志贺氏菌检测.docx
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志贺氏菌检测
志贺氏菌检测【2】
1装备和材料
除微生物实验室常规灭菌及造就装备外,其他装备和材料如下：
1.1恒温造就箱：
36℃±1℃;
1.2冰箱：
2℃～5℃;
1.3膜过滤体系;
1.4厌氧造就装配：
41.5℃±1℃;
1.5电子天平：
感量0.1g;
1.6显微镜：
10×～100×;
1.7均质器;
1.8振荡器;
1.9无菌吸管：
1ml（具0.01ml刻度）.10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头;
1.10无菌均质杯或无菌均质袋：
容量500ml;
1.11无菌造就皿：
直径90mm;
1.12pH计或pH比色管或周详pH试纸;
1.13全主动微生物生化剖断体系.
2造就基和试剂
3.1志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：
见附录中1.
3.2麦康凯（MAC）琼脂：
见附录中2.
3.3木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂：
见附录中3.
3.4三糖铁（TSI）琼脂：
见附录中4.
3.5养分琼脂斜面：
见附录中5.
3.6半固体琼脂：
见附录中6.
3.7葡萄糖铵造就基：
见附录中7.
3.8尿素琼脂：
见附录中8.
3.9β-半乳糖苷酶造就基：
见附录中9.
3.10氨基酸脱羧酶实验造就基：
见附录中10.
3.11糖发酵管：
见附录中11.
3.12西蒙氏柠檬酸盐造就基：
见附录中12.
3.13粘液酸盐造就基：
见附录中13.
3.14蛋白胨水.靛基质试剂：
见附录中14.
3.15志贺氏菌属诊断血清.
3.16生化剖断试剂盒.
4操作步骤
4.1增菌
以无菌操作取检样25g（ml）,参加装有灭菌225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质杯,用扭转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质;或参加装有225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中,用拍击式均质器持续均质1min～2min,液体样品振荡混匀即可.于41.5℃±１℃,厌氧造就16h～20h.
4.2分别
取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色造就基平板上,于36℃±1℃造就20h～24h,不雅察各个平板上发展的菌落形态.宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌.若消失的菌落不典范或菌落较小不易不雅察,则持续造就至48h再进行不雅察.志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特点见表1.
表1志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特点
选择性琼脂平板
志贺氏菌的菌落特点
MAC琼脂
无色至浅粉红色,半透明.滑腻.潮湿.圆形.边缘整洁或不齐
XLD琼脂
粉红色至无色,半透明.滑腻.潮湿.圆形.边缘整洁或不齐
4.3初步生化实验
4.3.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典范或可疑菌落,分别接种TSI.半固体和养分琼脂斜面各一管,置36℃±1℃造就20h～24h,分别不雅察成果.
4.3.2凡是三糖铁琼脂中斜面产碱.底层产酸（发酵葡萄糖,不发酵乳糖,蔗糖）.不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）.不产硫化氢.半固体管中无动力的菌株,挑取其4.3.1中已造就的养分琼脂斜面上发展的菌苔,进行生化实验和血清学分型.
4.4生化实验及附加生化实验
4.4.1生化实验
用4.3.1中已造就的养分琼脂斜面上发展的菌苔,进行生化实验,即β-半乳糖苷酶.尿素.赖氨酸脱羧酶.鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分化实验.除宋内氏志贺氏菌.鲍氏志贺氏菌13型的鸟氨酸阳性;宋内氏菌和痢疾志贺氏菌1型,鲍氏志贺氏菌13型的β-半乳糖苷酶为阳性以外,其余生化实验志贺氏菌属的造就物均为阴性成果.别的因为福氏志贺氏菌6型的生化特点和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌类似,必要时还需加做靛基质.甘露醇.棉子糖.甘油实验,也可做革兰氏染色检讨和氧化酶实验,应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌.生化反响不相符的菌株,即使能与某种志贺氏菌分型血清产生凝聚,仍不得剖断为志贺氏菌属.志贺氏菌属生化特点见表2.
表2志贺氏菌属四个群的生化特点
生化反响
A群：
痢疾志贺氏菌
B群：
福氏志贺氏菌
C群：
鲍氏志贺氏菌
D群：
宋内氏志贺氏菌
β-半乳糖苷酶
－a
－
－a
+
尿素
－
－
－
－
赖氨酸脱羧酶
－
－
－
－
鸟氨酸脱羧酶
－
－
－b
+
水样苷
－
－
－
－
七叶苷
－
－
－
－
靛基质
－/+
（+）
－/+
－
甘露醇
－
+c
+
+
棉子糖
－
+
－
+
甘油
（+）
－
（+）
d
注：
+表示阳性;－表示阴性;－/+表示多半阴性;+/－表示多半阳性;（+）表示迟缓阳性;d表示有不同生化型.
a痢疾志贺1型和鲍氏13型为阳性.
b鲍氏13型为鸟氨酸阳性.
c福氏4型和6型常见甘露醇阴性变种.
4.4.2附加生化实验
因为某些不生动的大肠埃希氏菌（anaerogenicE.coli）.A-D（Alkalescens-Disparbiotypes碱性-异型）菌的部分生化特点与志贺氏菌类似,并能与某种志贺氏菌分型血清产生凝聚;是以前面生化实验相符志贺氏菌属生化特点的造就物还需另加葡萄糖胺.西蒙氏柠檬酸盐.粘液酸盐实验（36℃造就24h～48h）.志贺氏菌属和不生动大肠埃希氏菌.A-D菌的生化特点差别见表3.
表3志贺氏菌属和不生动大肠埃希氏菌.A-D菌的生化特点差别
生化反响
A群：
痢疾志贺氏菌
B群：
福氏志贺氏菌
C群：
鲍氏志贺氏菌
D群：
宋内氏志贺氏菌
大肠埃希氏菌
A-D菌
葡萄糖胺
－
－
－
－
+
+
西蒙氏柠檬酸盐
－
－
－
－
d
d
粘液酸盐
－
－
－
d
+
d
注1：
+表示阳性;－表示阴性;d表示有不同生化型.
注2：
在葡萄糖铵.西蒙氏柠檬酸盐.粘液酸盐实验三项反响中志贺氏菌一般为阴性,而不生动的大肠埃希氏菌.A-D（碱性-异型）菌至少有一项反响为阳性.
4.4.3如选择生化剖断试剂盒或全主动微生物生化剖断体系,可依据4.3.2的初步断定成果,用4.3.1中已造就的养分琼脂斜面上发展的菌苔,应用生化剖断试剂盒或全主动微生物生化剖断体系进行剖断.
4.5血清学剖断
4.5.1抗原的预备
志贺氏菌属没有动力,所以没有鞭毛抗原.志贺氏菌属重要有菌体（O）抗原.菌体O抗原又可分为型和群的特异性抗原.
一般采用1.2%～1.5%琼脂造就物作为玻片凝聚实验用的抗原.
注1：
一些志贺氏菌假如因为K抗原的消失而不消失凝聚反响时,可挑取菌苔于1ml心理盐水做成浓菌液,100℃煮沸15min～60min去除K抗原后再检讨.
注2：
D群志贺氏菌既可能是滑腻型菌株也可能是光滑型菌株,与其他志贺氏菌群抗原不消失交叉反响.与肠杆菌科不同,宋内氏志贺氏菌光滑型菌株不必定会自凝.宋内氏志贺氏菌没有K抗原.
4.5.2凝聚反响
在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域,挑取一环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,在个中一个区域下部加1滴抗血清,在另一区域下部参加1滴心理盐水,作为对比.再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液.将玻片竖直动摇混杂1min,并对着黑色背景进行不雅察,假如抗血清中消失凝聚成块的颗粒,并且心理盐水中没有产生自凝现象,那么凝聚反响为阳性.假如心理盐水中消失凝聚,视作为自凝.这时,应挑取统一造就基上的其他菌落持续进行实验.
假如待测菌的生化特点相符志贺氏菌属生化特点,而其血清学实验为阴性的话,则按4.5.1注1进行实验.
附录造就基和试剂
1志贺氏菌增菌汤-新生霉素（Shigellabroth）
1.1志贺氏菌增菌肉汤
1.1.1成分
胰蛋白胨20.0g
葡萄糖1.0g
磷酸氢二钾2.0g
磷酸二氢钾2.0g
氯化钠5.0g
吐温801.5ml
蒸馏水1000ml
pH7.0±0.2
1.1.2制法
将以上成分混杂加热消融,冷却至25℃阁下校订pH,分装恰当的容器,121℃灭菌15min,掏出后冷却至50℃～55℃,参加除菌过滤的新生霉素溶液（0.5μg/ml）,分装225ml备用.
注：
如不立刻应用,在2℃～8℃前提下可储存一个月.
1.2新生霉素溶液
1.2.1成分
新生霉素25.0mg
蒸馏水1000ml
1.2.2制法
将新生霉素消融于蒸馏水中,用0.22μm过滤膜除菌,如不立刻应用,在2℃～8℃前提下可储存一个月.
1.3临用时每225ml志贺氏菌增菌肉汤（1.1）参加5ml新生霉素溶液（1.2）,混匀.2麦康凯（MAC）琼脂
2.1成分
蛋白胨20.0g
乳糖10.0g
3号胆盐1.5g
氯化钠5.0g
中性红0.03g
结晶紫0.001g
琼脂15.0g
蒸馏水1000ml
pH7.2±0.2
2.2制法
将以上成分混杂加热消融,冷却至25℃阁下校订pH,分装,121℃高压灭菌15min.冷却至45℃～50℃,倾泻平板.
注：
如不立刻应用,在2℃～8℃前提下可储存二周.
3木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂
3.1成分
酵母膏3.0g
L-赖氨酸5.0g
木糖3.75g
乳糖7.5g
蔗糖7.5g
脱氧胆酸钠1.0g
氯化钠5.0g
硫代硫酸钠6.8g
柠檬酸铁铵0.8g
酚红0.08g
琼脂15.0g
蒸馏水1000ml
pH7.4±0.2
3.2制法
除酚红和琼脂外,将其他成分参加400ml蒸馏水中,煮沸消融,校订pH.另将琼脂参加600ml蒸馏水中,煮沸消融.将上述两溶液混杂平均后,再参加指导剂,待冷至50℃～55℃倾泻平皿.
注：
本造就基不须要高压灭菌,在制备进程中不宜过火加热,避免下降其选择性,贮于室温暗处.本造就基宜于当天制备,第二天应用.应用前必须去除平板表面上的水珠,在37℃～55℃温度下,琼脂面向下.平板盖亦向下烘干.别的如设置装备摆设好的造就基不立刻应用,在2℃～8℃前提下可储存二周.
4三塘铁（TSI）琼脂
4.1成分
蛋白胨20.0g
牛肉浸膏5.0g
乳糖10.0g
蔗糖10.0g
葡萄糖1.0g
硫酸亚铁铵（NH4）2Fe（SO4）·6H2O0.2g
氯化钠5.0g
硫代硫酸钠0.2g
酚红0.025g
琼脂12.0g
蒸馏水1000ml
pH7.4±0.2
4.2制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加于400ml蒸馏水中,搅拌平均,静置约10min,加热使完整熔解,冷却至25℃阁下校订pH至7.4±0.2.另将琼脂加于600ml蒸馏水中,静置约10min,加热使完整熔解.将两溶液混杂平均,参加5%酚红水溶液5ml,混匀,分装小号试管,每管约3ml.于121℃灭菌15min,制成高层斜面.冷却后呈桔红色.如不立刻应用,在2℃～8℃前提下可储存一个月.
5养分琼脂斜面
5.1成分
蛋白胨10.0g
牛肉膏3.0g
氯化钠5.0g
琼脂15.0g
蒸馏水1000ml
pH7.0±0.2
5.2制法
将除琼脂以外的各成分消融于蒸馏水内,参加15%氢氧化钠溶液约2ml,冷却至25℃阁下校订pH至7.0±0.2.参加琼脂,加热煮沸,使琼脂熔解.分装小号试管,每管约3ml.于121℃灭菌15min,制成斜面.
注：
如不立刻应用,在2℃～8℃前提下可储存二周.
6半固体琼脂
6.1成分
蛋白胨1.0g
牛肉膏0.3g
氯化钠0.5g
琼脂0.3g～0.7g
蒸馏水100ml
pH7.4±0.2
6.2制法
按以上成分派好,加热消融,校订pH,分装小试管,121℃灭菌15min,竖立凝固备用.
7葡萄糖胺造就基
7.1成分
氯化钠5.0g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2g
磷酸二氢铵1.0g
磷酸氢二钾1.0g
葡萄弹2.0g
琼脂20.0g
0.2%溴麝喷鼻草酚蓝水溶液40.0ml
蒸馏水1000ml
pH6.8±0.2
7.2制法
先将盐类和糖消融于水内,校订pH,再参加琼脂加热消融,然后参加指导剂.混杂平均后分装试管,121℃高压灭菌15min.制成斜面备用.
8尿素琼脂
8.1成分
蛋白胨1.0g
氯化钠5.0g
葡萄糖1.0g
磷酸二氢钾2.0g
0.4%酚红溶液3.0ml
琼脂20.0g
20%尿素溶液100.0ml
蒸馏水1000ml
pH7.2±0.2
将上述成分参加蒸馏水中,煮沸消融,调节pH,分装小试管,121℃高压灭菌15min.
8.2制法
除酚红和尿素外的其他成分加热消融,冷却至25℃阁下校订pH,参加酚红指导剂,混匀,于121℃灭菌15min.冷至约55℃,参加用0.22μm过滤膜除菌后的20%尿素水溶液100ml,混匀,以无菌操作分装灭菌试管,每管约3ml～4ml,制成斜面后放冰箱备用.
8.3实验办法
挑取琼脂造就物接种,在36℃±1℃造就24h,不雅察成果.尿素酶阳性者因为产碱而使造就基变为红色.
9β-半乳糖苷酶造就基
9.1液体法（ONPG法）
9.1.1成分
邻硝基苯β-D-半乳糖苷（ONPG）60.0mg
0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5±0.2）10.0ml
1%蛋白胨水（pH7.5±0.2）30.0ml
9.1.2制法
将ONPG溶于缓冲液内,参加蛋白胨水,以过滤法除菌,分装于10mm×75mm试管内,每管0.5ml,用橡皮塞塞紧.
9.1.3实验办法
自琼脂斜面挑取造就物一满环接种,于36℃±1℃造就1h～3h和24h不雅察成果.如β-D-半乳糖苷酶产生,则于1h～3h变黄色,如无此酶则24h不变色.
9.2平板法（X-Gal法）
9.2.1成分
蛋白胨20.0g
氯化钠3.0g
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）200.0mg
琼脂15.0g
蒸馏水1000ml
pH7.2±0.2
9.2.2制法
将各成分加热煮沸于1L水中,冷却至25℃阁下校订pH,115℃高压灭菌10min.倾泻平板避光冷藏备用.
9.2.3实验办法
挑取琼脂斜面造就物接种于平板,划线和点种均可,于36℃±1℃造就18h～24h不雅察成果.假如β-D-半乳糖苷酶产生,则平板上造就物色彩变蓝色,如无此酶则造就物为无色或不透明色,造就48h～72h后有部分转为淡粉红色.
10氨基酸脱羧酶实验造就基
10.1成分
蛋白胨5.0g
酵母浸膏3.0g
葡萄糖1.0g
1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1.0ml
L型或DL型赖氨酸和鸟氨酸0.5g/100ml或1.0g/100ml
蒸馏水1000ml
pH6.8±0.2
10.2制法
除氨基酸以外的成分加热消融后,分装每瓶100ml,分别参加赖氨酸和鸟氨酸.L-氨基酸按0.5%参加,DL-氨基酸按1%参加,再校订pH至6.8±0.2.对比造就基不加氨基酸.分装于灭菌的小试管内,每管0.5ml,上面滴加一层白腊油,115℃高压灭菌10min.
10.3实验办法
从琼脂斜面上挑取造就物接种,于36℃±1℃造就18h～24h,不雅察成果.氨基酸脱羧酶阳性者因为产碱,造就基应呈紫色.阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使造就基变为黄色.阴性对比管应为黄色,空白对比管为紫色.
11糖发酵管
11.1成分
牛肉膏5.0g
蛋白胨10.0g
氯化钠3.0g
磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2.0g
0.2%溴麝喷鼻草酚蓝溶液12.0ml
蒸馏水1000ml
pH7.4±0.2
11.2制法
11.2.1葡萄糖发酵管按上述成分派好后,按0.5％参加葡萄糖,25℃阁下校订pH,分装于有一个倒置小管的小试管内,121℃高压灭菌15min.
11.2.2其他各类糖发酵管可按上述成分派好后,分装每瓶100ml,121℃高压灭菌15min.另将各类糖类分别配好10％溶液,同时高压灭菌.将5ml糖溶液参加于100ml造就基内,以无菌操作分装小试管.
注：
蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌.
11.3实验办法
从琼脂斜面上挑取小量造就物接种,于36℃±1℃造就,一般2d～3d.迟缓反响需不雅察14d～30d.
12西蒙氏柠檬酸盐造就基
12.1成分
氯化钠5.0g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2g
磷酸二氢铵1.0g
磷酸氢二钾1.0g
柠檬酸钠5.0g
琼脂20g
0.2%溴麝喷鼻草酚蓝溶液40.0ml
蒸馏水1000ml
pH6.8±0.2
12.2制法
先将盐类消融于水内,调至pH,参加琼脂,加热熔解.然后参加指导剂,混杂平均后分装试管,121℃灭菌15min.制成斜面备用.
12.3实验办法
挑取少量琼脂造就物接种,于36℃±1℃造就4d,天天不雅察成果.阳性者斜面上有菌落发展,造就基从绿色转为蓝色.
13粘液酸盐造就基
13.1测试肉汤
13.1.1成分
酪蛋白胨10.0g
溴麝喷鼻草酚蓝溶液0.024g
蒸馏水1000ml
粘液酸10.0g
pH7.4±0.2
13.1.2制法
慢慢参加5N氢氧化钠以消融粘液酸,混匀.其余成分加热消融,参加上述粘液酸,冷却至25℃阁下校订pH至,分装试管,每管约5ml,于121℃高压灭菌10min.
13.2质控肉汤
13.2.1成分
酪蛋白胨10.0g
溴麝喷鼻草酚蓝溶液0.024g
蒸馏水1000ml
pH7.4±0.2
13.2.2制法
所有成分加热消融,冷却至25℃阁下校订pH,分装试管,每管约5ml,于121℃高压灭菌10min.
13.3实验办法
将待测新颖造就物接种测试肉汤和质控肉汤,于36℃±1℃造就48h不雅察成果,肉汤色彩蓝色不变则为阴性成果,黄色或稻草黄色为阳性成果.
14蛋白胨水.靛基质试剂
14.1成分
蛋白胨（或胰蛋白胨）20.0g
氯化钠5.0g
蒸馏水1000mL
pH7.4
14.2制法
按上述成分派制,分装小试管,121℃高压灭菌15min.
注：
此试剂在2℃～8℃前提下可储存一个月.
14.3靛基质试剂
14.3.1柯凡克试剂：
将5g对二甲氨基苯甲醛消融于75ml戊醇中.然后迟缓参加浓盐酸25ml.
14.3.2欧－波试剂：
将1g对二甲氨基苯甲醛消融于95ml95%乙醇内.然后迟缓参加浓盐酸20ml.
14.4实验办法
挑取少量造就物接种,在36℃±1℃造就1d～2d,必要时可造就4d～5d.参加柯凡克试剂约0.5ml,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或参加欧－波试剂约0.5ml,沿管壁流下,笼罩于造就液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色.
注：
蛋白胨中应含有丰硕的色氨酸.每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种剖断后方可应用,此试剂在2℃～8℃前提下可储存一个月.
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