引物设计原则3.docx

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引物设计原则3

引物设计总结

1．寡核苷酸的优化设计

    在核酸分子杂交、DNA序列测定和通过PCR放大DNA片段等实验中，都需要使用寡核苷酸作为探针或引物，而对这些反应的质量起最重要影响作用的，就是这些寡核苷酸探针或引物。

用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结果，而用不够合适的寡核苷酸时，常常得出似是而非的结果，不仅大大增加了后续实验的工作量，还可能一无所获。

    怎样优化设计寡核苷酸呢?

至少有下列几个方面的问题需要考虑。

1. 估测可能形成的DNA或RNA双链的稳定性

    寡核苷酸，无论是DNA的或者RNA的，都有形成双链结构的潜在可能性，正如下面反复提到的，这种结构对寡核苷酸的作用有很大影响。

所以，预测这种结构的稳定性对设计和优化寡核苷酸就很重要。

在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。

在热动力学中，这样的性质以双链形成时的自由能（ΔG）来表示。

现在，大多采用 Breslauer等人提出的，以最接近的相邻核苷酸的动力学数值（自由能）来预测双链稳定性的方法。

为简化起见，所有的计算都在25 ℃条件下进行。

此时，最接近的相邻核苷酸的自由能是：

此主题相关图片如下：

4．1 如何测定引物的OD值？

    用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的光密度来定量。

请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-0.8之间。

DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色杯中测定其光密度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。

2． 如何检测引物的纯度？

    实验室方便的作法是用PAGE方法。

使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。

取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95℃,2mins）。

加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。

600V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。

3． 怎样按照使用浓度溶解引物？

    记住几个参数：

    在1ml体积1cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为1A260的溶液定义为1 OD260单位，据此定义，1 OD260引物干粉约为33微克；

    碱基的平均分子量为324.5；

    引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量；

    引物的摩尔数=质量数 / 引物分子量

    举例：

如果您拿到一管标明为2 OD的20碱基的引物，

    分子量=20 x 324.5=6490 质量数=2 x 33 =66μg

    摩尔数=66 / 6490 =0.010 μmol= 10 nmol

    若您需要溶解为10μM（=10pmol/μl）的溶液，只需加1mlddH2O充分溶解即可。

    同时请您注意：

真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在离心管底部，开启瓶盖时小心不要丢失；请加入足量的水充分振荡溶解。

4． 如何保存引物？

    可以室温或-20℃密闭长期保存；溶解以后的DNA最好保存在-20℃,溶解引物的水的PH值要求大于7，并且无菌。

带有荧光标记的引物请注意避光保存。

5． 已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？

    如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。

使用时没有充分解冻振荡混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。

6． 为什么说用EB染色合成DNA片段来定量是不正确的？

    通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量（如质粒DNA），是因为EB可以嵌合到双链DNA中。

而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会不同，比如Oligo（dT）等不形成二级结构，EB根本无法染色。

所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。

同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。

7．引物不纯会造成什么后果？

    引物不纯可能会导致：

1）非特异性扩增；2）无法用预先设计在引物5'端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3）用于测序出现双峰或乱峰。

8． 普通合成的DNA片段5'末端是磷酸基团吗？

    普通合成的DNA片段5'末端与3'末端都是羟基，可直接用于PCR。

如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化，需要另外收费（参见价目表）。

9.  常用标记的荧光染料的波长、可见光中的颜色 

简称        全称                                 吸收波长            发射波长                 颜色 

6-FAM    6-carboxy-fluorescein              494nm              518nm               Green 

TET       5-tetrachloro-fluorescein         521nm              538nm                Orange 

HEX       5-hexachloro-fluorescein          535nm              553nm                Pink 

TAMRA  tetramethyl-6-carboxyrhodamine 560nm            582nm               Rose 

ROX      6-carboxy-x-rhodamine             587nm              607nm               Red 

Cy3      Indodicarbocyanine                  552nm              570nm               Red 

Cy5      Indodicarbocyanine                  643nm              667nm               Violet

 from:

http:

//www.lookgene.cc/useful.htm

5．计算机辅助引物设计 from:

      引物在PCR反应中处于关键作用，引物决定着扩增的特异性和扩增的效率。

而在目前DNA的化学合成技术非常成熟的情形下，引物设计是否合适是我们应更为关注的层面。

现在有很多的免费的软件或网络资源（http:

//www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）能辅助我们进行引物设计，这使我们总能找到适合我们自己应用的引物设计工具。

笔者用得较多的引物设计软件有oligo 6.0 （ premier 5 （"TARGET=_ demo version）。

      需要说明的是经过细致推敲和计算的引物并不能保证扩增一定能够成功或高效，但严密的设计并系统地考虑一些应该避免的问题，能使我们在大多数情形下找到我们所需要的引物。

      笔者接触PCR较早，较多地从事引物设计也有一年多的时间，其间也得到过许多老师的帮助指教，现将一些体会整理出来，希望能对大家有一些帮助，同时也盼望能得到更多的指点。

一，简单扩增体系中引物设计原则。

      简单体系，是指扩增体系中模板较为单一且大部或全部模板序列已知，如经过纯化的短片段或纯化后的重组质粒等，是相对后面所提的复杂体系而言的一个粗略的分类。

以下是一个大致的流程：

1，  考虑实验本身对这对引物的要求。

如：

待扩增区域和扩增产物长度，扩增产物是否需要考虑移码突变，是否需要在引物5’端引入酶切位点和引入哪些酶切位点，是否需要引入点突变，…… 依据具体的实验而定。

实际上，此步应该是最费时间和精力的一步。

2，  引物的Tm值。

主要需要考虑的因素有：

I, 反应体系对引物退火温度的影响；如酶的最适工作温度对引物退火温度的限制等。

II,扩增产物的Tm值。

引物和产物的Tm值不要相差太大，20摄氏度范围内较好。

定下引物的Tm值范围之后即可定下引物的长度范围。

3，  引物的二级结构。

包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。

这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。

对于3’末端且5’端突出的引物二聚体，应控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5’端可适当放宽。

发卡结构也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大，影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构亦有很大的关系。

应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。

4，  扩增的特异性。

好的设计工具会提供一个引物异位引发的评价指标，如Oligo 6.0 的false priming efficiency，即异位引发效率，这个值是由程序根据引物自身二级结构的能量、错配的类型、错配离3'末端的距离等因素综合计算而得出，当此值大于200时便很有可能引发扩增。

如所用工具无量化指标，则可依据经验，当引物与模板在非预期位置退火，超过70%的碱基能互补配对，或引物3’末端连续8个或以上碱基配对，则认为有引发的可能。

      在简单扩增体系中，当我们定好上述限制条件，如能找到适合这些条件的引物，便最大可能地找到适合我们实验的引物。

如不能满足上述所有条件，则按所列顺序依次满足，总的来说遵循这样一个秩序：

扩增出符合实验需要的产物→扩增出能够分辨分离的符合实验需要的产物→特异地扩增出符合实验需要的产物。

同样，这一先后秩序也适用于复杂的扩增体系。

二，复杂模板的扩增体系。

      所谓复杂模板，是指体系中的DNA种类和数量较多，不能以此引物对所有的模板一一比较来计算其异位引发的可能性的情形。

此情形下与简单模板扩增相比较，除了需要考虑

（一）中所列的4点以外，还需要遵循下面一些原则以尽可能的避免异位扩增。

1，  引物3’末端的稳定性。

引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的ΔG。

此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则3’末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位引发。

因此在复杂模板的扩增体系中，3’末端5聚体的ΔG应大于-9.0kcal/mol。

2，  碱基组成应尽量随机分布，避免单一碱基的聚集。

这样可避免引物在模板的单一碱基富集区引发扩增反应。

3，  引物3’末端应尽量避免T，相较而言，3’末端的T对于此处的错配更为宽容。

三，测序引物设计时的注意点。

1，  对特异性的标准掌握更严格一些，也比普通PCR引物设计时更优先考虑特异性。

因为如果在测序反应中，如果引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸，会对结果对来很大的干扰甚至造成结果无法识读。

2，  Tm值适当高一些。

现在大部分测序反应均选用耐热的测序级DNA聚合酶来催化，并采用PCR的热循环程序。

选用Tm值稍高一些，甚至退火温度接近酶的最佳延伸温度的引物，有助于使反应顺利跨过待测模板的二级结构区，也有助于降低非特异反应。

四，关于引物5’端引入限制性内切酶位点。

      自从发现 Taq 酶具有非模板依赖的在新生成DNA链的3’末端加上一个A的特性以来，在引物5’端引入酶切位点从而方便后续克隆步骤的方法的应用大大减少，取而代之的是利用带T载体的粘端连接来包装PCR产物。

若实验需要在引物5’端引入相关酶切位点时，除了需要清楚所选用的酶的识别序列之外，还需要了解此酶是否有位点优势效应，即酶的活性是否因为识别位点在序列的不同位置而不同，并根据此点来选择5’末端的保护碱基。

此外保护碱基的另外一个作用就是保护酶切位点不被Taq 酶具有的微弱的5’→3’外切酶活性破坏。

五，简并引物的设计。

      简并引物是根据某些特定的目的而选用的一组混合物，指在寡核甘酸的某一位置（一个简并位）上有多个碱基存在于不同的寡核甘酸分子中，如一组简并引物中有N1，N2，N3三个简并位，在N1上有三个碱基简并，N2二个，N3 四个，则此简并引物中共有3*2*4=24种寡核甘酸分子。

简并引物常用的几个方面：

1.从已知蛋白到相关核酸分子的研究。

2.用一组引物扩增一类分子。

在上述两个主要应用中，需要注意的几个主要问题:

1.  从蛋白到核酸，应注意：

① ，尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区。

如蛋氨酸和色氨酸均只有一个密码子。

② ，充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。

③ ，引物不要终止于简并碱基，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3’末端不要位于密码子的第三位。

④ ，在简并度高的位置，可用次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。

以上几点，遵循的总的原则为：

尽量降低引物的简并度，尤其在3’末端或近3’末端。

2.用一对简并引物扩增一类DNA分子时，同样遵循上述总的原则，即尽量降低引物的简并度，尤其在3’末端或近3’末端。

       在此种应用中，应先利用工具软件（多序列对准比较软件）或其它工具找到这些分子的保守区，然后根据共有序列，应用上面所述的一些原则来设计所需要的引物。

        以上就引物设计谈了一些体会，希望能对大家有些帮助，也非常希望能得到广大网友的指正，我的email address:

 liurenhan@   

6．增加PCR的特异性：

1. primers design 

   这是最重要的一步。

理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的   一些条件

   a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量

   b. GC%   40%~~~~60%

   c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性

   d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC

   e. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER

   f. 避免3'端的错配

   g. 避免内部形成二级结构

   h. 附加序列（RT site, Promoter sequence）加到5'端, 在算Tm值时不需要加上这些序列,但在检测互补 和二级结构是要加上它们

   i. 需要使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用 较高的引物浓度（1uM-3uM）

   j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online　desgin et al.

    * 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。

这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。

在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。

合理的退火温度从55℃到70℃。

退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。

      设定Tm有几种公式。

有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。

有的是根据GC含量估算Tm。

确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。

这种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。

大部分计算机程序使用近邻分析法。

      根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。

因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。

可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。

开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。

较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

      为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。

引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。

如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃

      或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。

这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

2. stability of primers 

     定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。

     引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。

定制引物以干粉形式运输。

最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。

TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。

 引物的稳定性依赖于储存条件。

应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。

以大于10μM浓度溶于TE的引物在 -20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。

干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。

3. optimize reactants concentration 

   a. magnesiom ions

      Mg离子的作用主要是  dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用  并能影响Polymerase的活性

      一般的情况下 Mg的浓度在0.5-5mM之间调整

      同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度

      对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液

   b. 其他的离子

      NH4+ K+都会影响PCR

      增加K+的浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低了PCR的 严谨性（stringency）.

      NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER, 一种是加Mg的一种是已经混合了（NH4）2SO4的.

      当然, 过高的阳离子浓度（KCL>0.2M）时, DNA在94度根本不会发生变性, 当然也就无从谈起PCR了.

   c. polymerase

      不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握适合的酶的浓度

      一些高保真没的效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情况下, 变性的温度可以使用90~92度, 变性的时间也可以缩短,从而保证polymerase的活性

   d. template

      50ul PCR SYSTEM 

      ================================

      human gDNA             0.1ug-1ug 

      E.Coli                10ng-100ng 

      LamadaDNA              0.5ng-5ng 

      Plasmid DNA           0.1ng-10ng 

      ================================

4. termperature

   a. denaturation

      常规是94度5分钟, GC Rich的摸板是95度5分钟

      除了GC Rich外, 常规的APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟, 或者在CYCLE 1时给予较长的时间,而取消开始的denaturation

   b. annealing 

      重点到了

      一般情况下, 是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件的可以做gradient pcr.  退火的时间在30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在 annealing temp.时也会有一些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险.

      另外,在对于一些困难户, 比如从gDNA里扩增大片段, 还可使用two step PCR.

5. touchdown PCR

      原理很简单,但的确是一个很有用的方法

      举个例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度

      94  5min

      94  30s

      60  30s

      72  1min   2cycles

      94  30s

      59  30s

      72  1min   2cycles

      94  30s

      58  30s

      72  1min   2cycles

      ........

      94  30s

      51  30s

      72  1min   2cycles

      94  30s

      50  30s

      72  1min   20cycles

      72  5min

6. hot start PCR

      热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。

尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。

因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。

这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。

在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。

      限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。

这种方法 简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。

      热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。

包括延缓加入Taq DNA聚合 酶，在反应体系达到90度时，PAUSE，将温度保持在70度以上，手工加入polymerase，但这个方法 过于烦琐， 尤其是对高通量应用，并容易造成污染。

其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本 成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。

在热循环时， 因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。

有很多公司提供这样的酶。

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ampliwax PCR Gems   （Perkin Elmer） 

Taq Bead Hot Start Polymerase （Promega）

 Magnesium wax beads （Stratagene）.

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 象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。

      还有一种方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样polymerase又被激活了。

7. Booster