12基因工程的基本操作程序.docx

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12基因工程的基本操作程序

1.2基因工程的基本操作程序—问题导读

使用时间：

02月21日-02月27日

学习目标

1、简述基因工程原理及基本操作程序。

2、尝试设计某一转基因生物的研制过程。

学习重难点：

学习重点：

基因工程基本操作程序的四个步骤。

学习难点：

（1）从基因文库中获取目的基因。

（2）利用PCR技术扩增目的基因。

知识链接

1．叙述DNA重组技术操作的三种工具的作用？

2．作为载体应该具备哪些条件？

最常用的运载体是什么？

自主学习（理知识，固基础）

基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：

　            　、　                 、           　、　               　。

学点一、目的基因的获取：

1．目的基因：

符合人们需要的，编码蛋白质的    。

也可以是一些具有     的因子。

2．获取目的基因的方法

（1）从基因文库中获取目的基因

①基因文库：

将含有某种生物不同基因的许多         ，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。

②种类

基因组文库：

含有一种生物的      基因。

部分基因文库：

含有一种生物的         基因，如cDNA文库。

③目的基因的获取依据：

根据基因的有关信息：

基因的       序列、基因在      上的位置、基因的      产物mRNA、基因的翻译产物蛋白质等特性获取目的基因。

（2）利用PCR技术扩增目的基因。

①PCR含义：

是一项在生物体外      特定DNA片段的核酸合成技术。

②PCR原理：

DNA        。

③条件：

有一段已知目的基因的     序列，以便根据这一序列合成       。

④过程：

目的基因DNA受热形成         ，与       结合，然后在_____     ____的作用下进行延伸形成DNA。

⑤方式：

每次循环后目的基因的量增加一倍，即成      扩增=2n（n为扩增循环的次数）。

（3）人工合成法：

如果       ，       已知，可以通过           用化学方法人工合

成。

学点二、基因表达载体的构建──基因工程的核心

1表达载体的组成：

         +        +        +         等。

2．启动子：

位于基因的       ，它是          和结合的部位，驱动基因转录产生mRNA，最终获得所需的      。

的部位，驱动基因转录产生mRNA，最终获得所需的      。

3．终止子：

也是一段有特殊结构的       ，位于基因的          ，终止    。

4．标记基因：

鉴别受体细胞是否含有目的基因，从而将             筛选出来。

常用的标记基因是         。

5．表达载体的功能：

使目的基因在受体细胞中      ，并且       给下一代；同时使目的基因能够_     __和        作用。

6．不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建上也会有所差别。

学点三、将目的基因导入受体细胞

（一）转化的概念：

目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内        和        过程。

（二）常用的转化方法：

1．将目的基因导入植物细胞

（1）农杆菌转化法

①农杆菌特点：

易感染     植物和裸子植物，对_______植物没有感染力；Ti质粒的       可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。

②转化过程：

目的基因插人     

农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。

（2）基因枪法

基因枪法：

是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。

 （3）花粉管通道法

花粉管通道法：

这是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法（我的的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的）。

植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。

花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

2．将目的基因导入动物细胞

（1）方法：

显微注射技术。

（2）操作程序：

目的基因表达载体        →取卵（受精卵）→显微注射→注射了目的基因的受精卵移植到____性动物的_____  __内发育→新性状动物。

3．将目的基因导入微生物细胞

（1）原核生物特点：

          、多为        、              相对较少等。

（2）大肠杆菌最常用的转化方法是：

      处理细胞→       细胞→表达载体与感受态细胞混合→_____细胞吸收DNA分子。

学点四、目的基因的检测与鉴定

1．检测

①．首先要检测                          ，方法是采用                          。

②其次还要检测                          ，方法是采用                         。

③最后检测                             ，方法是从转基因生物中提取              ，用相应的                   进行                 。

2．鉴定：

进行                  的鉴定。

如                                   。

1.2基因工程的基本操作程序—课堂导学

一、基因工程的基本操作程序的四个主要步骤：

目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定

基因组文库

二、目的基因的获取

原理

部分基因文库

基因文库

从基因文库中获取目的基因

1目的基因的定义

前提

利用PCR技术扩增目的基因

2获取目的基因的方法

反转录法

过程

化学合成法

人工合成法

练习1．以重组DNA技术为核心的基因工程正在改变着人类生活，请回答下列问题。

（1）获得目的基因的方法通常包括        、         和         。

（2）构建基因文库时需要对DNA分子进行切割和连接所使用的酶分别是       和     。

（3）PCR扩增目的基因的原理是          ，前提条件是         ，PCR所使用的酶是      ，该酶具有什么特点？

                      。

（4）运送目的基因进入受体细胞的载体一般选用病毒或       ，后者的形状呈      。

（5）若目的基因是人的胰岛素基因，则获取的可能方法有               ，将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与酵母菌，从两者中生产的胰岛素在功能和     序列上是相同的。

解析：

本题主要考查目的基因获取的方法。

获取目的基因的方法有从基因文库中获取，PCR技术扩增目的基因和人工合成，其中基因文库包括基因组文库和部分基因文库。

构建基因文库需用限制酶切割某生物的DNA获取DNA片段，并与载体连接，导入受体菌群进行储存，所以还需用到DNA连接酶。

PCR技术是生物体外扩增DNA片段，原理是DNA双链复制，前提条件是有一小段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据其合成引物。

PCR技术用到DNA聚合酶，该酶必须在70-75℃条件下发挥作用，故必须耐高温。

运送目的基因的载体有质粒和病毒，质粒为小型环状DNA分子。

人胰岛素基因序列已知，所以可用逆转录法构建部分基因文库，可直接人工合成，也可用PCR技术扩增获得大量目的基因，将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与酵母菌，从两者中生产的胰岛素在功能和氨基酸序列上是相同的。

三、基因表达载体的构建

一个基因表达载体的组成：

目的基因+启动子+终止子+标记基因

2．组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造。

下图是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图（示部分基因及部分限制性内切酶作用位点），据图分析：

①人工改造时，要使抗虫基因表达，还应插入________。

②人工改造时用限制酶Ⅱ处理，其目的是：

第一，去除质粒上的________基因，保证T－DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长；第二，使质粒带有单一限制酶作用位点，有利于________________。

第三，使质粒大小合适，可以提高转化效率等。

③若用限制酶Ⅰ分别切割改造过的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子，并构成重组Ti质粒。

分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的现象是________________________________。

解析：

①基因表达载体的组成包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA最终获得所需要的蛋白质。

②tmr和tms分别是编码产物控制合成细胞分裂素和编码产物控制合成吲哚乙酸的基因，用限制酶可将tet→tmr之间的片段切除，因此T－DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长。

③改造过的理想质粒已经由限制酶Ⅱ将四环素抗性基因破坏，因此在含四环素的培养基中不能生长，而限制酶Ⅱ和限制酶Ⅰ都没有破坏卡那霉素和新霉素抗性基因，因此在含卡那霉素的培养基上能够生长。

四、将目的基因导入受体细胞

农杆菌转化法

1转化的定义

基因枪法

2将目的基因导入植物细胞

花粉管通道法

3将目的基因导入动物细胞—显微注射技术

4将目的基因导入微生物细胞

a原核生物特点

b感受态细胞

练习2．基因工程有广阔的应用前景。

回答下列各题：

（1）获取目的基因后，短期内要得到大量目的目的基因，可利用__________扩增。

（2）构建基因表达载体的过程要使用的工具酶有___________。

（3）受体种类不同，导入方法不同。

选育优良动物，目的基因导入的常用方法是__________；选育优良植物，目的基因导入采用最多的方法是_______。

目的基因进入动植物细胞并且在受体细胞维持稳定和表达的过程，称为________________。

（4）检测目的基因在转基因生物中是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物的体细胞中提取蛋白质，用相应的抗体进行________杂交，看是否有杂交带。

解析：

短期内要得到大量的基因可利用PCR技术扩增；构建基因表达载体需要切割目的基因和运载体，还需要将目的基因和运载体连接起来，培育转基因动物用显微注射法，目的基因导入植物常用农杆菌转化法；检测是否翻译成蛋白质应用抗原－抗体杂交法。

DNA分子杂交技术

转基因生物DNA上

是否插入目的基因

五、目的基因的检测与鉴定

分子杂交技术

目的基因是否转

录出信使RNA

目的基因的检测与鉴定

抗原-抗体杂交

目的基因是否翻译成蛋白质

练习3．苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞是否已表达，其检测方法是（   ）

A．是否有抗生素抗性　　　B．是否能检测到标记基因

　　C．是否有相应的性状　　　D．是否能分离到目的基因

课上基础训练

1．正确表示基因工程顺序操作的四个步骤的是   （   ）

A．获取目的基因→将目的基因导入受体细胞→基因表达载体的构建→目的基因的检测与鉴定

B．目的基因的检测与鉴定→获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞

C．获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定

D．基因表达载体的构建→获取目的基因→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定

2．PCR技术扩增DNA，需要的条件是（　　）

①目的基因　②ATP　③四种脱氧核苷酸　④DNA聚合酶等　⑤mRNA　⑥核糖体

A．①②③④  B．②③④⑤C．①③④⑤      D．①②③⑥

3．下列关于基因表达载体构建的相关叙述，不正确的是（　　）

A．需要限制酶和DNA连接酶B．必须在细胞内进行

C．抗生素抗性基因可作为标记基因D．启动子位于基因的首端

4．科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。

起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。

然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子（抗虫基因首端），导人棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。

科学家又在有启动子、抗虫基的质粒中插入终止子（抗虫基因末端），导入棉花受精卵，结果长成的植株，有了抗虫能力。

由以上过程推知，作为目的基因的运载体应其备的结构是（）

A．目的基因、启动子B．目的基因、终止子

C．目的基因、启动子、终止子D．目的基因、启动子、终止子、标记基因

课后拓展训练

★1．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是（   ）

A．结构简单，操作方便B．繁殖速度快

C．遗传物质含量少、简单D．性状稳定,变异少

★2．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。

下列属于目的基因检测和鉴定的是（　　）

 ①检测受体细胞是否有目的基因　②检测受体细胞是否有致病基因　③检测目的基因是否转录mRNA　④检测目的基因是否翻译蛋白质

A．①②③　B．②③④　C．①③④　D．①②④

★3．根据基因工程的有关内容在下列横线上填写适当的文字。

A_______________B_______________　　C_______________D_______________

E_______________F_______________　G_______________H________________

★4．已知SARS是由一种RNA病毒感染所引起的疾病。

SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。

某研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗，开展了前期研究工作。

其简要的操作流程如下：

（1）实验步骤①所代表的反应过程是________________。

（2）步骤②构建重组表达载体A和B必须使用的酶______________________

（3）如果省略步骤②而将大量扩增的S基因直接导入大肠杆菌，一般情况下，不能得到表达的S蛋白，其原因是S基因在大肠杆菌中不能________，也不能________。

（4）为了检验步骤④所表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特征，可用________与________进行抗原—抗体特异性反应实验，从而得出结论。

（5）步骤④和⑥的结果相比，原核细胞表达的S蛋白与真核细胞表达的S蛋白的氨基酸序列________（填“相同”或“不同”），根本原因是________________________。

★★5．图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。

已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在

内的多种酶的酶切位点。

据图回答：

（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别

用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_______________、_______________、_______________三种。

若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行_______________。

（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。

之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是______________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_______________。

（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是___________，其合成的产物是_______。

（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_______________。

★★6．科学家通过基因工程方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株──抗虫棉。

其过程大致如图所示：

（1）进行基因工程操作的工具酶有                  ，将苏云金芽孢杆菌的Bt基因导入棉花细胞内，使棉花植株产生抗虫性状，引起这种新性状产生依赖于         。

细菌的基因之所以能在棉花细胞内表达，产生抗性，其原因是____________________________________。

（2）基因工程的操作程序主要包括的四个步骤是_______________________________________，其核心步骤是________，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以________给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

 （3）上述过程中，将目的基因导入棉花细胞内使用的方法是________，这种导入方法较经济、有效。

目的基因能否在棉株体内稳定维持和表达其遗传特性的关键是目的基因是否插入到受体细胞染色体DNA上，这需要通过检测才能知道，检测采用的最好方法是________。

 （4）Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T-DNA，把目的基因插入Ti质粒的T-DNA中是利用T-DNA的________________________________特点。

含有Bt基因的Ti质粒导入棉花细胞是否可以稳定维持和表达其遗传特性，必须进行检测与鉴定。

检测目的基因是否导入成功可以检测Bt基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的            。

检测方法是                                                       。

（5）抗虫棉的培育过程中，抗虫基因的受体细胞可以是棉花的一般体细胞，原因是                。

最后检验培育的棉花是否抗虫，常用的方法是                             。