冈田酸诱导SH.docx
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冈田酸诱导SH
冈田酸诱导SH
刘荣芳,许文芳,许盈,俞昌喜
【关键词】肿瘤抑制蛋白质类;,岗田酸;,tau蛋白质类;,磷酸化;,细胞系;,阿尔茨海默病
摘要:
目的研究冈田酸(OA)诱导SHSY5Y细胞后tau蛋白磷酸化程度和PTEN蛋白水平的转变。
方式40nmol/LOA孵育SHSY5Y细胞不同时刻(0,3,6,12,18,24,36,48h)后,倒置显微镜观看细胞的形态转变,免疫印迹检测各时刻点tau蛋白ser396位点的磷酸化及PTEN蛋白水平的转变。
结果SHSY5Y细胞随OA孵育时刻的延长慢慢显现细胞胞体变圆,突起回缩,悬浮生长至死亡。
细胞tau蛋白ser396位点磷酸化水平于OA作用3h开始升高,18h达顶峰,随后慢慢下降,48h低于基础水平;而PTEN蛋白水平于OA作用3h开始升高,6h达顶峰,以后慢慢下降,18h开始低于基础水平。
结论OA诱导SHSY5Y细胞后tau蛋白磷酸化水平和PTEN蛋白水平均呈先上升后降低的转变趋势。
关键词:
肿瘤抑制蛋白质类;岗田酸;tau蛋白质类;磷酸化;细胞系;阿尔茨海默病
ABSTRACT:
ObjectiveTostudythechangeofPTEN(phosphataseandtensinhomologuedeletedfromchromosome10)proteinintheokadaicacid(OA)inducedoftauproteinhyperphosphorylationinSHSY5Ycells.MethodsSHSY5Ycellsweretreatedwith40nmol/LOAfor0,3,6,12,18,24,36,48h,andthenobservedbyinvertedmicroscope.WesternBlottingwasusedtodetectthelevelsofphosphorylatedtauproteinatsiteSer396andthechangeofPTENinSHSY5Ycells.ResultsCellschangedgraduallyaftertreatedwith40nmol/LOAandappearedtypicalmorphologyofAlzheimer'sdisease(AD).ThelevelsofphosphorylatedtauatsiteSer396wasincreasedafterexposureof3handreachedthemaximumlevelafter18h,thendeclinedtothelevelbelownormalafter48levelsofPTENwasincreasedafterexposureof3handreachedthemaximumlevelafter6h,thendecreasedtothelevelbelownormalafter18h.ConclusionIntheOAinducedoftauproteinhyperphosphorylationinSHSY5Ycells,thelevelsofPTENprotein,showingatrendofdramaticincreaseandthendecreasealso.
KEYWORDS:
tumorsuppressorproteins;okadaicacid;tauproteins;phosphorylation;cellline;Alzhermer'sdisease
阿尔茨海默病(AD)是一种慢性、进行性神经变性疾病。
AD的病因和发病机制尚未完全说明,目前普遍以为tau蛋白的过度磷酸化在增进AD患者神经细胞退行性变性中起着关键作用。
PTEN(phosphataseandtensinhomologuedeletedfromchromosome10)是一种抑癌基因表达的蛋白,是细胞信号转导的重要调控分子,可负调控PI3K/Akt介导的信号转导通路[1]。
PTEN在神经系统中的作用正日趋受到关注[23],但其在AD发生进展中的作用尚不明了。
有报导,通过抑制PI3K/Akt通路可增进AD病变,而激活PI3K/Akt通路那么有对抗β淀粉样蛋白致AD样作用[45]。
PTEN通过降低PIP3水平,拮抗了PI3K/Akt活性[1],因此推测PTEN在AD发生进展中可能存在转变。
新近有报导,AD患者尸身脑内PTEN表达减弱或缺失[67],这与上述相关研究和推测不相吻合。
笔者采纳冈田酸(okadaicacid,OA)诱导SHSY5Y细胞为AD样细胞研究模型,观看实验性AD发生进展进程中SHSY5Y细胞形态、tau蛋白磷酸化及PTEN蛋白水平的动态转变。
1材料与方式
材料
细胞株
人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)。
试剂
OA(美国Sigma公司);DMEM/F12培育液(美国Gibco公司);βactin多克隆抗体、tau[pS396]多克隆抗体、PTEN单克隆抗体、WesternBlot化学发光检测试剂盒(美国SantaCruze公司)。
要紧仪器
CO2培育箱(美国FormaScientific公司);倒置显微镜(CK40型,日本Olympus公司)。
方式
细胞培育
SHSY5Y细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培育液于37℃、体积分数为的CO2培育箱中培育,用%胰蛋白酶消化单层培育细胞,待细胞间隙变得比较明显、细胞突起有所回收时中止消化,DMEM/F12培育液吹打成单个细胞悬浮液,隔3~4d传代1次。
分组
未加OA的SHSY5Y细胞(0,3,6,12,18,24,36,48h)为对照组,OA(40nmol/L)作用SHSY5Y细胞(0,3,6,12,18,24,36,48h)为模型组。
细胞形态观看
SHSY5Y细胞通过处置后,倒置显微镜下观看细胞形态。
蛋白免疫印迹
SHSY5Y细胞通过处置后,弃培育液,用预冷的PBS清洗2次,加入细胞裂解液在冰面上裂解20min,用小刮匙刮下细胞,置于Appendorf管中,12000r/min、4℃离心10min,吸取上清。
Bradford法进行蛋白定量。
10%SDSPAGE电泳(浓缩胶:
恒压80V,电泳约30min;分离胶:
恒压120V,约1h),用湿式转移法转至NC膜,用含5%脱脂奶粉的TBST4℃封锁留宿。
加入用TBST稀释的PTEN单克隆抗体(1∶1000稀释),室温孵育6h。
TBST漂洗后加入抗鼠二抗(1∶2000稀释),室温孵育1h。
化学发光显色,X射线胶片曝光。
抗体洗脱液洗脱抗体(50℃,30min)。
继续用含5%脱脂奶粉的TBST4℃封锁留宿。
加tau[pS396]多克隆抗体(1∶1000稀释),室温孵育6h,TBST漂洗后加入抗兔二抗(1∶4000稀释),室温孵育1h。
化学发光显色,X射线胶片曝光。
以βactin作为内参照,实验重复4次。
半定量分析
采纳条带密度分析法,将模型组各时刻点蛋白条带密度值除以对应的βactin蛋白条带密度值,获各蛋白条带相对密度值,该值除以相应的0h值,获各自的蛋白相对量。
统计学处置
测定值以x±s表示,采纳SPSS统计分析软件包分析。
2结果
OA对SHSY5Y细胞形态的阻碍
OA未孵育时(0h)细胞铺展良好,突起多而粗大,胞体呈多角形或不规那么形。
OA孵育6h后,少量细胞胞体开始变圆,突起回缩;18h后,大部份细胞胞体变圆,突起回缩乃至消失;48h后,多数细胞呈悬浮生长,胞体变圆,突起消失,部份细胞死亡(图1)。
随OA孵育时刻增加,SHSY5Y细胞呈进行性损伤变性。
OA对SHSY5Y细胞tau蛋白磷酸化的阻碍
对照组Ser396位点磷酸化tau蛋白水平在观测时刻点未见转变,模型组Ser396位点磷酸化tau蛋白水平与所得比值见图2。
40nmol/LOA作用于细胞,Ser396位点磷酸化tau蛋白在3h开始升高,18h达顶峰,以后下降,48h低于基础水平,βactin蛋白水平维持不变。
OA可诱导SHSY5Y细胞后tau蛋白磷酸化程度先升高后降低。
PTEN蛋白水平在OA诱导SHSY5Y细胞tau蛋白过度磷酸化中的转变
对照组PTEN蛋白和Ser396位点磷酸化tau蛋白在观测时刻点未见转变;模型组PTEN和Ser396位点磷酸化tau蛋白的转变及所得比值见图2。
40nmol/LOA孵育细胞,Ser396位点磷酸化tau蛋白在3h开始升高,18h达顶峰,以后下降,48h低于基础水平;而PTEN蛋白于3h开始升高,6h达顶峰,以后下降,18h后低于基础水平。
在OA诱导SHSY5Y细胞进程中,PTEN蛋白水平存在着转变,呈急剧上升随后降低的趋势。
3讨论
AD样细胞研究模型的选择
OA是一种蛋白磷酸酶抑制剂,可抑制磷酸酶的活性,使tau蛋白高度磷酸化[8]。
SHSY5Y细胞具有神经元的形态特点,且tau蛋白含量较高,调剂tau蛋白磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶的含量也较高[9]。
体内外实验说明,OA能诱导tau蛋白发生磷酸化,可用于成立研究AD的细胞模型[1012]。
笔者采纳40nmol/LOA作用于SHSY5Y细胞可引发细胞形态的改变,并可诱导tau蛋白磷酸化,与文献报导相吻合[10,13]。
AD样细胞研究模型的发生进展
为便于分析AD发生进展中PTEN蛋白水平的转变,依照细胞形态及磷酸化tau蛋白的改变,笔者试将OA诱导的AD样发生进展进程进行分期。
OA处置SHSY5Y细胞6h形态未见明显改变,但磷酸化tau蛋白于3h开始升高,6h进一步升高,试将此6h时刻点作为反映本实验性AD诱导期;OA处置SHSY5Y细胞18h形态明显改变,且磷酸化tau蛋白达顶峰,现在刻点作为反映实验性AD形成期;OA处置SHSY5Y细胞48h显现明显死亡现象,现在刻点反映实验性AD终末期。
AD样细胞研究模型发生进展中PTEN的转变及其可能机制
PTEN可特异性裂解PI3K的产物PtdIns(3,4,5)P3的D3磷酸基,使其转变成PIP2,从而降低PIP3的水平,对抗PI3K的作用[1]。
PIP3水平的升高可激活丝/苏氨酸激酶Akt,而GSK3β是Akt重要的效应分子。
Akt可磷酸化GSK3βSer9,从而抑制其活性。
GSK3β那么是引发tau蛋白磷酸化重要的蛋白激酶。
由此可见,tau蛋白的磷酸化与PI3K/Akt信号通路抑制有关。
据报导,抑制PI3K/Akt通路可增进AD病变[4],而激活PI3K/Akt通路那么有对抗β淀粉样蛋白致AD样作用[5]。
本研究说明,OA孵育SHSY5Y细胞6h,PTEN显著升高并达顶峰,磷酸化tau蛋白处于上升时期但未达顶峰,推测PTEN蛋白水平升高可能通过抑制PI3K/Akt,增强GSK3β,从而增进tau蛋白过度磷酸化,提示PTEN在AD诱导产生中可能发挥作用。
Griffin等报导,AD患者尸身大脑皮层、海马中PTEN蛋白水平下降[6];Rickle等报导,AD患者尸身大脑内侧颞叶皮质PTEN水平未见显著转变,而PTEN免疫阳性反映锥体细胞数那么显著下降[7]。
笔者观看到,OA孵育细胞18h,即AD形成期,PTEN低于基础水平,而磷酸化tau蛋白显著升高达顶峰,与上述文献报导吻合。
可是,在AD形成期PTEN与磷酸化tau蛋白如何关联,有待进一步探讨。
至于OA孵育细胞48h,即AD终末期,PTEN和tau蛋白磷酸化均低于基础水平,笔者以为与细胞严峻损伤变性有关。
在OA诱导SHSY5Y细胞tau蛋白发生过度磷酸化进程中,PTEN蛋白存在转变,在诱导期急剧上升,提示PTEN在AD诱导产生中可能发挥作用。
可是,PTEN与tau蛋白过度磷酸化的详细关联规律,PTEN在AD发生进展中的作用及其意义有待于进一步探讨。
参考文献:
[1]LeslieNR,DownesCP.PTENfunction:
hownormalcellscontrolitandtumourcellsloseit[J].BiochemJ,2004,382(Pt1):
111.
[2]BackmanSA,StambolicV,SuzukiA,etal.DeletionofPTENinmousebraincausesseizures,ataxiaanddefectsinsomasizeresemblingLhermitteDuclosdisease[J].NatGenet,2001,29(4):
396403.
[3]ShiSH,JanLY,JanYN,etal.HippocampalneuronalpolarityspecifiedbyspatiallylocalizedmPar3/mPar6andPI3kinaseactivity[J].Cell,2003,112:
6375.
[4]BakiL,ShioiJ,WenP,etal.PS1activatesPI3KthusinhibitingGSK3activityandtauoverphosphorylation:
effectsofFADmutations[J].EMBOJ,2004,23(13):
.
[5]WeiW,WangX,KusiakJW.SignalingeventsinamyloidbetapeptideinducedneuronaldeathandinsulinlikegrowthfactorIprotection[J].JBiolChem,2002,277(20):
56.
[6]GriffinRJ,MoloneyA,KelliherM,etal.ActivationofAkt/PKB,increasedphosphorylationofAktsubstratesandlossandaltereddistributionofAktandPTENarefeaturesofAlzheimer'sdiseasepathology[J].JNeurochem,2005,93
(1):
105117.
[7]RickleA,BogdanovicN,VolkmannI,etal.PTENlevelsinAlzheimer'sdiseasemedialtemporalcortex[J].NeurochemInt,2006,48
(2):
114123.
[8]FernandezJJ,CandenasML,SoutoML,etal.Okadaicacid,usefultoolforstudyingcellularprocesses[J].CurrMedChem,2002,9
(2):
229262.
[9]HaqueN,GongCX,SenguptaA,etal.Regulationofmicrotubuleassociatedproteins,proteinkinasesandproteinphosphatasesduringdifferentiationofSY5Ycells[J].BrainResMolBrainRes,2004,129(12):
163170.
[10]KimD,SuJ,CotmanCW.Sequenceofneurodegenerationandaccumulationofphosphorylatedtauinculturedneuronsafterokadaicacidtreatment[J].BrainRes,1999,839
(2):
253262.
[11]LeeJ,HongH,ImJ,etal.TheformationofPHF1andSMI31positivedystrophicneuritesinrathippocampusfollowingacuteinjectionofokadaicacid[J].NeurosciLett,2000,282(12):
4952.
[12]许文芳,吴敏霞,俞昌喜,等.冈田酸诱导SHSY5Y细胞tau蛋白的过度磷酸化[J].福建医科大学学报,2006,40(4):
361365.
[13]褚燕琦,李玮,张兰,等.山茱萸环烯醚苷对蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸拟阿尔茨海默病细胞模型的作用[J].中国药理学通报,2006,22(8):
960963.