青霉素发酵操作手册.docx
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青霉素发酵操作手册
青霉素生产使用手册
北京东方仿真技术有限公司
2007年5月
第一章背景知识
1.1青霉素的发现
1928年，英国细菌学家Fleming发现污染在培养葡萄球菌的双蝶上的一株霉菌能杀死周围的葡萄球菌。
他将此霉菌分离纯化后得到的菌株经鉴定为点青霉，并将这菌所产生的抗生物质命名为青霉素。
1940年，英国Florey和Chain进一步研究此菌，并从培养液中制出了干燥的青霉素制品。
经实验和临床试验证明，它毒性很小，并对一些革兰氏阳性菌所引起的许多疾病有卓越的疗效。
1.2青霉素分类及分子结构
青霉素是6－氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanicacid,6-APA）苯乙酰衍生物。
侧链基团不同，形成不同的青霉素，主要是青霉素G。
工业上应用的有钠、钾、普鲁卡因、二苄基乙二胺盐。
青霉素发酵液中含有5种以上天然青霉素（如青霉素F、G、X、K、F和V等），它们的差别仅在于侧链R基团的结构不同，其中青霉素G在医疗中用得最多，它的钠或钾盐为治疗革兰氏阳性菌的首选药物，对革兰氏阴性菌也有强大的抑制作用。
青霉素的结构通式可表示为
1.3青霉素的单位
目前国际上青霉素活性单位表示方法有两种：
一是指定单位（unit）；二是活性质量（μg），最早为青霉素规定的指定单位是：
50mL肉汤培养基中恰能抑制标准金葡萄菌生长的青霉素量为一个青霉素单位。
在以后，证明了一个青霉素单位相当于0.6μg青霉素钠。
因此青霉素的质量单位为:
0.6μg青霉素钠等于1个青霉素单位。
由此，1mg青霉素钠等于1670个青霉素单位（unit）。
1.4作用机理
已有的研究认为，青霉素的抗菌作用与抑制细胞壁的合成有关。
细菌的细胞壁是一层坚韧的厚膜，用以抵抗外界的压力，维持细胞的形状。
细胞壁的里面是细胞膜，膜内裹着细胞质。
细菌的细胞壁主要由多糖组成，也含有蛋白质和脂质。
革兰氏阳性菌细胞壁的组成是肽聚糖占细胞壁干重的50％～80％（革兰氏阴性菌为1％～10％）、磷壁酸质、脂蛋白、多糖和蛋白质。
其中肽聚糖是一种含有乙酰基葡萄糖胺和短肽单元的网状生物大分子，在它的生物合成中需要一种关键的酶即转肽酶。
青霉素作用的部位就是这个转肽酶。
现已证明青霉素内酰胺环上的高反应性肽键受到转肽酶活性部位上丝氨酸残基的羟基的亲核进攻形成了共价键，生成青霉噻唑酰基-酶复合物，从而不可逆的抑制了该酶的催化活性。
通过抑制转肽酶，青霉素使细胞壁的合成受到抑制，细菌的抗渗透压能力降低，引起菌体变形，破裂而死亡。
1.5青霉素的应用
临床应用：
40多年，主要控制敏感金黄色葡糖球菌、链球菌、肺炎双球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌、螺旋体等引起感染，对大多数革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体有抗菌作用。
优点：
毒性小，但由于难以分离除去青霉噻唑酸蛋白（微量可能引起过敏反应），需要皮试。
各种半合成抗生素的原料：
青霉素的缺点是对酸不稳定，不能口服，排泄快，对阴性菌无效。
氨苄青霉素耐酸广谱；对抗绿脓杆菌的磺苄青霉素，耐酸、耐酶、口服的乙氧萘青霉素等。
提供头孢菌素母核。
第二章发酵工艺过程
2.1菌种介绍
青霉是产生青霉素的重要菌种。
广泛分布于空气、土壤和各种物上，常生长在腐烂的柑桔皮上呈青绿色。
目前已发现几百种，其中产黄青霉（Penicillumchrysogenum）、点青霉（Penicillumnototum）等都能大量产生青霉素。
青霉素的发现和大规模地生产、应用，不仅对抗生素工业的发展起了巨大的推动作用，而且加上其他抗生素的广泛使用，比如像磺胺药物，使人类的平均寿命，再次延长了四岁。
此外，有的青霉菌还用于生产灰黄霉素及磷酸二酯酶、纤维素酶等酶制剂和有机酸。
1981年报导，疠孢青霉是纤维素酶的新来源，它能分解棉花纤维。
2.2菌种的保藏
菌种的保藏方法有：
斜面菌种低温保藏法、砂土管保藏法、甘油封藏法、真空冷冻干燥法。
斜面菌种低温保藏法利用低温对微生物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。
把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液等，直接放入4～5
℃冰箱中。
保藏时间一般不超过3个月，到时必须进行移接传代，再放回冰箱。
砂土管保藏法将干燥砂粒与细土混合后灭菌制成砂土管，然后接种保藏。
若把砂土管放在低温或抽气后密封，效果更佳。
此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。
保藏期1～10年。
甘油封藏法向培养好的菌种斜面上，加入灭菌甘油，高出斜面1cm，然后蜡封管口，放入冰箱。
该法既可防止培养基水分蒸发，又能使菌种与空气隔绝。
保藏期1～2年。
真空冷冻干燥法是目前比较理想的一种方法。
在低于-15℃下，快速将细胞冻结，并保持细胞完整，然后在真空中使水分升华致干。
在此环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异，故可长时间保存，一般为5～10年，最多可达15年之久。
此法兼备了低温、干燥及缺氧几方面条件，使微生物可以保存较长时间，但过程较麻烦，需要一定的设备。
2.3孢子的制备
这是发酵工序的开端，是一个重要环节。
抗生素产量和成品质量同菌种性能以及同孢子和种子的情况有密切关系。
生产用的孢子需经过纯种和生产能力的检验，符合规定的才能用来制备种子。
保藏在砂土管或冷冻干燥管仲的菌种经无菌手续接入适合于孢子发芽或菌丝生长的斜面培养基中，经培养成熟后挑选菌落正常的孢子可再一次接入试管斜面。
对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基孢子，孢子可直接作为中子罐的种子。
2.4种子制备
种子制备是指孢子接入种子罐后，在罐中繁殖成大量菌丝的过程，其目的是使孢子发芽、繁殖和获得足够数量的菌丝，以便接种到发酵罐当中去。
种子制备所使用的培养基及其它工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。
种子罐级数是在指制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。
青霉素种子制备一般为二级种子罐扩大培养。
2.5发酵培养基介绍
培养基是供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。
培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量等。
青霉素的发酵培养基由碳源、氮源、无机盐及金属离子、添加前体、消沫剂五部分组成。
碳源的主要作用是：
为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分；为合成目的产物提供所需的碳成分。
青霉素发酵中常用乳酸或葡萄糖，也可采用葡萄糖母液、糖蜜等。
其中乳糖最为便宜，但因货源较少，很多国家采用葡萄糖代替。
但当葡萄糖浓度超过一定限度时，会过分加速菌体的呼吸，以至培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，导致pH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长河产物的合成。
氮源的作用是供应菌体合成氨基酸和三肽的原料，以进一步合成青霉素。
主要有机氮源为玉米浆、棉籽饼粉、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨等。
玉米浆为较理想的氮源，含固体量少，有利于通气及氧的传递，因而利用率较高。
固体有机氮源原料一般需粉碎至200目以下的细度。
有机氮源还可以提供一部分有机磷，供菌体生长。
无机氮如硝酸盐、尿素、硫酸铵等可适量使用。
碳酸钙用来中和发酵过程中产生的杂酸，并控制发酵液的pH值，为菌体提供营养的无机磷源一般采用磷酸二氢钾。
另外加入硫代硫酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所需的硫。
由于现在还有一些工厂采用铁罐发酵，在发酵过程中铁离子便逐渐进入发酵液。
发酵时间愈长，则铁离子愈多。
铁离子在50µg/ml以上便会影响青霉素的合成。
采用铁络合剂以抑制铁离子的影响，但实际对青霉素产量并无改进。
所以青霉素的发酵罐采用不锈钢制造为宜，其他重金属离子如铜、汞、锌等能催化青霉素的分解反应。
添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借酰基转移的作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提高青霉素G的生产强度，添加苯氧乙酸则产生青霉素V。
因此前体的加入成为青霉素发酵的关键问题之一。
但苯乙酸对发酵有影响，一般以苯乙酰胺较好。
也有人采用苯乙酸月桂醇酯，其优点是在发酵中月桂醇酯水解，苯乙酸结合进青霉素成品。
而月桂酸作为细菌营养剂及发酵液消沫剂，且其毒性比苯乙酸小，但价格较贵。
前体要在发酵开始20h后加入，并在整个发酵过程中控制在50
µg/ml左右
由于在发酵过程中二氧化碳的不断产生，加上培养基中有很多有机氮源含有蛋白质，因此在发酵罐内会产生大量泡沫，如不严加控制，就会产生发酵液逃液，导致染菌的后果。
采用植物油消沫仍旧是个好方法，一方面作为消沫剂，另一方面还可以起到碳源作用，但现在已普遍采用合成消沫剂（如聚酯、聚醇类消沫剂）代替豆油。
2.6灭菌
“灭菌”指的是用化学或物理的方法杀灭或除去物料及设备中所有的有生命物质的技术或工艺流程。
灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象。
工业上常用的方法有：
干热灭菌、湿热灭菌、化学药剂灭菌、射线灭菌和介质过滤除菌等几种。
在青霉素的生产中，对培养基和发酵罐主要采用的是湿热蒸汽灭菌和空气过滤除菌的方法。
2.7发酵
这一过程的目的主要是为了使微生物分泌大量的抗生素。
发酵开始前，有关设备和培养基必须先经过灭菌，后接入种子。
接种量一般为5～20%。
发酵周期一般为4～5天，但也有少于24小时，或长达二周以上的。
在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和罐压，并隔一段时间取样进行生化分析和无菌试验，观察代谢变化、抗生素产生情况和有无杂菌污染。
2.7.1发酵的过程控制
1、碳源控制：
青霉菌能利用多种碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等。
乳糖是青霉素生物合成的最好碳源，葡萄糖也是比较好的碳源，但必须控制其加入的浓度，因为葡萄糖易被菌体氧化并产生抑制抗生素合成酶形成的物质，从而影响青霉素的合成，所以可以采用连续添加葡萄糖的方法代替乳糖。
苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作为青霉素G的侧链前体。
菌体对前体的利用有两个途径：
直接结合到产物分子中或作为养料和能源利用，即氧化为二氧化碳和水。
前体究竟通过哪个途径被菌体利用，主要取决于培养条件以及所用菌种的特性。
通过比较苯乙酰胺、苯乙酸及苯氧基乙酸的毒性，除苯氧基乙酸外，苯乙酰胺和苯乙酸的毒性取决于培养基的pH和前体的浓度。
碱性时，苯乙酰胺有毒；酸性时，苯乙酸毒性较大；中性时，苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。
前体用量大于0.1%时，青霉素的生物合成均下降。
所以一般发酵液中前体浓度以始终维持在0.1%为宜。
在碱性条件下，苯乙酸被菌体氧化的速率随培养基pH上升而增加。
年幼的菌丝不氧化前体，而仅利用它来构成青霉素分子。
随着菌龄的增大，氧化能力逐渐增加。
培养基成分对前体的氧化程度有较大影响，合成培养基比复合培养基对前体的氧化量少。
为了尽量减少苯乙酸的氧化，生产上多用间歇或连续添加低浓度苯乙酸的方法，以保持前体的供应速率略大于生物合成的需要。
2、pH控制：
在青霉素发酵过程中，pH是通过下列手段控制的：
如pH过高，则添加糖、硫酸或无机氮源；若pH过低，则加入碳酸钙、氢氧化钠、氨或尿素，也可提高通气量。
另外，也可利用自动加入酸或碱的方法，使发酵液pH维持在6.8～7.2，以提高青霉素产量。
3、温度控制：
青霉菌生长的适宜温度为30℃，而分泌青霉素的适宜温度是20℃左右，因此生产上采用变温控制的方法，使之适合不同阶段的需要。
一般一级种子的培养温度控制在27±1℃左右；二级种子的培养温度控制在25±1℃左右；发酵前期和中期的温度控制在26℃左右；发酵后期的温度控制在24℃左右。
4、补料控制：
发酵过程中除以中间补糖控制糖浓度及pH外，补加氮源也可提高发酵单位。
经试验证实：
若在发酵60～70h开始分次补加硫酸铵，则在90h后菌丝含氮量几乎不下降，维持在6%～7%，，且60%～70%的菌丝处于年幼阶段，菌丝呼吸强度维持在二氧化碳量近30μl/（mg菌丝·h），抗生素产率为最高水平的30%～40%；而不加硫酸铵的对照罐，在发酵中期菌丝含氮量为7%，以后逐级下降。
至发酵结束时为4%。
发酵结束时呼吸强度降至二氧化碳量为16
μl/（mg菌丝·h），且抗生素产量下降至零，总产量仅为试验罐的1/2。
因此，为了延长发酵周期，提高青霉素产量，发酵过程分次补加氮源也是有效的措施。
5、铁离子的影响：
三价铁离子对青霉素生物合成有显著影响，一般若发酵液中铁离子含量超过30～40μg/ml，则发酵单位增长缓慢。
铁离子对产黄青霉绿色孢子合成青霉素的影响见下表。
因此铁罐在使用前必须进行处理，可在罐壁涂上环氧树脂等保护层，使铁离子含量控制在30μg/ml以下。
2.7.2防止染菌的要点
染菌是抗生素发酵的大敌，不制服染菌就不能实现优质高产。
影响染菌的因素很多，而且带随机性质，但只要认真对待，过细地工作，染菌是可以防止的。
请到左边的导航栏里选择查看防止染菌的要点的内容。
2.7.3空气系统的要求
防止空气带菌主要是提高空压机进口空气的洁净度，防止空气夹带油和水及空气过滤器失效。
提高空压机进口空气的洁净度，可以从提高吸气口的位置及加强空气的压缩前过滤着手。
防止空气夹带油、水，除加强去除油、水的措施外，还必须防止空气冷却器漏水，注意勿使冷却水压力大于空气压力，防止冷却水进入空气系统。
2.7.4蒸汽系统的要求
重视饱和蒸汽的质量，要严防蒸汽中夹带大量冷凝水，防止蒸汽压力大幅度波动，保证生产时所用的蒸汽压力在30～35千帕以上。
1、连续灭菌设备：
连消塔结构要求简单，易于拆装和清理，操作时蒸汽能与物料混合均匀，并易于控制温度。
2、发酵罐：
发酵罐及其附属设备应注意严密和防止泄漏，避免形成“死角”。
凡与物料、空气、下水道连接的阀门都必须保证严密度。
3、无菌室：
用超净工作台及净化室代替无菌室，以提高无菌程度。
第三章提炼工艺过程
3.1发酵液预处理
发酵液中的杂质如高价无机离子（Fe2+、Ca2+、Mg2+）和蛋白质在离子交换的过程中对提炼影响甚大，不利于树脂对抗生素的吸收。
如用溶媒萃取法提炼时，蛋白质的存在会产生乳化，使溶媒合水相分离困难。
对高价离子的去除，可采用草酸或磷酸。
如加草酸则它与钙离子生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固以提高发酵滤液的质量。
如加磷酸（或磷酸盐），既能降低钙离子浓度，也利于去除镁离子。
Na5P3O10+Mg2+====MgNa3P3O10+2Na+
加黄血盐及硫酸锌，则前者有利于去除铁离子，后者有利于凝固蛋白质。
此外，两者还有协同作用。
他们所产生的复盐对蛋白质有吸附作用。
2K4Fe（CN）6+3ZnSO4K2Zn[Fe（CN）6]2+2Na+
为了有效的去除发酵液中的蛋白质，需加入絮凝剂。
絮凝剂是一种能溶于水的高分子化合物。
含有很多离子化基团（如—NH2，—COOH，—OH）。
3.2提取
化学提取和精制的目的：
从发酵液中制取高纯度的、合乎药典的抗生素成品。
由于发酵液中青霉素浓度很低，仅0.1～4.5%左右，而杂质浓度比青霉素的高几十倍甚至几千倍，并且某些杂质的性质与抗生素的非常相近，因此提取精制是一件十分重要的工作。
发酵液中常见的杂质有：
菌丝、未用完的培养基、易污染杂菌、产生菌的代谢产物、预处理需要加入的杂质等。
在提炼过程中要遵循下面四个原则：
1、时间短
2、温度低
3、pH适中
4、勤清洗消毒
常用的提取方法有溶媒萃取法、离子交换法和沉淀法等。
1、溶媒萃取法这是利用抗生素在不同的pH值条件下以不同的化学状态（游离态、碱或盐）存在时，在水及水互不相溶的溶媒中溶解度不同的特性，使抗生素从一种液相（如发酵滤液）转移到另一种液相（如有机溶媒）中去，以达到浓缩和提纯的目的。
利用此原理就可借助于调节pH值得方法时抗生素从一个液相中被提取到另一液相中去。
所选用的溶媒与水应是互不相溶或仅很小部分互溶，同时所选溶媒在一定的pH下对于抗生素应有较大的溶解度和选择性，方能用较少量的溶媒使提取完全，并在一定程度上分离掉杂质。
2、离子交换法利用离子交换树脂和抗生素之间的化学亲和力，有选择性的将抗生素吸附上去，然后以较少量的洗脱剂将它洗下来。
3、沉淀法是一种分离抗生素简单而经济的方法，浓缩倍数高，因而也是很有效的方法。
青霉素的提取采用溶媒萃取法。
青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。
利用这一性质，在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中，调节pH，再转入中性水相，反复几次萃取，即可提纯浓缩。
选择对青霉素分配系数高的有机溶剂。
工业上通常用醋酸丁酯和戊酯。
萃取2－3次。
从发酵液萃取到乙酸丁酯时，pH选择2.8-3.0，从乙酸丁酯反萃到水相时，pH选择6.8-7.2。
为了避免pH波动，采用硫酸盐、碳酸盐缓冲液进行反萃。
所得滤液多采用二次萃取，用10%硫酸调pH2.8~3.0，加入醋酸丁酯。
在一次丁酯萃取时，由于滤液含有大量蛋白，通常加入破乳剂防止乳化。
第一次萃取，存在蛋白质，加0.05-0.1%乳化剂PPB。
3.3精制
这是青霉素生产的最后工序。
对产品进行精制、烘干和包装的阶段要符合“药品生产管理规范”的规定。
3.3.1脱色和去热原质
脱色和去热原质是精制注射用青霉素中不可缺少的一步。
色素是在发酵过程中所产生的代谢产物，它与菌种和发酵条件有关。
热原质是在生产过程中由于被污染后杂菌所产生的一种内毒素。
生产中一般用活性炭脱色去热原质，但需注意脱色时pH、温度、活性炭用量及脱色时间等因素，还应考虑它对抗生素的吸附问题，否则影响收率。
3.3.2结晶
抗生素精制常用结晶法来制得高纯度成品。
常用的几种结晶方法有：
1、改变温度结晶利用抗生素在溶剂中的溶解度随温度变化而显著变化的这一特性来进行结晶。
2、利用等电点结晶当将某一抗生素溶液的pH调到等电点时，它在水溶液中溶解度最小，则沉淀析出。
3、加成盐剂结晶在抗生素溶液中加成盐剂使抗生素以盐的形式从溶液中能够沉淀结晶。
青霉素钠盐在醋酸丁酯中溶解度很小，利用此性质，再二次醋酸丁酯萃取液中加入醋酸钠乙醇溶液，并控制温度青霉素钠盐就结晶析出。
反应如下：
醋酸丁酯中含水量过高会影响收率，但可提高晶体纯度。
水分在0.9%以下对收率影响较小。
得到的晶体要求颗粒均匀，有一定的细度。
颗粒太细会使过滤、洗涤困难。
晶体经丁醇洗涤，真空干燥即可等到成品。
3.4成品鉴定
成品鉴定是根据药典的要求逐项进行分析，包括效价鉴定、毒性试验、无菌检查、热源质试验、水分测定、水溶液酸碱度及混浊度测定、结晶颗粒的色泽及大小的测定等。
对于药典上未有规定的新抗生素，则可参照相近抗生素，按经验规定一些指标。
酸碱度检测取本品，加水制成每1ml中含30mg的溶液，测定。
pH值应为5.0～7.5。
溶液的澄清度与颜色取样品0.3g，加水5ml使溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与浊度标准液比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色标准比色液比较，均不得更深。
吸光度取样品，加水制成每1ml中含1.80mg的溶液，在280nm的波长处测定吸光度，不得大于0.10；在264nm的波长处有最大吸收，吸光度应为0.80～0.88。
细菌内毒素取样品测定，每100青霉素单位中含内毒素的量应小于0.01EU。
无菌取样品，用青霉素酶法灭活后或用适宜溶剂溶解后，转移至不少于500ml的0.9%无菌氯化钠溶液中，用薄膜过滤法处理后测定。
效价测定取本品适量，精密称定，加水溶液并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，摇匀，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取青霉素对照品适量，同法测定。
按外标以峰面积计算，其结果乘以1.0658，即为本品效价。
每1mg相当于1670青霉素单位。
3.5成品分装
抗生素产品一般分装为大包装的原料药，以供制剂厂进行小包装或制剂加工。
也有一些抗生素工厂在无菌条件下用自动分装机进行小瓶分装。
第四章操作规程
4.1发酵工艺过程
4.1.1正常发酵（过程）
1、进料（基质），开备料泵
2、开备料阀
3、备料后（罐重100000KG）关备料阀
4、关备料泵
5、开搅拌器
6、设置搅拌转速为200转
7、开通风阀
8、开排气阀
9、投加菌种
10、补糖，开补糖阀
11、补氮，开加硫铵阀
12、开冷却水，维持温度在25℃
13、PH值保持在一定范围内
14、前体超过1KG/M3（扣分步骤，出现则扣分）
4.1.2出料
1、停止进空气
2、停搅拌
3、关闭所有进料，开阀出料
4.1.3发酵过程中PH值低
调节PH值
开大氨水流量
PH值指标
4.1.4发酵过程中PH值高
关闭进氨水
开大补糖阀
调节PH值
4.1.5发酵过程中溶解氧低
开大进空气阀V02
调节溶解氧大于30%
4.1.6残糖浓度低
开加糖阀补糖
4.1.7发酵过程中温度高
开通冷却水进水冷却
温度指标
4.1.8泡沫高
添加消泡剂
泡沫高度降低到30CM
4.2提炼工艺过程
4.2.1预处理操作
1、打开阀V14，加发酵液。
2、待加料至5000kg时，关闭阀V14。
3、打开预处理罐搅拌器
4、打开阀V13，加黄血盐，去除铁离子。
5、观察铁离子浓度变化，待铁离子浓度为零时，关闭阀V13。
6、打开阀V12，加磷酸盐，去除镁离子。
7、观察镁离子浓度变化，镁离子浓度为零时，关闭阀V12。
8、打开阀V11，加絮凝剂，去除蛋白质。
9、观察蛋白质浓度变化，蛋白质浓度为零时，关闭阀V11。
10、打开阀V16、V17及泵P5，同时打开转筒过滤器开关及后阀V18。
11、待发酵液经过滤排至混合罐B101后，关闭阀V16、V17、泵P5以及转筒过滤器开关及后阀V18。
12、停止预处理罐搅拌器。
4.2.2一次BA萃取操作
1、打开混合罐B101搅拌器
2、打开阀V19，加BA（醋酸丁酯）质量为发酵液的1/4~1/3倍。
3、关闭阀V19。
4、打开阀V22，加稀硫酸调节PH值。
5、待PH值调节至2~3时，关闭阀V22。
6、打开阀V21，加破乳剂。
7、加破乳剂量为100kg时，关闭阀V21。
8、打开阀V23、V24及泵P6，向分离机注液。
9、待分离机中有液位时，迅速打开A101开关。
10、打开萃余相回收阀V26，调节V26阀门开度，控制重相液位在总液位的80%左右，使轻相液能充分的溢流至B102。
11、待混合罐B101液体排空后，关闭阀V23、V24及泵P6。
12、停止混合罐B101搅拌器。
13、待分离机A101中液体排尽后，关闭阀V26。
14、关闭分离机A101开关
4.2.3一次反萃取操作
1、打开混合罐B102搅拌器。
2、打开V28，加碳酸氢钠溶液，质量为青霉素溶液的3~4倍，并调节PH值为7~8
3、待PH值调节至7~8时，关闭阀V28。
4、打开阀V29、V30及泵P7，向分离机A102注液。
5、待分离机A102中有液位时，迅速打开A102开关。
6、打开萃余相回收阀V32，调节V32阀门开度，控制重相液位在总液位的80%左右，轻相液能充分的溢流出。
7、待混合罐B102液体排空后，关闭阀V29、V30及泵P7。
8、停止混合罐B102搅拌器。
9、待分离机中剩余少许重液时，关闭阀V32，防止轻液流入混合罐B103中
10、关闭分离机A102开关
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