整理米氏常数测定方法.docx
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整理米氏常数测定方法
酶活米氏常数实验
一、实验前准备
1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。
2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL或5mg/mL），一般1mL足够用，可在1.5mL离心管中溶解。
TMB（外间冰箱上层）溶于DMSO（二甲亚砜，位于化学间王春雨的柜子里），ABTS（与TMB放在一起）溶于二次水。
3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200µL和10µL移液枪、50µL排枪（位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中）、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶标仪前，开空调定室温（25℃，提醒其他人随手关门），24孔板中其中一排加入适量H2O2（每孔1mL左右，注意避光，可在板上盖一张卷纸），将缓冲液、催化剂、底物放实验台上，静置0.5-1h。
4、记录本上提前写好实验的加样顺序：
催化底物TMB（或ABTS）的酶促动力学过程加样顺序：
①200µL缓冲液②10µL催化剂③底物TMB（ABTS）（0，0.5，1，2，4，6，8，10µL）④32µLH2O2（排枪加）
催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序：
①200µL缓冲液②10µL催化剂③H2O2（2，4，6，8，10，16，32，64µL）④10µL底物TMB（ABTS）（排枪加）
数据记录按下表记，Code为每次读板时的微孔板编号，Time为对应的读板时的时间，一般30s读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。
Code
1
2
3
4
5
6
7
Time
TMB
0
0.5
1
2
4
6
8
10
V01
Code
1
2
3
4
5
6
7
Time
H2O2
2
4
6
8
10
16
32
64
V01
二、实验
2.辨识与分析危险、有害因素1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通），密码为5个0，按Enter键进入系统。
电脑开机，密码为mby-nano，双击酶标仪软件图标
，出现登录框
，直接点击“登录”，进入酶标仪控制界面
，若底物为TMB，选择“铁动力学”（波长为650nm）
一、环境影响评价的发展与管理体系、相关法律法规体系和技术导则的应用
，选择模板1
；
打开电脑内置时钟，
若底物为ABTS，则检验项目选择“gg”（波长为405nm）
。
（2）生产、储存危险化学品（包括使用长输管道输送危险化学品）的建设项目；新建一个word文档，以日期命名，打开。
『正确答案』B2、加样：
96孔板从左至右编号为1-12，自上而下编号为A-H。
以TMB为例，从第1列加样：
每名环境影响评价工程师申请登记的类别不得超过2个。
①从A1至H1，每孔加200µLNaAc/HAcBuf；
意愿调查评估法（简称CV法）是指通过调查等方法，让消费者直接表述出他们对环境物品或服务的支付意愿（或接受赔偿意愿），或者对其价值进行判断。
在很多情形下，它是唯一可用的方法。
如用于评价环境资源的选择价值和存在价值。
②从A1至H1，每孔加10µL催化剂（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；
C.可能造成较大环境影响的建设项目，应当编制环境影响报告书③从A1至H1，每孔分别加不同体积（0，0.5，1，2，4，6，8，10µL）TMB（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；
④用排枪吸取32µLH2O2加入A1至H1，快速放入酶标仪中，点击“读板”，记下读板时间（如下表所示，假设第一次读板时间为09：
00：
00）
建设项目环境影响评价技术服务机构（以下简称“环评机构”）应当按照《建设项目环境影响评价资质管理办法》的规定申请建设项目环境影响评价资质（以下简称“环评资质”），经国家环境保护部审查合格，取得《建设项目环境影响评价资质证书》后，方可在环评证书规定的资质等级和评价和范围内从事环境影响评价技术服务。
Code
报告内容有：
建设项目基本情况、建设项目所在地自然环境社会环境简况、环境质量状况、主要环境保护目标、评价适用标准、工程内容及规模、与本项目有关的原有污染情况及主要环境问题、建设项目工程分析、项目主要污染物产生及预计排放情况、环境影响分析、建设项目拟采取的防治措施及预期治理效果、结论与建议等。
1
在可行性研究时应进行安全预评价的建设项目有：
2
3
4
5
6
7
Time
00：
00
00：
30
01：
00
01：
30
02：
00
02：
30
03：
00
03：
30
TMB
0
0.5
1
2
4
6
8
10
V01
用排枪加H2O2时，注意检查枪头是否插紧，否则会导致吸取H2O2的量不足。
亦可先将96孔板放入酶标仪，再加H2O2，这样可以节约时间。
每次读板出来结果后，点击“结果入库”——>“是”——>“确定”，按下“PrintScreen”键，点击“退出”，打开word文档，ctrl+V或者右击选“粘贴”，保存结果，要留意下次读板的时间。
若遗漏某个模板没有保存，可点击“查询结果”，下拉框中选择目的模板编号即可。
（现已可以直接拷吸光值读取数据，按ctrl键点击该处文字见方法）
3、第一组数据保存后，将第一组的反应液倒掉，用卷纸将边上的液体擦干。
第二、三、四组同第一组的操作。
保存所有数据，拷贝到U盘里，整理实验台，关掉酶标仪、空调和电脑。
4、若当天不再继续实验，将24孔板中剩余的H2O2倒掉，用清洁剂洗后，再用二次水冲洗一次，放入烘箱中烘干。
移液枪放回原处，催化剂、底物和H2O2放入冰箱中保存。
三、数据处理
1、打开Origin6.1，点击右上角的“AddNewColumn”（箭头所指）：
，亦可右击——>AddNewColumn
。
2、输入数据：
命名各列，X列命名为时间，单位s，8个Y列分别为8个孔的编号。
X列时间从0-180s，0s对应微孔板编号1的数据，30s对应code2的数据，以此类推，将所读数据输入。
点击“file”—>“SaveProjectAs”
，
保存文件名为“第一组”
。
3、数据输入完成后，选择X和Y列，点击左下角的“点图”标志（箭头所指）
作出点图，点击Analysis—>FitLinear作线性拟合
，
在结果对话框里，拟合的方程为Y=A+B*X，B的值为拟合得出的斜率即反应的初速度V
，
同样方法得出不同TMB体积对应的反应初速度V，记录数据：
Code
1
2
3
4
5
6
7
Time
00：
00
00：
30
01：
00
01：
30
02：
00
02：
30
03：
00
03：
30
TMB
0
0.5
1
2
4
6
8
10
V01
0
0.00714
0.00902
0.01162
0.01425
0.01597
0.01547
0.017
同样方法得出第二、三、四组的反应初速度V，记录数据。
4、新建NewProject，数据表1中命名X列为底物（TMB）浓度，列中数据为A-H对应的孔中TMB的物质的量浓度（一般用µmoL/L）；挑选三组比较好的初速度V，输入Y列
。
选中初速度V的三列，右击—>StatisticsonRows
，
得出数据表2，选定Mean和sd列中的值，右击复制，粘贴至数据表1中
，
选定sd列，右击—>SetAs—>YError，将标准方差设为误差棒
。
选定X列、Mean列和sd列，画点图
，
点击Analysis—>Non-linearCurveFit，作非线性拟合
拟合的方程为米氏方程y=P1*x/（P2+x），y为反应初速度，x为底物浓度，P1为Vmax值，P2为米氏常数Km值（若软件中没有此方程，可点击New新建方程，之后也可点击Edit编辑方程）
；点击StartFiting，得出对话框
，点击ActiveDataset，
，设定P1、P2初始值为1，
，点击10lter进行非线性拟合，得出
，记录Vmax和Km值。
可双击X或Y轴修改坐标轴名称
，
点击图上方的“T”标志
可在图上插入文本框，将Km和Vmax值写入
。
5、保存结果。
6、计算Kcat值
Kcat表示每个酶分子在单位时间内催化底物的分子数，反应了酶催化能力的大小。
根据下面的公式计算：
（1）
（2）（3）
v的单位为Ms-1；vmax为非线性拟合得出的值，单位为s-1；ε=39000M-1·cm-1；l为反应体系的高度，96孔板每个孔的高度为1cm，每个孔的容积为300µL，可根据反应体系的平均体积占300µL的比例来计算反应体系的高度；[E]为催化剂的浓度，单位为M；m为催化剂的质量，可根据加入催化剂的体积和催化剂溶液的浓度计算得出；r为催化剂粒子的半径，以透射电镜测出的粒径计；ρ为催化剂的密度，单位为g/cm-3；NA为阿伏伽德罗常数，值为6.02×1023；V为反应体系的平均体积；Kcat单位为s-1。
附：
直接拷数据方法：
1.每次读板后，数据结果入库，待全面测完，按照当天的日期在桌面的DATA文件夹中查找自己的数据，格式为记事本，如20100825.txt，该文件拷入自带u盘。
2.选中该记事本文件，右击打开方式，选择用写字板打开，如图
打开后如下：
3.按ctrl+A，将写字板文件中全面数据选中，复制，新建一个word文档，粘贴。
4.选中某一列数据：
先将鼠标指针放在该列数据的第一个数据前面，然后按住alt键，向右下方拖动，直到黑色黑色区域将该列数据全面覆盖，注意不要覆盖其他数据，如图：
5.选中之后先松开鼠标，再松开alt键，选中后不要点击鼠标（左右键都不要点），按ctrl+c复制该列数据。
6.打开origin软件，选中某列，按ctrl+v即可将该列数据拷入选中列，如图：
7.友情提示：
在直接拷取数据时，如遇到不能直接拷入origin中时，可在word中插入表格，选中表格中一行或一列，将从txt中复制的数据粘贴进去，再在表格中重新选中数据，复制，即可一一对应的拷入origin中的表格中。
8.后续步骤按以上操作指示进行（按ctrl键点击该处）
9.
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