试剂盒，PCR引物，DEPC（北京鼎国生物技术进展中心）。

琼脂糖（北京鼎国生物技术进展中心）。

　　二氧化碳培育箱（BNA321D型，美国ToabaiEspec公司）。

低速离心机（北京医用离心机厂）。

-70℃冰箱（美国Forma公司）。

PCR仪（美国PerkinElmer公司）。

核酸纯度分析仪和低温离心机（美国Beckman公司）。

电泳仪（北京六一仪器厂）。

图像分析仪（美国StratageneEagleeyeⅡ）。

　　方式

　　人RF的原代培育

　　4例TAO患者，均为男性，年龄别离为44，46，52，54岁。

按TAO眼部病变分级（NOSPECS）：

5级2例，6级2例。

患者行眼眶减压术时，取球后结缔组织（患者知情同意）。

正常对照取自眼球萎缩半年内无任何眶内、眼内炎症及TAO表现，行眼球摘除义眼座植入术患者3例，男性1例（50岁），女性2例（43和45岁）；与TAO患者年龄比较不同无统计学意义（P＜）。

在手术进程中取球后结缔组织（患者知情同意）。

　　无菌条件下用含有加抗生素培育基的带盖无菌瓶搜集标本，在超净工作台内进行操作，取标本放入平皿，用无菌眼科剪剪下所需组织，去除上面的脂肪组织及凝血块，用无菌生理盐水反复冲洗，直至无血迹为止；将组织转到另一无菌平皿，并用DHanks液冲洗3次，剪成1mm×1mm×1mm组织小块，将组织小块均匀散布铺于培育瓶的底壁上，加入20%小牛血清的RPMI1640培育基（青霉素10μg/mL、链霉素100μg/mL），使液面刚能盖住组织块而又不致使组织块浮起。

放置于37℃、体积分数为的CO2培育箱中孵育，>48h加培育基，以后每隔2～3d换培育基1次。

原代培育经透射电镜证明为RF。

　　分组

（1）浓度效应：

分成6组，为不含rhIFNγ的10%RPMI1640阴性对照组及含rhIFNγ50，100，200，400，1000U/mL的5组。

孵育48h。

（2）时刻效应：

分成5组，为不含rhIFNγ的10%RPMI1640的阴性对照组，含400U/mLrhIFNγ的10%RPMI1640组，别离孵育12，24，48，72h。

　　一步法半定量RTPCR

　　总RNA的提取

　　取2～6代正常人或TAO患者RF按上述分组培育后，用胰酶消化离心，PBS洗涤后再次离心去上清，搜集细胞。

在含有细胞的Eppendorf管中加入mLTrizol试剂，振荡混匀，室温放置5min。

加氯仿mL，振荡混匀，室温放置10min。

4℃、12000r/min离心15min，警惕吸取上层水相，移入另一Eppendorf管中。

加入等体积的异丙醇，振荡混匀，室温放置10min。

4℃、12000r/min离心10min，弃上清。

冰预冷的75%乙醇漂洗沉淀；4℃、12000r/min离心5min，弃上清。

室温干燥10min，用适量的DEPC处置水溶解沉淀，%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并测定D（260nm）、D（280nm），计算RNA含量和纯度。

　　RTPCR

　　CD40引物ForwardPrimer：

5'CTTCTTCCGACCGTGACATGC3'ReversePrimer：

5'ATGGTTCGTCTGCCTCTGCAG3'

扩增后DNA片段长330bp。

　　GAPDH引物ForwardPrimer：

5'ACCACAGTCCATGCCATCAC3'ReversePrimer：

5'TCCACCACCCTGTTGCTGTA3'

扩增后DNA片段长452bp。

　　RTPCR反映体系及反映条件：

总反映体系为25μL。

模板μL，CD40上游引物μL，CD40下游引物μL，GAPDH上游引物μL，GAPDH下游引物μL，dNTPμL，MgCl2μL，RNAbufferμL，RNaseInhibiterμL，AMVRTaseμL，TaqDNAPolymeraseμL，DEPC水μL。

反映条件：

50℃→30min→94℃→2min；变性94℃→30s→退火58℃→30s→延伸72℃→60s，30个循环；最后延伸72℃5min。

　　琼脂糖凝胶电泳

　　取扩增产物6μL与6×上样缓冲液1μL混合，加样。

在含有mL-1溴化乙锭（EB）的%琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为×TBE溶液，时刻20～30min，电压为5V/cm。

与标准分子量比较，鉴定扩增产物。

　　图像分析

　　PCR产物采纳图像分析仪进行半定量分析，计算单位为积分光密度。

所应用GAPDH的积分光密度作为内对照，得出CD40mRNA表达的相对照值。

本研究以CD40基因表达的相对照值进行统计学分析。

　　统计学处置

　　计量资料用x±s表示，运用SPSSforwindows统计软件包进行方差分析，在此基础上进行单因素组方差分析，两两比较用LSD法查验。

P＜为不同有统计学意义。

　　2结果

　　RNA的提取

　　可见清楚的28S、18S、5S3条带。

各组细胞总RNA的D（260nm）/D（280nm）比值在～，说明提取的总RNA质量好，无明显降解，也无明显的DNA污染，可用于RTPCR等进一步的研究见图1。

　　RTPCR半定量分析

　　CD40浓度效应

　　不同浓度rhIFNγ作用48h对正常人和TAO患者的RFCD40的光密度比值的阻碍见表1和图2。

表1不同浓度重组人干扰素γ作用48hCD40的光密度比值的比较（略）

　　3讨论

　　CD40是相对分子质量为45～50kD的Ⅰ型跨膜蛋白，属于TNFR超家族成员，是B淋巴细胞重要的促有丝割裂受体。

CD40最先发觉于B淋巴细胞表面，但不仅表达于造血系统起源的细胞，而且存在于许多非造血系统起源的细胞如内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞等多种细胞表面[35]。

本实验中采纳GAPDH作为内对照。

因内对照GAPDH与CD40的引物在同一反映体系中一起扩增，因此，不管阻碍PCR扩增产率的哪个因素改变，对两种产物的阻碍是一致的，二者扩增产量的比率在扩增反映中会维持一致。

表2400U/mL重组人干扰素γ作用不同时刻CD40的光密度比值的比较（略）

　　本研究说明，正常人和TAO患者RF均表达CD40mRNA，这与Sempowski等的结果一致[6]。

因此，能够推测RF可能通过CD40mRNA的表达，与眼眶炎症后局部浸润的活化T淋巴细胞可能通过CD40与CD40L共刺激通路彼此作用。

一方面，可能引发更多的免疫细胞的激活；另一方面可能致使RF活化，从而产生TAO的病理组织学改变及典型临床表现。

同时发觉，正常人和TAO患者RF表达CD40mRNA无明显不同。

这可能说明不管正常人或TAO患者RF都可通过CD40接收和转导信号。

与肺、齿龈、滑膜、皮肤、脾等解剖部位RF类似，IFNγ可上调RFCD40mRNA的水平[5]。

本研究结果还显示，rhIFNγ诱导RFCD40mRNA的表达呈时刻和剂量依托性，但正常人和TAO患者RF在同一时刻或同一浓度无明显不同。

而作为免疫作用的效应细胞和靶细胞的RF具有维持组织器官的结构，参与免疫反映，分泌细胞外基质蛋白的功能。

因此，推测CD40关于维持眼眶正常组织功能具有重要意义；而在眼眶炎症微环境中，IFNγ可能上调RF表达CD40，从而可能与眼眶组织内活化的免疫细胞通过CD40与CD40L的彼此作用而激活，通过度泌细胞因子及大量的亲水性GAG，引发TAO的发生与进展。

故CD40/CD40L有可能代表着一个重要的RF活化通路，有可能是TAO分子致病的基础，抑制或阻断IFNγ上调RF表达CD40mRNA可能成为医治TAO提供新的思路。

由于受球后结缔组织、专门是TAO患者的球后结缔组织取材的限制。

由于本研究观看的例数较少，IFNγ和CD40在TAO发病的具体机制有待于进一步的研究。

　　参考文献：

　　[1]HeufelderAE.Pathogenesisofophthalmopathyinautoimmunethyroiddisease[J].RevEndocrMetabDisord,2000,1（12）:

8795.

　　[2]AjjanRA,WeetmanAP.NewunderstandingoftheroleofcytokinesinthepathogenesisofGraves'ophthalmopathy[J].JEndocrinolInvest,2004,27（3）:

237245.

　　[3]WagnerAH,GuldenzophB,LienenlukeB,etal.CD154/CD40mediatedexpressionofCD154inendothelialcells:

consequencesforendothelialcellmonocyteinteraction[J].ArteriosclerThrombVascBiol,2004,24（4）:

715720.

　　[4]DimitriouID,KapsogeorgouEK,MoutsopoulosHM,etal.CD40onsalivaryglandepithelialcells:

highconstitutiveexpressionbyculturedcellsfromSjogren'ssyndromepatientsindicatingtheirintrinsicactivation[J].ClinExpImmunol,2002,127

（2）:

386392.

　　[5]SmithTJ.Insightsintotheroleoffibroblastsinhumanautoimmunediseases[J].ClinExpImmunol,2005,141（3）:

388397.

　　[6]SempowskiGD,RozenblitJ,SmithTJ,etal.HumanorbitalfiboblastsareactivatedthroughCD40toinduceproinflammatorycytokineproduction[J].AmJPhysiol,1998,274:

c707c714.