高中生物选修3精品学案12 基因工程的基本操作程序.docx

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高中生物选修3精品学案12基因工程的基本操作程序

1.2　基因工程的基本操作程序

【目标导航】　1.结合教材图1－6，整体把握并说出基因工程的基本操作程序。

2.理解获取目的基因的途径及基因表达载体的构建。

3.理解目的基因导入受体细胞的方法、检测与鉴定目的基因的方法。

一、目的基因的获取（阅读P8－11）

1．基因工程的基本操作程序

（1）目的基因的获取。

（2）基因表达载体的构建。

（3）将目的基因导入受体细胞。

（4）目的基因的检测与鉴定。

2．目的基因的获取

（1）目的基因

主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。

（2）常见方法

①从基因文库中获取

基因文库的种类

②利用PCR技术扩增目的基因

a．原理：

DNA双链复制。

b．条件：

引物、DNA模板、Taq酶、四种脱氧核苷酸。

c．过程：

目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环多次。

d．结果：

每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，n为扩增循环的次数）。

③人工合成法：

如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可借助DNA合成仪用化学方法直接人工合成。

二、基因表达载体的构建（阅读P11）

1．基因表达载体的功能

使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

2．基因表达载体的构成

3．基因表达载体的构建过程

一般用同一种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。

三、将目的基因导入受体细胞（阅读P11－13）

1．转化的概念

目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2．转化的方法

（1）导入植物细胞

①农杆菌转化法：

将目的基因导入双子叶植物和祼子植物。

②基因枪法：

将目的基因导入单子叶植物常用的方法。

③花粉管通道法：

我国科学家独创的一种方法。

（2）导入动物细胞

①方法：

显微注射技术。

②常用受体细胞：

受精卵。

（3）导入微生物细胞

第一步：

首先用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。

第二步：

将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

四、目的基因的检测与鉴定（阅读P13－15）

1．分子水平检测（连线）

2．个体水平鉴定

包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。

基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。

判断正误：

（1）所有的目的基因都可从基因文库中直接获得。

（　　）

（2）利用PCR技术能合成目的基因。

（　　）

（3）标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。

（　　）

（4）目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法。

（　　）

（5）一种生物的cDNA文库可以有许多种，但基因组文库只有一种。

（　　）

（6）基因表达载体中需要含有起始密码、终止密码、目的基因、标记基因。

（　　）

（7）常用卵细胞作为动物的受体细胞。

（　　）

（8）检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。

（　　）

（9）检测目的基因是否转录出mRNA是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。

（　　）

[答案]　

（1）×　

（2）×　（3）√　（4）√　（5）√　（6）×　（7）×　（8）√　（9）√

一、目的基因的获取

1．几种获取目的基因方法的比较

方

法

基因文库的构建

PCR技

术扩增

人工

合成

基因组文库

部分基因文库

（如cDNA文库）

过

程

优

点

操作简单

专一性强

可在短时间内大量扩增目的基因

专一性强，可产生自然界中不存在的新基因

缺

点

工作量大、盲目性大、专一性差

操作过程较麻烦，技术要求过高

需要严格控制温度、技术要求高

适用范围小

2．PCR技术与DNA复制的比较

比较项目

DNA复制

PCR技术

区

别

解旋

方式

解旋酶催化

DNA在高温下变性解旋

场所

细胞内（主要

在细胞核内）

细胞外（主要在PCR扩增仪中）

酶

解旋酶、DNA聚合酶

耐热的DNA聚合酶

温度

细胞内温和条件

控制温度，需90℃～95℃高温

结果

合成DNA分子

合成DNA片段或基因

联系

（1）模板：

均需要脱氧核苷酸双链作为模板

（2）原料：

均为四种脱氧核苷酸

（3）酶：

均需DNA聚合酶

（4）引物：

都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸

1．基因组文库和部分基因文库有什么区别？

[答案]　基因组文库包含一种生物的全部基因，部分基因文库只包含一种生物的一部分基因。

2．怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？

[答案]　根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、功能、在染色体上的位置、转录产物mRNA以及基因表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。

3．PCR过程中需要解旋酶吗？

所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？

[答案]　PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。

4．什么样的基因适合用DNA合成仪直接人工合成？

[答案]　基因比较小，核苷酸序列又已知。

1．下列获取目的基因的方法中需要模板链的是（　　）

①从基因文库中获取目的基因　②利用PCR技术扩增目的基因　③反转录法　④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成

A．①②③④　　B．①②③

C．①②④　　D．②③

【问题导析】　

（1）PCR利用的是DNA双链复制原理，将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。

（2）反转录法则是以目的基因转录成的信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链的DNA。

①④则均不需要模板。

[答案]　D

【一题多变】

判断正误：

（1）目的基因可以从自然界已有物种直接分离，也可人工合成。

（　　）

（2）目的基因就是指编码蛋白质的基因。

（　　）

（3）真核生物的基因中含有内含子，因此常用反转录法获取目的基因。

（　　）

（4）利用DNA合成仪可以在短时间内大量扩增目的基因。

（　　）

[答案]　

（1）√　

（2）×　（3）√　（4）×

二、基因表达载体的构建与转化

1．基因表达载体的构建步骤

（1）一般用同一种限制酶切割目的基因和质粒，使其产生相同的末端。

（2）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成一个重组DNA分子（重组质粒）。

构建过程如下图：

特别提醒：

该过程把三种工具（两种工具酶、一种载体）全用上了，是最核心、最关键的一步，在体外进行。

2．将目的基因导入受体细胞的方法比较

细胞类型

方法

说明

特点

植

物

细

胞

农杆

菌转

化法

目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上→通过农杆菌→进入植物细胞→插入到植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达

经济、有效，适合于双子叶植物和裸子植物

基因

枪法

目的基因包裹在微小的金粒或钨粒表面→用基因枪高速射入到受体细胞或组织中→目的基因表达

成本较高，是单子叶植物中常用的基因转化方法

花粉

管通

道法

含目的基因的溶液→滴加在柱头上（或用含目的基因的溶液处理花粉粒）→花粉粒吸入目的基因→授粉→目的基因表达

简便、经济，我国科学家独创

动物

细胞

显微

注射

技术

目的基因片段→受精卵的核内→受精卵经胚胎早期培养一段时间后移植到雌性动物的输卵管或子宫内→使其发育成转基因动物

最为有效的将目的基因导入动物细胞的方法

微生

物细

胞

感受

态细

胞法

Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体在缓冲液中与感受态细胞混合→一定温度下促使感受态细胞吸收DNA分子

简便、经济、有效

归纳提炼　

1．结合教材P13资料卡分析，用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合？

试分析原因。

[答案]　需要。

因为目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。

2．农杆菌转化法利用了农杆菌的什么特性？

[答案]　农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA（可转移的DNA）可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。

3．为什么动物的体细胞一般不作为受体细胞？

[答案]　动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个体。

4．为什么微生物细胞适合作为基因工程的受体细胞？

但若通过基因工程生产人的糖蛋白，从细胞器的功能分析是否可用大肠杆菌作为受体细胞呢？

[答案]　微生物细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少的优点。

不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。

5．用于构建基因表达载体的质粒为什么必须具有启动子和终止子？

启动子和终止子与起始密码和终止密码是一回事吗？

[答案]　导入到受体细胞的目的基因的表达需要调控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有启动子，之后需有终止子。

不是一回事，启动子和终止子都在DNA上，在遗传信息转录时起作用。

启动子是启动转录的开始，终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位都是脱氧核苷酸。

而起始密码子和终止密码子都是mRNA上三个相邻碱基。

起始密码子决定翻译的开始，终止密码子决定翻译的停止。

2．农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。

下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：

（1）一般情况下农杆菌不能感染的植物是__________，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现_________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T－DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞____________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到____________（部位）即可。

（2）根据T－DNA这一转移特点，推测该DNA片段上可能含有控制_______________（酶）合成的基因。

（3）图中c过程中，能促进农杆菌向植物细胞转移的物质是__________类化合物。

（4）植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还可采取____________________________。

（至少写出两种）

[答案]　

（1）单子叶植物　将目的基因导入植物细胞　染色体的DNA　T－DNA片段（内部）

（2）DNA连接酶、限制酶　（3）酚

（4）基因枪法、花粉管通道法

[解析]　

（1）一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物。

利用其感染性，可实现目的基因导入植物细胞。

真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上的是农杆菌T－DNA片段，因此目的基因必须插入到该部位才能成功。

（2）根据T－DNA这一转移特点，可以推测该DNA片段能控制合成DNA连接酶、限制酶以实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合。

（3）植物细胞受伤后可产生酚类物质，促进农杆菌向植物细胞转移。

（4）植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。

【一题多变】

判断正误：

（1）获得上述转基因植物的核心步骤是a。

（　　）

（2）上题图中过程b可以用Ca2＋处理细菌。

（　　）

（3）用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌去感染植物细胞，从而把目的基因导入植物细胞，在这个过程中所有细胞都导入了目的基因。

（　　）

（4）农杆菌转化法常用的受体细胞是花粉细胞。

（　　）

（5）在过程a中只需要DNA连接酶的参与。

（　　）

（6）用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌去感染植物细胞，要经过植物组织培养才能获得表现出新性状的植物。

（　　）

（7）因病毒能够侵染正常细胞，有的病毒还能将自己的核酸整合到宿主细胞的染色体上，所以动植物病毒也可作为基因工程的载体。

（　　）

[答案]　

（1）√　

（2）√　（3）×　（4）×　（5）×　（6）√　（7）√

三、目的基因的检测与鉴定

1．目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键是什么？

如何检测？

[答案]　目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上，这是其能否在真核生物中稳定遗传的关键。

检测方法是采用DNA分子杂交技术。

2．什么是基因探针？

如何检测目的基因是否开始发挥功能？

[答案]　基因探针是用放射性同位素标记的目的基因的单链DNA片段。

从转基因生物中提取mRNA，用标记的目的基因作探针，与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA，意味着目的基因开始发挥功能。

3．检测目的基因是否翻译出蛋白质的方法是什么？

其原理是什么？

[答案]　抗原—抗体杂交法。

原理是抗原能与相应抗体特异性结合。

4．检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？

[答案]　用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。

3．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。

下列属于目的基因检测和鉴定的是（　　）

①检测受体细胞的染色体上是否有目的基因　②检测受体细胞是否有致病基因　③检测目的基因是否转录出了mRNA　④检测目的基因是否翻译出了蛋白质

A．①②③　　B．②③④

C．①③④　　D．①②④

【问题导析】　

（1）目的基因的检测首先检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因。

（2）其次检测目的基因是否转录出了mRNA。

（3）最后检测目的基因是否翻译出了蛋白质。

[答案]　C

【一题多变】

判断正误：

（1）如果检测出标记基因表达的性状，说明载体已导入受体细胞。

（　　）

（2）检测目的基因是否翻译成蛋白质是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。

（　　）

（3）DNA探针用来检测目的基因是否导入。

（　　）

（4）鉴定转化的基因是否成功表达，在分子水平上可应用的方法是抗原－抗体杂交。

（　　）

[答案]　

（1）√　

（2）×　（3）×　（4）√

1．基因工程的基本操作程序有：

①使目的基因与载体相结合；②将目的基因导入受体细胞；

③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求；④提取目的基因。

正确的操作顺序是（　　）

A．③②④①　B．②④①③

C．④①②③　D．③④①②

[答案]　C

[解析]　基因工程的主要操作步骤顺序是：

目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。

2．下列有关基因表达载体的叙述，不正确的是（　　）

A．具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增

B．具有启动子，使DNA聚合酶识别并开始转录

C．具有标记基因，有利于目的基因的检测

D．具有目的基因，以实现产生特定的基因产物

[答案]　B

[解析]　本题考查基因工程知识。

基因表达载体具有复制原点，能够使目的基因在受体细胞中复制而扩增；基因表达载体具有启动子，是RNA聚合酶识别位点，启动转录；基因表达载体具有标记基因，以便对目的基因进行检测和鉴定；基因表达载体具有目的基因，能够表达产生特定的基因产物。

3．基因工程中因受体细胞不同，目的基因导入的方法也不同，下列叙述不正确的是（　　）

A．将目的基因导入棉花细胞内常用花粉管通道法

B．将目的基因导入老鼠细胞内常用显微注射法

C．将目的基因导入大肠杆菌内常用感受态细胞转化法

D．将目的基因导入小麦细胞内常用农杆菌转化法

[答案]　D

[解析]　小麦是单子叶植物，其受伤后不能分泌酚类物质，农杆菌对它没有感染能力。

4．1957年，生物学家了解到，病毒感染的细胞能产生一种因子，这种因子能作用于其他细胞，干扰病毒的复制，故将其命名为干扰素；从1987年开始，用基因工程方法生产的干扰素进入了工业化生产，并且大量投放市场。

（1）若已知干扰素的氨基酸序列，则获取目的基因的较简单方法是

___________________________________________________________；

目的基因还可以从________________________________________________文库获取，

而从cDNA文库中不一定能得到，原因是____________________________________

________________________________________________________________________。

（2）用限制酶处理质粒和目的基因后，用________酶处理，可形成基因表达载体，该载体的化学本质是_______________________________________________________________。

（3）转基因技术是否成功，需要对受体细胞进行分子水平的检测，首先是检测受体细胞______________上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。

检测方法是采用___________________________________________________________。

最后还要检测目的基因是否翻译成了相应的蛋白质，利用的技术是________________。

[答案]　

（1）人工合成法　基因组　cDNA是由生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的（其他合理[答案]也可）

（2）DNA连接　DNA　（3）染色体的DNA　DNA分子杂交技术　抗原—抗体杂交技术

[解析]　

（1）若已知干扰素是氨基酸序列，则利用人工合成法获取目的基因较简单；由于cDNA是由生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的，所以cDNA中不一定有目的基因，最好从基因组文库中获取。

（2）用限制酶处理载体和目的基因后，将目的基因与载体连接，需要使用DNA连接酶处理，基因与载体的化学本质是相同的，都是DNA。

（3）检测目的基因使用DNA分子杂交技术；检测蛋白质采用的是抗原—抗体杂交技术。