马齿苋黄酮对果蝇唾液腺染色体的影响by叶子.docx
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马齿苋黄酮对果蝇唾液腺染色体的影响by叶子
闽南师范大学
毕业论文
马齿苋黄酮对果蝇唾液腺染色体的影响
TheEffectsofFlavonesofPurslanetoSalivaryGlandChromosomeofDrosophila
姓名：
叶芳美
学号：
101301104
系别：
生物科学与技术学院
专业：
生物科学
年级：
10级
指导教师：
曹芳
2014年05月08日
摘要
用含有马齿苋黄酮0%、1%、2%、3%、4%和5%（体积比）的培养基培养野生型果蝇，将培养获得的三龄幼虫通过唾腺剥离、压片、染色等完整的制片过程探索马齿苋黄酮对果蝇唾液腺染色体的影响。
通过对比，发现同样用改良苯酚品红溶液染色5min,培养基中含有马齿苋黄酮的唾腺染色体臂较伸展，带纹较清晰，说明马齿苋黄酮对果蝇唾腺染色体有影响。
关键词：
马齿苋；黄酮；果蝇；唾液腺染色体
Abstract
ThewildDrosophilacultivatedinthemediumContainingflavonoidswere0%,1%,2%,3%,4%and5%（volumeratio）,makingruleoftemporarychromosomespecimenwasexploredtheflavonoidsfromPortulacaoleraceaeffectsonthesalivaryglandchromosomeofDrosophilathroughoutthecompletecourse.Bycomparison,thestainingeffectofmodifiedphenolfuchsinefor5min,Salivaryglandchromosomearmsinmediumcontainingpurslaneflavoneisstretchingbandswereclear,thisshowsthatflavonoidsfromPortulacaoleraceahaveeffectsonsalivaryglandchromosomeofDrosophila.
Keyword:
Portulacaoleracea;Flavonoid;Drosophila;Salivaryglandchromosome
目录
摘要I
AbstractI
目录I
前言1
1材料与方法1
1.1材料1
1.1.1动植物材料1
1.1.2药品及试剂1
1.1.3仪器1
1.2实验方法2
1.2.1马齿苋黄酮的提取2
1.2.2芦丁标准曲线的绘制2
1.2.3样品测定2
1.2.4果蝇培养基的制备2
1.2.5低温培养三龄幼虫3
1.2.6果蝇唾液腺染色体标本的制备与观察3
1.2.6.1剥离唾液腺3
1.2.6.2染色3
1.2.6.3压片3
1.2.6.4镜检3
2结果与分析3
2.1马齿苋中黄酮含量的测定结果3
2.1.1芦丁标准曲线的绘制3
2.1.2马齿苋中黄酮含量的测定4
2.2完整唾液腺的获得4
2.3不同黄酮浓度的处理效果4
3讨论6
参考文献：
8
致谢9
前言
果蝇是生物学教学和科研中常用的一种模式生物，其幼虫的唾腺细胞的染色体具有以下典型的特征:
（1）染色体螺旋化程度不高。
（2）为多线染色体。
果蝇幼虫的唾腺细胞在发育过程中,细胞核内的DNA虽多次复制,但细胞及核不分裂,复制后的染色单体DNA也不分开,形成的是多线染色体。
（3）同源染色体相互靠拢在一起呈现一种联会状态,使其比一般的体细胞染色体粗大[1]。
目前国内外对果蝇唾腺染色的研究已经有很多，其主要的研究方向是改良果蝇培养基的营养成分、提高唾腺染色体的制片技术及研究不同环境因素（如温度）和物质（如CD）对果蝇唾腺染色体的影响[2,3,4，5]。
其中，根据赫杰等人[5]的研究表明用F-肌动蛋白的抑制剂细胞松弛素D（CD）对果蝇唾腺进行1～5h处理，发现唾腺染色体的形态结构有明显的畸变。
随着CD处理时间的延长，唾腺染色体形态结构的畸变逐渐加剧，表现出松散趋于逐渐扩大，带纹由模糊到消失、胀泡由存在到消失等一系列形态结构的连续变化过程,说明F-肌动蛋白在维持染色体形态结构方面起重要作用。
同时表明，某些物质可以影响果蝇唾腺染色体的形态结构。
根据果蝇唾腺染色体的特征及综合专家的各种研究，在本文中我研究马齿苋黄酮对果蝇唾液腺染色体的影响，这方面目前还没有做过。
之所以选择马齿苋的黄酮是因为马齿苋黄酮类化合物的生理活性多种多样，具有降低血管脆性及异常的通透性、降血脂、降血压、抑制血小板聚集及血栓形成、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用[6]，已有学者对马齿苋黄酮的抗氧化性进行了专门的研究，并测定了马齿苋黄酮的体外抗氧化活性[7]。
通过本次试验将期待发现黄酮对果蝇唾腺染色体的影响。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动植物材料
野生型果蝇（野外采集），雌雄数量均等；马齿苋粉末（自己制备）
1.1.2药品及试剂
芦丁、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、玉米粉、蔗糖、琼脂、酵母粉、蒸馏水、丙酸、0.9%生理盐水、改良苯酚品红染液
1.1.3仪器
分光光度计、循环水式多用真空泵、微波炉、分析天平、电热恒温鼓风干燥箱、恒温水浴锅、双筒解剖镜、广口瓶、解剖针、标签、天平、量筒、棉花、纱布、玻璃棒、电炉、烧杯、解剖镜、吸水纸等
1.2实验方法
1.2.1马齿苋黄酮的提取
将马齿苋茎叶洗净，晾干，并于6O℃恒温干燥，取出后粉碎，将其过60目筛。
精密称取马齿苋样品20g，置1000mL锥形瓶中，按料液比1:
20加入70％的乙醇溶液，于微波功率600W下加热5min，然后置70℃、100W恒温水浴中超声提取5min，滤过，同法提取2次[7，8]，合并所得滤液1200ml，水浴加热浓缩至120ml,放冰箱中备用。
1.2.2芦丁标准曲线的绘制
准确称取芦丁对照品20mg，置于100ml容量瓶中，加入体积分数70%乙醇溶解至刻度，摇匀即得0.2mg/ml的对照品溶液。
精密吸取0.2mg/ml的标准溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4ml，分别置于10ml具塞刻度试管中，加5%NaNO20.4ml，摇匀，静置6min，再加入10%硝酸铝0.4ml，摇匀，静置6min，再加4.3%NaOH4.0ml，最后加入体积分数70%乙醇定容至刻度线10ml，充分摇匀，静置15min，得0.008、0.016、0.024、0.032、0.040和0.048mg/ml系列标准溶液。
取标准液放入比色杯中,进行全波长扫描，在510nm处有最大吸收波长，以试剂作空白参比，（不加芦丁对照品溶液）测定各浓度标准品溶液的吸光度[9]。
以芦丁浓度x（mg/ml）为横坐标，吸光度y为纵坐标制作标准曲线，得回归方程，并求其相关系数。
1.2.3样品测定
准确吸取10倍稀释后的样品提取液1ml，置于10ml具塞试管中，加质量分数5%NaNO20.4ml，然后按与标准曲线相同的方法显色，测定其吸光度。
根据芦丁标准溶液的浓度与吸光度的关系曲线的回归方程式计算马齿苋中总黄酮含量。
1.2.4果蝇培养基的制备
1、对照组培养基的制备：
（1）按配方称量好各种成分（如表1）；
（2）用2/3的水把琼脂调匀，加热溶化，再把红糖加入溶解，用剩余的1/3水把玉米粉调成糊状，倒入上液中，不断搅拌，继续煮沸至黏稠均匀为止，最后倒入丙酸搅拌均匀；
（3）待培养基稍凉，分装三瓶，每个广口瓶倒入30ml左右的培养基，冷却后加入少量酵母粉[10]；
2、实验组培养基的制备：
在100ml对照培养基未冷却的基础上分别加入黄酮溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml，获得浓度黄酮分别为1%、2%、3%、4%和5%（ml/100ml）的实验组培养基，同样分装三瓶，加入适量酵母，得到三组平行实验组。
表1培养基成分表
水
琼脂
红糖
玉米粉
丙酸
100ml
1.875g
16.25g
12.5g
0.5ml
1.2.5低温培养三龄幼虫
将10对左右果蝇放入培养瓶中，在16～18℃的稍低温度条件下培养。
接种12～18h后,将成虫移出,控制成虫的排卵持续时间,以免产生过多的卵（要求每cm2培养基表面有20～40只幼虫）。
一龄幼虫出现后,每天在培养基表面滴加2%～4.5%的酵母液或鲜酵母。
2～3龄幼虫应滴加10%左右的酵母液,滴加的量以覆盖在培养基表面薄薄一层为宜。
使其在生长过程中充分地发育和吸取营养物质,达到育肥的目的,时间大约14d左右。
这样的三龄幼虫易解剖出唾腺,可以获得染色体分散良好的制片[1]。
1.2.6果蝇唾液腺染色体标本的制备与观察
1.2.6.1剥离唾液腺
在一干净的载玻片上滴一滴生理盐水，选择行动迟缓、肥大、爬在瓶壁上即将化蛹的三龄幼虫，或者选择经低温处理的果蝇三龄幼虫置于载玻片上。
每只手各持一个解剖针，在解剖镜下进行操作。
由于果蝇的唾腺位于幼虫体前1/3-1/4处，所以左手持解剖针按压住虫体后端三分之一的部位，固定幼虫，右手持解剖针扎住幼虫头部口器部位，适当用力向右拉唾腺腺体随之而出。
唾腺是一对透明的棒状腺体，外有白色的脂肪组织（不透明）。
去除幼虫其它组织部分，并把唾腺周围的白色脂肪剥离干净[11]。
1.2.6.2染色
滴加一滴改良苯酚品红染液，染色5min。
1.2.6.3压片
染色完成后，盖上干净的盖片，并覆一层滤纸。
将片子放在实验台上，用大拇指用力压住，并横向揉几次。
（注意不要使盖片移动，用力和揉动是一个方向，不能来回揉。
）
1.2.6.4镜检
先在低倍镜下观察，寻找染色体分散好的图像，再换高倍镜观察，用显微摄影拍片保存。
2结果与分析
2.1马齿苋中黄酮含量的测定结果
2.1.1芦丁标准曲线的绘制
以芦丁浓度x（mg/ml）为横坐标，吸光度y为纵坐标制作标准曲线，得回归方程为y=11.714x-0.0003,R=0.9971。
如图1：
图1芦丁标准品浓度与吸光度回归关系图
2.1.2马齿苋中黄酮含量的测定
稀释10倍的黄酮溶液的吸光度为0.23A，根据吸光度（y）与芦丁溶液浓度（x）的线性方程为y=11.714x-0.0003,此黄酮溶液的浓度为：
0.02mg/ml,那么总黄酮提取液的浓度为0.2mg/ml。
2.2完整唾液腺的获得
按照上文1.2.6.1剖离唾液腺的方法，获得一对透明囊状结构，上小下大，附着不透明的带状脂肪的果蝇唾液腺，如图2：
图2果蝇唾液腺
2.3不同黄酮浓度的处理效果
在果蝇唾腺染色体的压片标本中观察到唾腺染色体有5条臂，各条臂上均显示出数目和位置比较恒定的界标，如带纹、胀泡和缢缩等，对照组（培养基不含马齿苋黄酮）图片可以看出果蝇唾腺染色体形态正常，结构完整，带纹清晰，但染色体臂收缩缠绕，伸展不充分（图3、图4）。
用加不同马齿苋黄酮含的培养基量培养获得的唾腺染色体与对照组相比，除了具备形态正常，结构完整，带纹清晰等特点外，还表现出染色体臂较为伸展的特点。
但是通过实验组的对比，发现这种趋势并不随黄酮含量的增加而加剧（图5～图14）。
有些黄酮含量为1%，但染色体是疏松程度却比黄酮含量为2%的好（图6、图7）。
经过对比黄酮含量为3%、4%与5%的染色体疏松程度相当（图9、图11、图14）。
a
b
图4对照组（不含黄酮）
a
b
图61%黄酮
图72%黄酮
图82%黄酮
图93%黄酮
图103%黄酮
图114%黄酮
图124%黄酮
图135%黄酮
图145%黄酮
3讨论
马齿苋为马齿苋科马齿苋属的植物，古人称其为“长寿菜”，是一种传统的药食同源的野生植物，具有清热解毒、凉血止血的功效。
马齿苋黄酮具有降低血管脆性及异常的通透性、降血脂、降血压、抑制血小板聚集及血栓形成、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用，以其的氧化作用研究最多，大量试验和研究表明，黄酮可以有效地清除体内过剩的活性氧自由基，保护细胞和线粒体的正常结构和功能，防止脂质过氧化的发生[12]。
此外，生物体内的含氧自由基包括超氧阴离子自由基（O2一·）、羟基自由基（·OH）和脂质过氧化自由基（RO0·）[13]，此类自由基可与体内的核酸、蛋白质等生物大分子相互作用，从而对后者产生毒害作用[14]。
果蝇幼虫的唾腺细胞在发育过程中，细胞核内的DNA多次复制，但细胞、细胞核不分裂，复制后的染色单体DNA也不分开，形成了多线染色体，这就需要完整的细胞结构和线粒体的正常功能。
这些理论依据可以说明马齿苋黄酮为果蝇唾腺染色体发育形成提供了正常的细胞结构和线粒体功能及清除过剩的活性氧自由基。
本文采用含马齿苋黄酮的培养基培养果蝇，观察唾腺染色体形态较为伸展，进一步说明马齿苋黄酮对果蝇唾腺染色体的发育发挥重要的作用。
值得指出的是，本文结果显示了马齿苋黄酮含量为1%～5%（ml/100ml）对唾腺染色体的影响没有显著差异，但是有研究表明马齿苋黄酮具有清除羟自由基的作用是随着黄酮浓度的增加,对羟自由基的清除作用增强,呈明显的量效关系[7]。
那为什么本实验中不是随着黄酮含量的增加，对唾腺染色体影响效果越明显呢？
难道是因为所加黄酮量过少引起的吗？
我们可以将本实验多用含量设为低浓度，再增加中浓度和高浓度做进一步的研究。
参考文献：
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致谢
四年的读书生活在这个季节即将划上一个句号，而于我的人生却只是一个逗号，我将面对又一次征程的开始。
四年的求学生涯在师长、亲友的大力支持下，走得辛苦却也收获满囊，在论文即将付梓之际，思绪万千，心情久久不能平静。
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您治学严谨，学识渊博，思想深邃，视野雄阔，为我营造了一种良好的精神氛围。
授人以鱼不如授人以渔，置身其间，耳濡目染，潜移默化，使我不仅接受了全新的思想观念，树立了宏伟的学术目标，领会了基本的思考方式，从论文题目的选定到论文写作的指导,经由您悉心的点拨,再经思考后的领悟,常常让我有“山重水复疑无路,柳暗花明又一村”。
感谢我的爸爸妈妈，焉得谖草，言树之背，养育之恩，无以回报，你们永远健康快乐是我最大的心愿。
在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚谢意！
同时也感谢学院为我提供良好的做毕业设计的环境。
最后再一次感谢所有在毕业设计中曾经帮助过我的良师益友和同学，以及在设计中被我引用或参考的论著的作者。
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