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《基因工程》课程实验指导书

《基因工程》课程实验指导书

生物技术专业

黄淑坚黄良宗编写

佛山科学技术学院

2005年12月

前言

基因工程学是以生物化学、分子生物学和分子遗传学等学科为基础而发展起来的一门新兴技术学科，自DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展，并广泛应用于医学、农业、工业、水产、环保等行业。

本实验指导书在在方法上，力求可行性、实用性，内容涵盖基因工程操作的基本过程，整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的实验方法，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。

由于基因工程的发展异常迅速，加之编写人员水平有限，难免有疏漏与错误，敬请各位师生批评指正。

编者

2005年12月

实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）

一、目的和要求

了解反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）基本原理和实验应用，掌握RT-PCR反应的基本技术。

二、实验内容

RT-PCR扩增猪流感病毒M2基因部分片段。

三、仪器、设备和实验准备

1、仪器

恒温水浴槽、移液枪、EP管、PCR管、超净工作台、PCR仪、电泳仪。

2、试剂

反转录酶、RNA酶抑制剂（RNaseInhibitor）、流感病毒RNA、随机引物、流感病毒M2基因PCR引物、dNTP、Taq酶。

3、实验准备

用RNA抽提试剂盒抽提猪流感病毒RNA。

四、实验原理

RT-PCR是将RNA模板的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。

RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。

反转录反应是在反转录酶作用下，以RNA为模板指导合成互补的DNA链的过程。

反转录反应可以使用反转录酶，以随机引物、oligo（dT）或基因特异性的引物（GSP）起始。

PCR（PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应）是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。

它包括三个基本步骤:

（1）变性（Denature）:

目的双链DNA片段在94℃下解链;

（2）退火（Anneal）:

两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对;（3）延伸（Extension）:

在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成，由这三个基本步骤组成多轮循环。

（一）PCR反应中的主要成份：

　　1.引物：

PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。

引物的好坏往往是PCR成败的关键。

引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：

（1）引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。

太长则比较浪费,且难以合成。

（2）引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝4（G+C）+2（A+T）。

（3）四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。

（4）引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。

（5）在引物内,尤其在3'端应不存在二级结构。

（6）两引物之间尤其在3'端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。

两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。

（7）引物5'端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。

（8）引物不与模板结合位点以外的序列互补。

所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量。

一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。

引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。

利用紫外分光光度计,可精确计算引物浓度,在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：

Xmol/L＝OD260/A（16000）+C（70000）+G（12000）+T（9600）

X:

引物摩尔浓度,A、C、G、T:

引物中4种不同碱基个数。

　　2.4种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）：

dNTP应用NaOH将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。

一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。

理论上4种dNTP各20μmol/L,足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。

当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。

4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。

　　3.Mg2+：

Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。

通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。

在PCR反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质,以保证最适Mg2+浓度。

　　4.模板：

PCR反应必须以DNA为模板进行扩增,模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子（线状分子比环状分子的扩增效果稍好）。

就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。

一般反应中的模板数量为102-105个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。

模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。

　　5.TaqDNA聚合酶：

在100μlPCR反应中,1.5-2单位的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环。

所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。

酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低.反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活TaqDNA聚合酶,灭活TaqDNA聚合酶的方法有：

（1）PCR产物经酚:

氯仿抽提,乙醇沉淀。

（2）加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。

（3）99-100℃加热10min。

目前已有直接纯化PCR产物的试剂盒可用。

　　6.反应缓冲液：

反应缓冲液一般含10-50mmol/LTris·Cl（20℃下pH8.3-8.8）,50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+.Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8.50mmol/L的KCl有利于引物的退火。

另外,反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇（DDT）或100μg/ml的牛血清白蛋白（BSA）,它们可稳定酶活性,另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利，各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。

（二）PCR反应参数

　　1.变性：

在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入TaqDNA聚合酶（hotstart）,这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。

变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量。

一般变性温度与时间为94℃1min。

在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。

对于富含GC的序列,可适当提高变性温度，但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。

　　2.退火：

引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度，实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。

一般当引物中GC含量高,长度长并与模板完全配对时,应提高退火温度。

退火温度越高,所得产物的特异性越高。

有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度（例如用94℃和60℃）完成整个扩增循环,既省时间又提高了特异性。

退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。

通常退火温度和时间为37℃-60℃,1-2min。

　　3.延伸：

延伸反应通常为72℃,接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃。

延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。

在一般反应体系中,TaqDNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。

延伸时间过长会导致产物非特异性增加。

但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。

一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间（7-10min）的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。

　　4.循环次数：

当其它参数确定之后,循环次数主要取决于DNA浓度。

一般而言25-30轮循环已经足够。

循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。

通常经25-30轮循环扩增后,反应中TaqDNA聚合酶已经不足,如果此时产物量仍不够,需要进一步扩增,可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板,重新加入各种反应底物进行扩增,这样经60轮循环后,扩增水平可达109-1010。

五、实验步骤

1反转录反应（合成cDNA第一链）

（1）依照所列顺序加入以下试剂以建立一个20µl的反应体系。

（依据RNA的量，反应体积可以增减）：

组分量

MgCl2,25mM*4µl

反转录10X缓冲液2µl

dNTP混合物,10mM2µl

RNasin®核糖核酸酶抑制剂0.5µl

AMV反转录酶（高浓度）15u

上游引物或随机引物*0.5µg

总RNA1µg

加无核酸酶的水至终体积为20µl***

注：

*推荐的MgCl2浓度可根据已知序列进行优化以得到较高产量。

**反转录反应可以利用特异引物、Oligo（dT）15或随机引物随机引物引导。

如果需要由3’Poly（A）区域引导，选用Oligo（dT）15引物；如果需要引导全长RNA，选用随机引物。

当使用cDNA进行克隆及PCR反应时，通常选择Oligo（dT）15引物。

如果cDNA用于RT-PCR,有时随机引物比较合适，特别当PCR引物定位于RNA5’-末端时更是如此,由于猪流感病毒无’Poly（A）结构，本试验不能用Oligo（dT）15引导。

***反应组分的终浓度分别为：

5mMMgCl2,1X反转录缓冲液（10mMTris-HCl[PH9.0,25oC]，50mMKCl,0.1%Triton®X-100），1mM每种dNTP，1u/µl重组RNasin®核糖核酸酶抑制剂，15u/µgAMV反转录酶（高浓度），0.5µgOligo（dT）15引物或随机引物/µgRNA，50ng/µlPoly（A）+mRNA或总RNA。

（2）如果使用Oligo（dT）15引物，将反应体系于42oC温育15分钟。

如果使用随机引物，将反应体系于室温温育10分钟，然后于42oC温育15分钟。

增加的室温温育步骤有利于引物的伸展，使得当温度升高到42oC时引物仍处于杂交状态。

（3）将样品于95oC加热5分钟，然后于0-5oC放置5分钟。

这一步将使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合。

第一链cDNA可用于第二链cDNA的合成、PCR扩增或琼脂糖凝胶分析。

也可以将第一链cDNA存放于-20oC备用。

2PCR反应

（1）用TE缓冲液或无核酸酶的水将第一链cDNA合成反应的体积稀释到100µl。

（2）将下列试剂混合在一起以配制25µl扩增反应体系。

组分量

第一链cDNA反应物（模板）10µl

dNTP混合物,2.5mM4µl

10XPCR缓冲液（含Mg2+）5µl

上游引物20µM1µl

下游引物20µM1µl

TaqDNA聚合酶2单位

加无核酸酶的水至终体积为25µl

（3）将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒,使管壁上液滴沉至管底,加入TaqDNA聚合酶（0.5μl约2.5U），混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。

（4）用94℃变性30秒，55℃退火30秒,72℃延伸30秒,循环30轮,进行PCR。

最后一轮循环结束后,于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。

（5）电泳检测PCR产物，取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。

六、实验注意事项

1、反转录操作过程中，严防RNase污染，应戴手套操作。

2、TRizal试剂有致癌作用，避免皮肤接触。

七、思考

1.降低退火温度对反应有何影响？

2.延长变性时间对反应有何影响？

3.PCR循环次数是否越多越好？

为何？

4.如果出现非特异性带,可能有哪些原因？

实验二DNA目的片段的回收与DNA的体外连接

一、目的和要求

学会从琼脂糖凝胶中回收DNA片断的基本技术，掌握目的DNA与载体连接的操作技术。

二、实验内容

1、从脂糖凝胶中回收酶切DNA目的片断（APPAPXI）。

2、目的DNA片段与载体连接。

三、仪器和实验准备

1、器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉，水漂，恒温水浴槽。

2、试剂

电泳缓冲液，溴化乙锭溶液，电泳级琼脂糖粉，10加样缓冲液，DNA分子量标准，DNA凝胶回收试剂盒。

T载体，pMAL-c2X酶切载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液，无菌ddH2O。

3、实验准备

配制TAE电泳缓冲液（10储存液），1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；1.5ml离心管装入饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。

四、实验原理

DNA酶切片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的DNA片断。

在Mg2+和ATP存在下，T4DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。

五、实验步骤

1.DNA目的片段的回收

（1）用1TAE配制1%琼脂糖凝胶。

（2）在胶上加样孔中加入50μlDNA，电泳。

（3）在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至一个称量过的干净的1.5ml微量离心管中。

再称量后计算出胶的重量。

（4）按照DNA凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收DNA目的片段：

1）SangonUNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒操作步骤：

（1）按400l/100mg凝胶的比例加入BindingBufferII，置于50-60℃水浴中10min，每2min混匀一次，使胶彻底熔化。

（2）将熔化的胶溶液移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min。

（3）8000rpm室温离心1min。

取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液。

（4）将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500lWashSolution，8000rpm室温离心1min。

（5）重复上一步洗涤一次。

（6）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放回到同一个收集管中，12000rpm室温离心1min。

（7）将UNIQ-10柱放入一个新的1.5ml微量离心管中，在柱子膜中央加40lElutionBuffer（或ddwater，pH>7.0），室温或37℃放置2min（55-80℃洗脱效果更好）。

（8）12000rpm室温离心1min，离心管中的液体就是回收产物。

2）华美生物公司的RESINcolumnTM琼脂糖DNA纯化系统操作步骤：

（1）向切割下来的胶块中加入等体积的熔胶剂，65℃水浴5-15min直到胶完全融化。

（2）充分混匀琼脂糖-DNA纯化树脂，抽出0.6ml树脂悬浮液加入到0.2-0.6ml溶胶液中，颠倒4-5次混匀。

（3）抽出注射器活塞，将注射器筒插入微量离心柱，并拧紧。

然后将树脂-DNA混合物加入注射筒，静置1min。

（4）将注射器活塞插入注射器，缓慢用力向下压，排出所有的液体和空气。

（5）从微量离心柱上拔掉整个注射器，抽出活塞，将注射器筒插入微量离心柱，并拧紧。

（6）将2mlI-型柱子清洗液加入注射器。

将注射器活塞插入注射器，缓慢用力向下压，排出所有的液体和空气。

（7）取下微量离心柱，将微量离心柱插入一个新的1.5ml无盖离心管，并拧紧。

（8）向离心柱中加入150ulI-型柱子清洗液，15000rpm室温离心1min。

（9）将微量离心柱插入一个新的1.5ml离心管，并拧紧，向离心柱中加入30-50ulTE或ddwater，静置1min，12000rpm室温离心20s，洗脱DNA。

（10）可取2μl-5μl回收产物电泳，检测是否有目的DNA带。

2.DNA的体外连接

1）PCR产物与T载体直接连接：

（1）取一个灭菌的PCR管，加入：

4lPCR产物混合液

1lT载体

0.5lT4DNA连接酶（TaKaRa,350U/ul）

1l连接酶缓冲液

3.5lddWater

总量10l体系

（2）述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14C水中保温过夜。

（3）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4C冰箱备用。

2）DNA回收片断与载体（pMAL-c2X）连接：

（1）取一个灭菌的PCR管，加入:

4l回收DNA片断

1l酶切后回收的pMAL-c2X载体

0.5lT4DNA连接酶（TaKaRa,350U/ul）

1l连接酶缓冲液

3.5lddH2O

总量10l体系

（2）上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16C干式恒温仪（或PCR仪）中保温过夜。

（3）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4C冰箱备用。

实验三重组DNA的转化

一、目的和要求

学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞，掌握重组DNA转化感受态受体细菌技术。

二、实验内容

三、仪器、设备和实验准备

1、器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml微量离心管，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。

2、试剂

E.coliDH5，E.coliBL21（DE3），LB培养基，0.1mol/LCaCl2溶液，无菌ddWater

3、实验准备

1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基，LB培养基（灭菌），冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液（灭菌），无菌ddWater，摇菌试管（灭菌），三角烧瓶（灭菌）。

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。

四、实验原理

细菌在0CCaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态（感受态）。

质粒DNA粘附在细菌感受态细胞表面，经过42C短时间的热击处理，促进吸收DNA。

然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长，从而得到重组DNA转化菌。

五、实验步骤

1感受态细胞制备

（1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2mlLB（不含抗菌素！

）培养基。

（2）从超低温冰柜中取出DH5菌种和TB1菌种，放置在冰上。

在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2mlLB培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。

（3）取0.5ml上述菌液转接到含有50mLLB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养23h，测定OD590为0.375（<0.40.6，细胞数<108/mL，此为关键参数！

）。

以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。

（4）将菌液分装到1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心10min。

（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。

（6）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用1mL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。

（7）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用200μL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管100L分装到1.5mL离心管中。

可以直接用作转化实验，或立即放入-80℃超低温冰柜中保藏（可存放数月）。

（8）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。

2重组DNA的转化

（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。

（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μL）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴510min。

（3）加入5μL连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。

（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中12min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置35min。

（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入500μLLB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。

（6）在超净工作台中取上述转化混合液100300μL，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：

玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。

（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μL2%X-gal，7μL20%IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

（8）在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

（9）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

（10）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。

注意白色菌斑。

六、实验注意事项

（1）调准转化温度，控制好热冲击时间。

（2）制备Amp平板时，严禁温度过高时加入Amp，防止抗生素失效。

七、思考

（1）制作感受态菌的过程中，应注意那些关键步骤？

（2）CaCl2溶液的作用是什么？

（3）影响转化效率的因素有哪些？

（4）白色菌落出现的原理是什么？

实验四重组DNA的鉴定

一、