肿瘤学研究报告常用实验技术及方法.docx

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肿瘤学研究报告常用实验技术及方法

肿瘤学研究常用实验技术及方法复习题

1.表观遗传的科学涵

三个特点？

a）基因功能完全、稳定地丧失，有遗传性；

b）细胞外环境长期作用的结果，有可逆性；

c）分析方法灵敏，可检出少数细胞的变化

2.变性高效液相色谱（DHPLC）技术在肿瘤研究中的应用

DHPLC的主要应用？

SeparationofDNA,MSI,LOH,STRs,Q-PCR,detectionofmutation,SNPs,oligos,RNA.

3.蛋白质分离纯化及鉴定

i.分离纯化蛋白质的方法有哪些？

盐析，透析，离心，凝胶过滤（分子筛）层析，离子交换层析，亲和层析，高效液相层析。

ii.等电聚焦电泳（IEF）与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）有何不同？

等电聚焦电泳：

利用蛋白质分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。

⏹SDS-PAGE:

蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷的差异。

在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷量无关

iii.两种等电点相近的，分子量相差较大的蛋白质应该首选那种分离方法？

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

iv.蛋白质印迹（WesternBlotting）过程中应注意的事项有哪些？

1.丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时一定要注意防护。

2.制备聚丙烯酰胺凝胶时，小心防止凝胶渗漏。

3.蛋白加样量要合适，加样量太小，条带不清晰，加样量太大，则泳道超载，条带过宽而重叠，甚至覆盖至相邻泳道。

4.对多种蛋白质而言，电流大则电泳条带清晰，但电流过大，玻璃板会因受热而破裂，故适合的电流为玻璃板微热。

5.胶转膜后应在膜上标记好正反面及电泳方向。

6.电转移时应注意勿将滤膜和胶的位置放反，而且滤纸、滤膜和胶应等大，以免短路。

4.组织培养/基因的克隆、转化与表达

i.请列举至少3种流式细胞仪的用途?

1.定量检测细胞膜、细胞质和细胞核中的各种细胞成分

2.研究细胞的各种功能状态（细胞增殖，细胞凋亡、细胞分化、酶活性、细胞膜通透性、氧化还原状态、吞噬性等）。

3.定量检测血清中的各种可溶性生物分子成分

临床中应用：

1.白血病和淋巴瘤的免疫分型

2.肿瘤的细胞周期和倍体分析

3.细胞移植的交叉配型

4.免疫状态监测

5.干细胞分析

6.治疗效果监测

ii.影响细胞培养成功与否的因素有哪些？

1.组织和细胞供体的种类及年龄

2.培养条件：

培养基血清（经验法、试验法）

3.贴附底物：

4.培养方法：

消化方法

iii.列举常见的细胞培养的污染

1.微生物：

真菌、细菌、支原体和病毒

2.化学物：

3.细胞

iv.在基因克隆中常用的酶类都有哪些？

各有什么作用？

限制型切酶（RestrictionEnzymes）

磷酸酶（phosphatase）

激酶（Kinase）

连接酶（Ligase）

5.生物质谱简介

生物质谱在蛋白组学中的应用？

1.ProteinsMWmeasurements；2.ProteinIdentification；（ID）3.Peptideandproteinprofiling；4.ImagingMS；5.ProteinPTMs；5.ProteinQuantification

6.《常用电泳技术基本原理及应用》课程复习题

i.简述形成不连续PAGE电泳的样品浓缩效应的4个不连续性。

1.凝胶的不连续性-浓缩胶4%大孔径，分离胶-20%小孔径

2.缓冲离子的不连续性-浓缩胶αCl->α蛋>αGly;mclαCl->m蛋α蛋>mGlyαGly；分离胶αCl->αGly>α蛋;mclαCl->mGlyαGly>m蛋α蛋

3.PH的不连续性电极缓冲液PH8.3;浓缩胶PH6.7；分离胶PH8.9

4.电位梯度的不连续性浓缩胶-较高的电位梯度；分离胶-均一电位梯度

ii.双向电泳的定义并简述以细胞为样本做双向电泳的实验步骤。

定义：

等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

实验步骤：

1.样品蛋白的制备（samplepreparation）；2.蛋白定量（determinationofconcentration）；3.等电聚焦（第一向）（first-dimensionisoelectricfocusing）；4.平衡（IPGstripequilibration）；5.SDS-PAGE（第二向）（second-dimensionSDS-PAGE）；6.染色（staining）；7.图像采集和分析（visualizationandevaluationofimages）；8.质谱鉴定蛋白（Massspectrometryofproteinspots）；9.蛋白质的验证分析（confirmationofcandidates）；10.蛋白质功能鉴定（Identificationofcandidates）

iii.简述SDS-PAGE电泳的基本原理。

基本原理：

PAGE的化学聚合是四甲基乙二胺的碱基催化过硫酸铵在碱性条件下产生游离氧自由基，引发单体丙烯酰胺成为自由基状态，被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，而多聚链也可与交联剂甲叉双丙烯酰胺的双功能集团和链末端的自由功能集团反应而发生交联，聚合成网状凝胶。

SDS-PAGE是在PAGE系统中引入了SDS，SDS即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去污剂，作为变性剂，它可断开分子和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构。

强还原剂，如beta-巯基乙醇、DTT则使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。

蛋白被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带负电荷大大超过了天然蛋白质所有的电荷量，因而掩盖了蛋白质原有电荷的差异，电泳迁移率主要决定于蛋白质或亚基分子量的大小。

7.激光扫描共聚焦荧光显微镜原理与应用

i.试述激光扫描共聚焦显微镜成像基本原理及其在生命科学中的应用。

工作原理：

利用激光器发出的激光做光源，激光经光源针孔形成电光源，激发光透过激发波长滤片后到达分光镜，由于分光镜能反射波长较短的激发光，而透过波长较长的发射光，所以激发光在分光镜处被反射，透过物镜，在扫描装置和控制装置的控制下在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描，荧光标记被激发出的发射光经原来入射光路直接反向回到反光镜，透过反光镜后再通过检测针孔，随后通过发射波长滤片光被光电倍增管逐点或逐线检测接收，并转换为数字信号传输至计算机，最终在计算机显示屏上形成焦平面的图像。

应用：

原位检测细胞中的核酸；原位检测蛋白质及其他分子；检测细胞凋亡；检测细胞器；活细胞或组织游离钙离子的分布和浓度；药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量；荧光漂白丢失和恢复的测量；荧光能量共振转移的测量。

ii.试述激光扫描共聚焦显微镜及荧光染料的激发光谱、发射光谱的定义。

激发光谱：

通过测量荧光物质的荧光发射强度随激发波长变化而获得的光谱，反映出不同波长激发光所激发的荧光的相对效率。

发射光谱：

荧光物质的荧光发射强度随放射波长变化而获得的光谱。

iii.归纳免疫荧光技术的基本原理，描述间接免疫荧光技术的实验操作步骤。

基本原理：

将抗原抗体的反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合，利用抗原与抗体发生特异性结合的原理，将荧光染料与抗体结合，然后将这种标记荧光染料的抗体与相应的抗原结合，即形成抗原抗体复合物，经一定波长的光激发后，即可发射出荧光。

以此辨认抗原在组织的分布情况，这种方法称为免疫荧光技术。

在荧光显微镜下，可以直接观察组织和细胞呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。

步骤：

1.标本制作；2.取出细胞贴附生长的盖玻片，用预热的PBS冲洗两次（漂洗血清蛋白）；3.4%多聚甲醛-PBS室温固定20分钟或者冷甲醇-20℃固定5分钟；4.0.01MPBS（PH7.4）漂洗3次，每次10分钟；5.1.5%TritonX-100-PBS孵育，室温20分钟，PBS漂洗3次，每次10分钟（细胞膜抗原可省次步）；6.取二抗种属相同宿主的血清（3-10%），或者5%BSA-PBS室温孵育60分钟；7.滴加特异性一抗，湿盒4℃过夜或者37℃孵育120分钟，PBS漂洗3次，每次10分钟；8.滴加与第一抗体匹配的荧光素标记的二抗，37℃避光孵育30分钟，PBS漂洗3次，每次10分钟；9.Hoechst3332或者DAPI复染细胞核5分钟，PBS漂洗1次，10分钟，再用蒸馏水洗1分钟，除去结晶盐；10.在载玻片上加一滴甘油/PBS封闭剂，将含细胞的盖玻片那一面朝向载玻片放置，周围再用指甲油固定。

iv.分别简述免疫荧光技术中甲醇和甲醛固定样本的基本原理。

甲醇：

抽提脂类，使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。

甲醛：

通过游离氨基酸形成分子间桥连，从而产生一种抗原相互连接的细胞网络结构。

交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的构造，但会下降一些细胞组分的抗原性，需增添一个通透步骤以使抗体可进入标本。

8.生物医学文摘数据库介绍

1）简述PubMed的重要检索功能

i.特征栏检索功能（Limits）

ii.超级功能（RelatedCitations,LinkOut）

iii.高级检索功能（Advancedsearch）

iv.词汇（主题词）自动转换功能（MeSHDatabase）

v.基于临床方法学检索（ClinicalQueries）

2）简述GoPubMed的几个主要统计分析功能

i.对论文年代分布进行统计分析功能

ii.对某领域核心著者进行统计揭示功能

iii.对某一领域核心期刊的统计揭示功能

iv.对著者的国家和城市分布进行统计分析功能

9.免疫组化的复习题（含答案）

1）.抗原修复有哪几种方法？

⏹胰酶

⏹胃蛋白酶

⏹微波

⏹高压锅

2）.免疫组化技术的优点有什么？

⏹方法简单，易掌握

⏹在组织切片原位显示抗原的表达情况

⏹试验条件要求不高，绝大多数实验室都可满足其需要。

⏹不需要特殊、贵重的仪器。

3）.非特异性染色的消除方法有哪些？

*最大限度稀释抗体

*BSA阻断

*二抗同种属正常血清阻断

*5%脱脂奶粉

4）.免疫组化染色阳性的判定标准是什么？

⏹通常以阳性细胞占所有细胞的10%以上定为阳性，如散在表达或表达量低时，也有选择5%阳性为阳性标准。

⏹根据染色的强度，分为+，++，+++。

10.PCR课的复习题（含答案）

1）PCR反应的五要素，即参加PCR反应的物质主要有哪些？

答：

引物，酶，dNTP，模板和镁离子

2）PCR的基本反应过程包括那几个主要步骤？

1）模板DNA的变性；

2）模板DNA与引物的退火（复性）；

3）引物的延伸

11．实验设计

一．对照的原则：

齐同可比的原则，即在实验体系中，除了被研究因素外，其他因素均要保持一致的原则。

二．要对由10个氨基酸组成的小肽片段进行小鼠体的抗肿瘤活性检测，其阴阳性对照应如何设计/选择？

三．前期工作提示X基因可能与肿瘤细胞的迁移、侵袭有关，设计一组实验对该可能性加以验证。

实验技术：

免疫组化，westernblot,RTPCR,MTT,软琼脂糖克隆形成实验，Transwell侵袭力实验，流式细胞术，成瘤实验，基因转染，SiRNA干扰，相关统计学方法

实验步骤：

1.收集临床标本进行X基因表达产物的检测，并与临床各个因素比较，初步认定与肿瘤的分期，病理类型和预后相关。

2.取该肿瘤的细胞系（尽可能多），检测X基因的蛋白表达（westernblot）和mRNA水平（RTPCR）。

3.转染X基因至肿瘤细胞系中，同时SiRNA干扰X基因的蛋白表达，并分别检测X基因的蛋白表达和mRNA水平。

4．分别检测转染、干扰和未经处理的细胞系的凋亡（MTT）、增殖（软琼脂糖克隆形成实验）侵袭力（transwell）、细胞周期（流式细胞术）及成瘤能力，鉴定X基因对于肿瘤相关特性的影响。

5.分别检测3组细胞系中相关癌基因，抑癌基因的蛋白表达情况，初步探讨X基因发挥作用的机制。

四．做westernblot时本底较高，试分析其可能的原因及提出解决的办法。

封闭不当，抗体浓度过高，洗涤不彻底；