谷胱甘肽抗坏血酸及半胱氨酸对α淀粉酶的影响.docx

谷胱甘肽抗坏血酸及半胱氨酸对α淀粉酶的影响.docx

《谷胱甘肽抗坏血酸及半胱氨酸对α淀粉酶的影响.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《谷胱甘肽抗坏血酸及半胱氨酸对α淀粉酶的影响.docx（13页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

谷胱甘肽抗坏血酸及半胱氨酸对α淀粉酶的影响

毕业论文

题目谷胱甘肽、抗坏血酸及半胱氨酸

对α-淀粉酶的影响

学院生命科学与化学学院

姓名王济沧

专业生物科学

学号282010320

指导教师周向军

提交日期2012年5月

原创性声明

本人郑重声明：

本人所呈交的论文是在指导教师的指导下独立进行研究所取得的成果。

学位论文中凡是引用他人已经发表或未经发表的成果、数据、观点等均已明确注明出处。

除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。

本声明的法律责任由本人承担。

论文作者签名：

年月日

论文指导教师签名：

谷胱甘肽、抗坏血酸及半胱氨酸对α-淀粉酶的影响

王济沧指导老师：

周向军

（天水师范学院生命科学与化学学院甘肃天水741001）

摘要：

以可溶性淀粉为底物，谷胱甘肽、抗坏血酸及半胱氨酸为抑制剂，研究其对α‐淀粉酶的抑制作用及光谱影响。

结果表明：

谷胱甘肽、抗坏血酸及半胱氨酸对α‐淀粉酶均有一定的抑制作用，当谷胱甘肽的浓度在0.05mol·L-1和0.25mol·L-1以及抗坏血酸和半胱氨酸的浓度在0.1mol·L-1和1.0mol·L-1范围内变化时，三者对α‐淀粉酶的抑制作用均在增强，且半胱氨酸抑制率＞抗坏血酸。

紫外吸收光谱显示，谷胱甘肽、抗坏血酸均引起α‐淀粉酶的构象发生变化，但半胱氨酸对其构象的影响不是很明显。

由此可知谷胱甘肽、抗坏血酸及半胱氨酸可作为淀粉酶抑制剂。

关键词：

α淀粉酶；谷胱甘肽；抗坏血酸（Vc）；L半胱氨酸；

Effectsofglutathione,ascorbicacidandcysteineonalpha-amylase

WangJicangInstructor:

ZhouXiangJun

（Tianshuinormaluniversity,CollegeofLifeScienceandChemistry,Tianshui,Gansu741001）

【Abstract】Inhibitoryeffectsofglutathione,ascorbicacidandcysteineandtheirinfluenceonultravioletspectrumofαamylasewereinvestigated.Theresultsshowedthatglutathione,ascorbicacidandcysteinehaveaninhibitoryeffectonαamylase,WhenGSHconcentrationin0.05mol•L-1and0.25mol•L-1andascorbicacidandhomocysteineconcentrationin0.1mol•L-1and1.0mol•L-1rangechange,ofalltheinhibitionofα‐amylasewereintheenhancement,andhomocysteineinhibitionrate>ascorbicacid.Uvabsorptionspectrashow,glutathione,ascorbicacidarecauseα‐amylaseconformationofchange,buttheconformationcysteineinfluenceisnotveryobvious.Glutathione,Ascorbicacidandcysteinecanbeusedasamylaseinhibitors.

【Keywords】a-Amylase;Glutathione;Ascorbicacid;L-cysteine.

α‐淀粉酶（alpha-amylase，EC3.2.1.1），其作用于淀粉内部并切开α-1，4糖苷键生成小分子糊精和还原糖。

谷胱甘肽是一种具有重要生理功能的活性三肽，由谷氨酸、半胱氨酸以及甘氨酸组成[1]，其主要作用是防止蛋白分子中活性部位巯基被氧化，从而维持蛋白质正常生物活性，同时又是多种酶的辅酶和辅基。

抗坏血酸在植物抗氧化、清除自由基、光合作用、细胞生长和分裂以及影响植物激素的生物合成等方面有着重要的生理作用[2]，被广泛应用于食品、美容、水产养殖业及畜牧业等行业。

半胱氨酸是一种含巯基的α‐氨基酸，其巯基具有许多重要的生理功能，可以缓解药物，如酚、萘、苯、氰离子等中毒，对放射线也有防治效果[3]。

半胱氨酸不仅是一种普通的防褐变食品添加剂，而且能够使食品具有特有的肉香味[4]。

谷胱甘肽和抗坏血酸能够抑制乳酸脱氢酶的活性，抑制类型为反竞争性抑制的动力学特征[5-6]，谷胱甘肽的抑制率小于抗坏血酸，且随谷胱甘肽和抗坏血酸浓度的升高其抑制率增大[7]。

研究还发现，当抗坏血酸单独存在时，对过氧化氢酶无抑制作用，而与Cu2+同时存在时，对过氧化氢酶有非线性抑制作用[8]。

半胱氨酸对多酚氧化酶的研究发现，半胱氨酸对该酶有着明显的抑制作用，可导致多酚氧化酶的酶促反应滞待时间延长，同时使酶稳态活力下降，为不可逆的抑制作用[9-10]。

已有研究表明，一些化合物如茶多酚[11]、咖啡因和可可碱[12]、苹果多酚提取物[13]、灰栒子提取物对α-淀粉酶均有抑制作用，在苹果多酚提取物中含有没食子酸、原儿茶酚、儿茶酚、绿原素、表儿茶酚、芦丁、根皮苷等酚类物质，它们对α-淀粉酶有较强的抑制作用，且最高抑制率为88.01%；灰栒子提取物[14]对α-淀粉酶活性的抑制率可达80%，Lineweaver-Burk双倒数图呈非竞争性抑制，pH对其抑制活性无显著影响，不同温度处理的灰栒子提取物抑制活性无明显变化。

而在研究大豆异黄酮对α-淀粉酶的抑制作用[15]中，发现大豆异黄酮及其糖苷均对α-淀粉酶有抑制作用，当抑制剂的浓度为1g/L时，对α-淀粉酶的抑制率为10%‐20%。

高粱原青素对α-淀粉也有抑制作用，采用酶抑制动力学方程分析，发现是通过可逆的竞争性抑制来实现的，其抑制常数为2.71mg·mL-1。

这些研究虽然发现了一些植物提取物对α-淀粉酶有抑制作用，却没有去研究这些提取物的单体是如何引起淀粉酶活性下降的。

而在该试验中，谷胱甘肽、抗坏血酸及半胱氨酸分别能够引起淀粉酶活性下降而作为淀粉酶的抑制剂，以期为这三种单体化合物作为淀粉酶的抑制剂提供一定的基础数据和参考。

1实验部分

1.1试剂与仪器

1.1.1主要试剂

氢氧化钠、谷胱甘肽、抗坏血酸、半胱氨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、可溶性淀粉、麦芽糖等均为分析纯。

3、5-二硝基水杨酸（DNS）：

甲液：

溶解6.9g苯酚于15.2mL10%NaOH中，并稀释至69mL，在此溶液中加6.9gNaHSO3；乙液：

称取255g酒石酸钾钠，加入到300mL10%NaOH中，再加入880mL1%DNS，甲和乙液相混即得黄色试剂，贮存于棕色试剂瓶中，在室温下放置7-10天后即可使用。

PH6.9磷酸缓冲液（PBS）：

称取4.4771gNa2HPO4和1.95gNaH2PO4，用蒸馏水定容至1000mL备用。

1.1.2主要实验仪器

PHS-3D雷磁pH计（上海精密科学有限公司）；722型可见分光光度计（上海欣茂有限公司）；UV-1800紫外可见分光光度计（日本岛津）；DK-S24型电热恒温水浴锅（上海精宏实验有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1麦芽糖标准曲线的制定

利用Bernfeld比色法[16-17]来制定标准曲线。

取七支试管，依次加入0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0mL1mol·L-1麦芽糖标准液，再分别加入0.05mol·L-1pH6.9PBS，补至2mL，再加入2mLDNS试剂，摇匀。

置沸水浴中煮沸5min后流水冷却，用缓冲液定容至25mL。

以不加麦芽糖的标准液为空白对照，在540nm波长下测定光密度值。

以麦芽糖含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.2酶活性测定

在2mL的反应体系中加入0.05mol·L-1pH6.9PBS、0.1%淀粉溶液，1mL淀粉酶液，37℃水浴3min，加入2mLDNS试剂，摇匀。

沸水浴5min，流水冷却，定容至25mL。

淀粉酶活力（mg麦芽糖/g酶.min）=生成麦芽糖量*Vt/（V用*酶质量*反应时间）计算酶活力[18]。

式中Vt=2mL，V用表示测定时酶解液体积。

1.2.3谷胱甘肽、抗坏血酸、半胱氨酸对α‐淀粉酶的影响

取三组编号分别为0、1、2、3、4、5、6的试管，每组试管中加入0.5mL0.5%取三组编号分别为0、1、2、3、4、5、6的试管，每组试管中加入0.5mL0.5%的管中，分别向每组的2、3、4、5、6号管中加入终浓度不同的谷胱甘肽、抗坏血酸、半胱氨酸，再加入PBS使反应体系保持2mL。

置于37℃水浴中预热3min后，加入2mLDNS试剂，摇匀，沸水浴5min后流水冷却，定容至25mL，540nm处测定光吸收值。

求出谷胱甘肽、抗坏血酸、半胱氨酸存在时酶的相对活性和不同浓度谷胱甘肽、抗坏血酸、半胱氨酸的抑制率，抑制率I=[（T-T1）/T]×100%，其中T和T1分别代表无抑制剂和有抑制剂的酶活[19]。

1.2.5不同浓度的谷胱甘肽、抗坏血酸、半胱氨酸对α-淀粉酶作用时的紫外吸收光谱

取三组试管，每组七只，编号为0、1、2、3、4、5、6，向每组的1、2、3、4、5中加入10mol·L-10.5mL和不同体积的谷胱甘肽（1mol·L-1）、抗坏血酸（1mol·L-1）、半胱氨酸（1mol·L-1），再加入PBS液使反应体系为3mL。

以0号和6号管为对照。

混合均匀，室温作用20min以后。

用UV-1800紫外可见分光光度计记录α-淀粉酶在240-300nm的紫外吸收光谱【20-21】。

2、结果与分析

2.1麦芽糖标准曲线的制作

图-1麦芽糖标准曲线

Fig.1StandardcurveofMaltose

以麦芽糖含量（mg）为横坐标，光密度为纵坐标，绘制出麦芽糖标准曲线。

DNS法即3,5-二硝基水杨酸比色法的测定原理是3,5-二硝基水杨酸在在性或在偏碱性条件下与多糖水解的还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物（3-氨基-5-硝基水杨酸）。

在一定范围内，还原糖的量与反应液的颜色成正比，在540nm处测得的OD值。

由图1可知，y=0.2419x-0.0036，R2=0.9962，线性范围为0~2mg·mL-1，可用于本实验计算出麦芽糖的量。

2.2不同浓度的谷胱甘肽、抗坏血酸、半胱氨酸对α‐淀粉酶的影响[22]

结果如图2、3所示。

图2不同浓度的谷胱甘肽对α‐淀粉酶抑制作用的影响

Fig.2TheinhibitoryeffectofdifferentconcentrationofGSHonαamylase

图3不同浓度的抗坏血酸和半胱氨酸对α‐淀粉酶抑制作用的影响

Fig.3Theinhibitoryeffectofdifferentconcentrationofascorbicacidandhomocysteineonαamylase

图2、3所示，可以看出，随着谷胱甘肽、抗坏血酸、半胱氨酸浓度的增加，对淀粉酶的抑制作用呈上升趋势，在浓度0.05mol·L-1和0.2mol·L-1之间时,谷胱甘肽对淀粉酶的抑制作用几乎呈直线上升，而抗坏血酸和半胱氨酸对淀粉酶的抑制作用在其浓度0.1mol·L-1和1mol·L-1之间变化较缓慢。

在图3中，当抗坏血酸和半胱氨酸的浓度在0.1mol·L-1和1.0mol·L-1之间变化时，两者对淀粉酶的抑制率的大小是半胱氨酸＞抗坏血酸，谷胱甘肽的浓度在0.25mol·L-1以上时其最高抑制率为92.86%，抗坏血酸和半胱氨酸的浓度为1mol·L-1时的最高抑制率分别为84.97%和86.72%。

2.3不同浓度的谷胱甘肽、抗坏血酸、半胱氨酸与α‐淀粉酶作用时的紫外吸收光谱

紫外-可见吸收光谱是一种操作简单、方便的测量方法之一，也常常用来研究蛋白质分子的结构及其构象的变化[22-24]。

而本次实验中测得了加入谷胱甘肽、抗坏血酸、半胱氨酸之前和之后α‐淀粉酶的吸收光谱，见图4、5、6、所示。

2.3.1淀粉酶在加入不同浓度的谷胱甘肽前后紫外吸收变化的光谱图

图4加入谷胱甘肽前后淀粉酶紫外吸收变化光谱图

Fig.4UltravioletabsorptionspectraofAmylasewhenaddglutathionebeforeandafter

图例中的a、b、c、d表示谷胱甘肽的浓度依次增强。

由图5可知，谷胱甘肽在加入淀粉酶后，淀粉酶在280nm处的紫外吸收峰发生了红移，并且随着谷胱甘肽的浓度的增大吸收强度增加。

紫外吸收光谱的变化说明，谷胱甘肽对淀粉酶分子的构象引起了变化。

2.3.2淀粉酶在加入不同浓度的抗坏血酸前后紫外吸收变化的光谱图

图5加入抗坏血酸前后淀粉酶紫外吸收变化光谱

Fig.5UltravioletabsorptionspectraofAmylasewhenaddascorbicacidbeforeandafter

图例中的a到d表示抗坏血酸的浓度由低到高。

从图5中可以看出，α淀粉酶的紫外吸收峰在280nm处。

随着抗坏血酸浓度的逐渐增加，紫外吸收峰发生了蓝移，浓度越大时蓝移越明显，当浓度达到一定量时蓝移幅度会减小，此时说明抗坏血酸与α淀粉酶的结合基本达到饱和。

当抗坏血酸的浓度小于0.0133mol·L-1时，紫外吸收峰都低于抗坏血酸的紫外吸收峰。

2.3.3淀粉酶在加入不同浓度的半胱氨酸前后紫外吸收变化的光谱图

图6加入半胱氨酸前后淀粉酶紫外吸收变化光谱图

Fig.6UltravioletabsorptionspectraofAmylasewhenaddcysteinebeforeandafter

图例中的a到d表示半胱氨酸的浓度由高到低。

有图6可知，当只加半胱氨酸时，半胱氨酸的吸收峰在250nm处左右，而只加淀粉酶时其吸收峰在280nm处，随着半胱氨酸浓度的增加，紫外吸收也增强，在280nm处的吸收峰发生了微弱的蓝移。

这说明加入一定剂量的半胱氨酸后，引起了淀粉酶分子构象的变化，进而影响到了淀粉酶的活性。

3．结论与讨论

本研究在α-淀粉酶最适温度37℃和最适pH6.8的条件下探讨了谷胱甘肽、抗坏血酸及半胱氨酸对α-淀粉酶的抑制作用。

还原糖的测定方法主要有DNS法、铁氰化物法、CBA法、MBTH法、甲胺法[25]，由于DNS法操作简便、快速、灵敏度高、成本低、耗时短、误差低等优点，所以本实验采用了该方法。

谷胱甘肽、抗坏血酸、半胱氨酸随着其浓度的升高对α‐淀粉酶的抑制作用都在增强，在浓度0.05mol·L-1和0.2mol·L-1之间变化时，谷胱甘肽对淀粉酶的抑制作上升趋势几乎成线性上升。

而半胱氨酸和抗坏血酸的浓度越大，抑制率上升的趋势减弱，在半胱氨酸和抗坏血酸的浓度在0.1mol·L-1和1.0mol·L-1之间变化时，其两者的抑制率为半胱氨酸＞抗坏血酸。

通过紫外吸收光谱分析，在没有加入三种化合物的时，α-淀粉酶的紫外吸收光谱在280nm处。

当加入三种化合物以后，其紫外吸收光谱在280nm处发生了蓝移和红移。

由此可以得到，这三种化合物都能引起α-淀粉酶分子构象的变化，进而影响α-淀粉酶活力，从而对α-淀粉酶的活性起到抑制作用。

本实验研究了谷胱甘肽、半胱氨酸和抗坏血酸对α-淀粉酶的抑制作用，并没有更深的去研究抑制类型。

紫外光谱分析中并没有研究此三种化合物对α-淀粉酶活性中心氨基酸残基中的哪种基团发生了作用[26]，进而引起了其构象的变化，导致酶活性的下降。

在本实验中，没有将谷胱甘肽、半胱氨酸、抗坏血酸三者的浓度设置在同一浓度范围内，因此没有测出三者在同一浓度范围内的抑制率的大小，从而得出三者之中哪一种物质对淀粉酶的抑制效果最好。

结果表明：

谷胱甘肽、抗坏血酸及半胱氨酸对α‐淀粉酶均有一定的抑制作用，当谷胱甘肽的浓度在0.05mol·L-1和0.25mol·L-1之间变化时，其对淀粉酶的抑制率增大，且在0.05mol·L-1和0.2mol·L-1之间时，几乎成线性增大。

以及当抗坏血酸和半胱氨酸的浓度在0.1mol·L-1和1.0mol·L-1范围内变化时，它们对α‐淀粉酶的抑制率增强趋势较弱，且半胱氨酸抑制率＞抗坏血酸。

紫外吸收光谱显示，谷胱甘肽、抗坏血酸均引起α‐淀粉酶的构象发生变化，但半胱氨酸对其构象的影响不是很明显。

由此可知谷胱甘肽、抗坏血酸及半胱氨酸可作为淀粉酶抑制剂。

参考文献：

[1]周宇光，付国平，肖仔军.谷胱甘肽的生产和应用研究进展[J].食品工业科技，2003，37（3）：

89-90.

[2]刘拥海，俞乐，王若仲，等.抗坏血酸对植物生长发育的作用及其缺失突变体的研究进展[J].植物生理学报，2011，6（9）：

847-854.

[3]杨金奎，何璧梅.微生物方法生产L‐半胱氨酸的研究进展[J].国外医药抗生素分册，2001，22（40）：

171-181.

[4]刘玉婷，吴宏伟，尹大伟，等.半胱氨酸在食品中的研究与应用[J].中国调味品，2009，34（12）：

33-35.

[5]刘岩，范业鹏.谷胱甘肽对乳酸脱氢酶活性影响的动力学研究[J].哈尔滨医科大学学报，2005，39

（2）：

121-123.

[6]张丽姝，范业鹏，杨歌德，等.抗坏血酸对兔肌乳酸脱氢酶的抑制作用的动力学研究[J].哈尔滨医科大学学报，2002，36

（1）：

25-28.

[7]徐娜，刘岩，范业鹏.谷胱甘肽、抗坏血酸对乳酸脱氢酶抑制作用的比较[J].哈尔滨医科大学学报，2007，41

（2）：

179-181.

[8]谢修银，王志勇，刘欲文，等.热动力学研究抗坏血酸和Cu2+对过氧化氢酶的协同抑制[J].化学学报，2003，61（3）：

331-335.

[9]邱龙新，黄浩，陈清西.半胱氨酸对马铃薯多酚氧化酶的抑制作用[J].食品科学，2006，27（4）：

37-40.

[10]杨美花，李智聪，刘凤娇，等.半胱氨酸做为化妆品美白添加剂的作用机理[J].厦门大学学报，2009，48（4）：

581-583.

[11]阮妙芸，张根义.茶多酚对淀粉酶抑制作用的研究[J].安徽农业科学，2008，36（11）：

4371-4373.

[12]雷芳.茶碱、咖啡因及可可碱对胰α-淀粉酶部分理化性质的影响[D].四川：

四川大学，2006.

[13]刘杰超，焦忠高，王思新.苹果多酚提取物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用[J].果树学报，2011，28（4）：

553-557.

[14]程睿，曾阳，黄元，等.灰栒子提取物对α-淀粉酶的抑制作用的初步研究[J].食品科技，2009,34（11）：

243-245.

[15]金吉淑，尹学哲，金泽武道，等.大豆异黄酮α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用[J].延边大学医学报，2001,24（4）：

239-242.

[15]贾光锋.α-淀粉酶抑制剂的制备及检测[J].食品与药品，2007，9

（2）:

：

34-36.

[16]赵修南，贾启燕，单俊杰.α-淀粉酶抑制剂筛选方法的优化[J].国际药学研究杂志，2008，35（5）：

321-324.

[17]裘晓丹，刘雯，雷芳，等.可可碱对a-淀粉酶的抑制类型及光谱性质的影响[J].天然产物研究与开发，2008，20（120）：

99-102.

[18]史永昶，姜涌明.五种α-淀粉酶测活方法的比较研究[J].微生物通报，1996，23（23）：

371-373.

[19]贾旭，邓姗姗，李政，等.喜树碱与胰蛋白酶的相互作用[J].化学研究与应用，2006，18（12）：

1408-1411.

[20]刘雯，裘晓丹，雷芳，等.茶碱对胰α-淀粉酶的抑制类型及光谱性质[J].天然产物研究与开发，2008，20（120）：

298-301.

[21]朱晓青，吕敬慈，霍世欣，等.荷叶生物碱对胰脂肪酶的抑制作用[J].上海大学学报，2007，13

（1）：

86-93.

[22]王春，吴秋华，王志等.斛皮素与牛血清白蛋白相互作用的研究[J].光谱学与光谱分析，2006，26（9）：

1672-1675.

[23]郭兴家，郭闯，姜玉春，等.光谱法研究氨基己酸与牛血清白蛋白的相互作用[J].应用化学，2010，27（10）：

1193-1194.

[24]曹书霞，赵玉芬.分子吸收光谱在生物大分子研究中的应用[J].光谱学与光谱分析，2004，10（4）：

69-71.

[25]张勇勤，薛长湖，汤浩源，等.还原糖的可见分光光度法研究进展[J].食品与发酵工业，2007,33（5）：

97-99.

[26]洪法水.Pb2+离子对α-淀粉酶活性的影响及光谱学研究[J].光谱学及光谱学分析，2003，23（3）：

583-586.

致谢

在本论文即将完成之际，谨此向我的学位论文指导老师周向军和高义霞老师致以衷心的感谢和崇高的敬意！

本论文的工作是在周老师和高老师的悉心指导下完成的。

周老师和高老师以他们敏锐的洞察力、渊博的知识、严谨的治学态度、精益求精的工作作风和对科学的献身精神给我留下了刻骨铭心的印象，这些使我受益匪浅，并将成为我终身献身科学和献身事业的动力。

在大学的这四年里，周老师和高老师不仅为我创造了优越学习环境，使我得以在生物科学领域中自由翱翔，同时在思想上、人生态度和意志品质方面给予了谆谆教诲，这些教益必将激励着我在今后的人生道路上奋勇向前。

  由衷感谢我的学友刘增文、王锋忠、刘海玉、高娜、张建荣、同学等，他们开创性的研究拓展了我的学术视野，无数次的争论和探讨使我的论文工作有了长足的进展。

  衷心的感谢我的父母和其他亲朋好友对我的关心、支持和理解，没有他们对我的关心、鼓励和支持，我无法完成现在的学士学业。

  最后，感谢曾经教育和帮助过我的所有老师。

衷心地感谢为评阅本论文而付出宝贵时间和辛勤劳动的老师和同学们！