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论文两种氨基糖苷抗生素

两种氨基糖苷抗生素（庆大霉素和链霉素）抗体制备研究

黄秋明陈旭彦

1.材料与方法

1.1主要材料

1.1.1试剂

注射用庆大霉素（购于华农大校医院）

动物用链霉素（购于华农大兽药厂）

牛血清白蛋白（BSA）

卵血清蛋白（OVA）

弗氏完全佐剂（FCA）

弗氏不完全佐剂（FIA）

酶标羊抗小鼠

N′N－二甲基甲酰胺（DMF）

25%戊二醇、95%乙醇

30％双氧水（H2O2）

马血清

脱脂奶粉

乙酸乙酯、NHS（N-酰基琥珀酰亚胺）、EDC（碳二亚胺）、丁二酸酐、硼氢化钠、MES、二氯甲烷、考马斯亮蓝、H3PO4、三乙胺

1.1.2主要仪器

各种规格移液枪

恒温磁力搅拌器

4℃和－20℃冰箱

酶标仪

紫外分光光度计

电子天平

恒温水浴箱

冷冻离心机

旋转蒸发仪

1.1.3其它材料

透析袋（新透析袋的处理：

用蒸馏水煮沸10min，冷却至室温即可使用）

96孔酶标板

一次性注射器（1ml）

离心管

剪刀、镊子

1.1.4ELISA各种试剂的配制

（1）．包被液（0.1M、PH9.6碳酸盐缓冲溶液）：

将0.636gNa2CO3和1.172gNa2HCO3加到200ml蒸馏水中，装入试剂瓶中4℃保存备用。

（2）．PBS贮存液（PH7.4，20倍）：

4gKH2PO4,58gNa2HPO4•12H2O,4gKCl,定容到1000ml，室温贮存。

（3）．PBST洗涤液（0.01M、PH7.4）：

取上述配备的PBS贮存液100ml，加入17gNaCl，再加入1900ml蒸馏水，加入1mlTween－20，混匀，室温贮存，长期贮存期间出现浑浊，不能用，另配。

（4）．稀释液：

取100mlPBST洗涤液，加入0.1g明胶溶解，明胶比较难溶解，37℃水裕放置1小时，过滤即可，4℃下保存（一个星期内有效）。

（5）．底物缓冲液（PH5.0）：

0.933g柠檬酸，3.689gNa2HPO4•12H2O，定容到200ml，4℃贮存（1个月内有效）。

（6）．底物贮存液（发黄不可用）：

80mg邻笨二胺溶于10ml底物缓冲液中，分装贮存（0.5ml/支），怕光，操作快速，-20℃贮存。

（7）．显色液：

临用前现配，取0.5ml底物贮存液壁光快速解冻，加入9.5ml底物缓冲液，再加入16μl30％过氧化氢（H2O2），立即用，用后剩余的丢弃。

（8）．终止液（10％硫酸）：

取10ml浓硫酸，加入到90ml蒸馏水中，室温贮存。

（9）．封闭液：

2％的马血清/5g脱脂奶粉+100mlPBS+0.8gNaCl

1.2实验内容

1.2.1抗原的合成

（1）庆大霉素人工抗原：

方法一（EDC法）：

称取10mgBSA（免疫原载体）或OVA（包被抗原载体）溶于1ml蒸馏水中，然后加入32mg（0.8ml）庆大霉素得混合溶液A。

称取EDC315mg溶于1ml蒸馏水中，得溶液B，最后将A、B混合，在室温下用磁力搅拌机轻柔搅拌3h后，将反应物取出，在透析袋中用0.9％的生理盐水透析3天，每天换透析液3次。

透析好的反应物分装后，保存于-20℃冰箱中。

方法二（GDA法）：

1NHS丁二酸酯的制备：

2蛋白活化：

（2）链霉素人工抗原制备（GDA法）：

2mg/mlBSA/OVA溶于0.1M-碳酸盐和0.15M-NaCl（pH）8.5，加入DHS获得2mg/ml浓度的产物，然后加入新鲜制备的1%的戊二醛，在4℃搅拌反应3h,然后加入一定量的硼氢化钠，4℃搅拌反应1h，反应完毕，将反应物取出，4℃下在透析袋中用0.9％的生理盐水透析3天，每天换透析液3次。

透析好的反应物分装后，保存于-20℃冰箱中。

（3）在实验过程中进行了抗原方法的交叉试验，即尝试是否能制备出庆大霉素EDC抗原、庆大霉素GDA抗原、庆大霉素acc抗原；链霉素EDC抗原、链霉素GDA抗原、链霉素acc抗原。

1.2.2免疫抗原和合成抗原的合成

按照上述两种方法，分别用BSA（牛血清白蛋白）和OVA（卵血清蛋白）作为载体蛋白，合成完全抗原。

其免疫抗原分别为庆大霉素－BSA和链霉素－BSA，其包被抗原分别为庆大霉素－OVA和链霉素－OVA。

1.2.3完全抗原的鉴定

将合成的完全抗原、载体蛋白和原药按照合成的比例分别稀释到合适的浓度，然后分别对其进行紫外分光扫描，比较其图谱，分析其偶联效果。

1.2.4考马斯亮蓝法测定合成抗原蛋白质的浓度

取6支试管，按下表数据配制0～1000μl/mL牛血清白蛋白溶液各1mL

管号

试剂

1000μl/mL牛血清白蛋白溶液（mL）

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

蒸馏水（mL）

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

蛋白质浓度（μl/mL）

200

400

600

800

1000

准确吸取所配各管溶液0.1mL，分别放入10mL具塞试管中，再加入5mL考马斯亮蓝G250蛋白试剂，盖塞，将试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用10mm光径的比色杯在595nm下比色，作出标准曲线。

将合成的抗原稀释到一定浓度后按上法与考马斯亮蓝溶液反应，测定其OD值，并将测定的OD值代入标准曲线中以求出合成抗原中蛋白质的浓度。

1.2.5抗体的制备

1.2.5.1佐剂和免疫抗原的混合

将人工抗原慢慢解冻，根据完全抗原的实际浓度取出一定量，使其溶液中至少含有蛋白质100μg，然后加入等量的弗氏佐剂（第1次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂），混合物在旋涡混合器上充分振荡混合至W/O状态。

1.2.5.2动物实验

选择6只健康的Balb/c小白鼠（3只免疫庆大霉素，3只免疫链霉素），做好标记后饲养于动物房中，并按下表对小白鼠进行药物免疫。

免疫次数

免疫时间

免疫原

免疫剂量

免疫部位

——

免疫抗原和等量弗氏完全佐剂混合

100μg蛋白质

腹部、腿部肌肉

第1次免疫后两周

免疫抗原和等量弗氏不完全佐剂混合

100μg蛋白质

腹部、腿部肌肉

第2次免疫后18天

同上

100μg蛋白质

腹部

第3次免疫后三周

同上

100μg蛋白质

腹部

第4次免疫后三周

同上

100μg蛋白质

腹部

1.2.5.3血清的制备

用70％的酒精对剪刀和镊子进行消毒，同时用沾了酒精的棉花球对小白鼠的尾部末端进行消毒，用消了毒的剪刀剪下小白鼠尾部的末端，然后用4mL的离心管进行采血，采血后马上进行离心处理，然后把离心后的血液放置在4℃冰箱中静置3个小时，取上层血清分装保存于－20℃冰箱中。

1.2.6ELISA法检测抗体的抑制性

抗生素间接竞争ELISA法的原理：

将抗生素分子和大分子载体蛋白质偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体上，然后加入待测抗生素和相应的抗体，固相载体上的抗生素就和待测抗生素竞争与血清中的抗体反应。

待测抗生素含量高，则被结合在固相抗原上的抗体就少，反之，结合在固相抗原上的抗体就多。

反应后加入酶标二抗，最后通过底物显色测定OD值。

当抗体的量一定时，加入的待测抗生素量越多，与固相抗原结合的抗体就越少，发色反应减弱，抑制率增高。

反之，发色反应增强，抑制率降低。

1.2.6.1包被抗原

（1）分别取一定量的庆大青霉素－OVA和链霉素－OVA，用包被液稀释成1.0、2.0μl/ml二个浓度。

（2）将稀释后的抗原溶液以100μl/孔加入到酶标板上，4℃冰箱中放置过夜。

（3）取出，甩干，用PBST洗涤液洗3次，拍干

（4）加入封闭液200μl/孔，水浴中放置3h，甩干后用蒸馏水洗涤3次，然后放置于烘箱中2h。

1.2.6.2抗血清药效的测定

（1）根据配制药物稀释液。

（2）将动物血清稀释500倍。

（3）先在一块空板（未经包被，用蒸馏水洗涤一次，甩干）里依次加入75μl原药标液，再在每孔均加入75μl经稀释（倍比稀释）的血清，37℃温箱中孵育1h，让原药与血清先在空板上充分反应。

（4）把空板中的液体转移到包被板上，37℃温箱中孵育1h。

（5）蒸馏水洗涤3次，甩干，加入酶标二抗（1：

6000），37℃温箱中孵育1h。

（6）蒸馏水洗涤3次，甩干，加显示液，37℃温箱中显色15min，加入终止液。

（7）酶标仪测定OD值。

2实验结果与分析

2.1免疫抗原紫外分光扫描

2.1.1庆大霉素EDC紫外分光扫描

由上图可以看出，绿色和黑色曲线几乎完全重合，即是.BSA（黑色）、庆大霉素－EDC

（绿色）两者重合，所以不能很好地判断偶连是否成功，需要作进一步试验检测合作其他方面的验证，如进行质谱分析。

2.1.2链霉素EDC紫外分光扫描

由上图可以看出，绿色和黑色曲线几乎完全重合，即是.BSA（黑色）、链霉素－EDC

（绿色）两者重合，所以不能很好地判断偶连是否成功，需要作进一步试验检测合作其他方面的验证，如进行质谱分析。

从紫外扫描图谱看，如果合成的完全抗原的图谱与载体蛋白、半抗原的图谱都有所不同，同时，完全抗原最大吸收峰波长与载体蛋白、半抗原的比较也不同，这说明合成的产物是不同于载体蛋白和半抗原的物质，也就是载体蛋白和半抗原的复合物。

从图谱上可以看出，庆大霉素－BSA的图谱和链霉素与－BSA偶联效果不够明显，因此下一步的实验也存在一定的不确定性。

2.2考马斯亮蓝法测定合成抗原蛋白质的浓度

考马斯亮蓝标准曲线如下图所示：

图3考马斯亮蓝蛋白质标准曲线

由上图可得回归方程：

y=0.009x,x为蛋白质浓度，y为吸光值。

则有：

庆大霉素－BSA的OD值为0.687，则其蛋白质浓度为763.333μg/mL

链霉素－BSA的OD值为0.846，则其蛋白质浓度为940.000μg/mL

庆大霉素－OVA的OD值为0.709，则其蛋白质浓度为787.778μg/mL

链霉素－OVA的OD值为0.623，则其蛋白质浓度为692.223μg/mL

2.3ELISA法检测抗体的抑制性

2.3.1庆大血清检测

2.3.1.1检测1μg/ml的药物（用1μg/ml的包被浓度）

表1庆大霉素EDC血清检测结果（1μg/ml）

血清稀释倍数

500X

1000X

20000X

40000X

80000X

160000X

32000X

64000X

加药物（1μg/ml）

1.001

0.618

0.474

0.321

0.171

0.115

0.11

0.065

不加药物

1.506

1.091

0.727

0.512

0.272

0.162

0.111

0.053

由上图可知，庆大霉素EDC血清通过添加药物和不加药物的对照实验，发现两者的吸光值有明显的差距，不加药物的血清吸光值均比加药物的强，说明血清中含有庆大霉素EDC抗体。

2.3.1.2检测1μg/ml的药物（用1μg/ml的包被浓度）

表2庆大霉素GDA血清检测结果（1μg/ml）

血清稀释倍数

400X

800X

1600X

3200X

6400X

12800X

256000X

加药物（1μg/ml）

0.591

0.503

0.392

0.244

0.182

0.127

0.101

不加药物

0.713

0.594

0.431

0.297

0.255

0.136

0.105

阴性血清

0.050

0.05

0.045

0.039

0.044

0.040

由上图可知，庆大霉素GDA血清通过添加药物和不加药物的对照实验，另外通过阴性血清的检测排除系统误差，发现两者的吸光值有一定的差距，不加药物的血清吸光值均比加药物的强，但是由于吸光值都不是很大，最大只有0.713，而且加药物和不加药物的差距并不是很大，说明血清中可能含有庆大霉素GDA抗体。

2.3.1.3检测1μg/ml的药物（用1μg/ml的包被浓度）

表3庆大霉素acc血清检测结果（1μg/ml）

血清稀释倍数

500×

1000×

2000×

4000×

8000×

16000×

32000×

加药物（1μg/ml）

0.263

0.192

0.126

0.079

0.072

0.055

0.047

不加药物

0.317

0.204

0.136

0.075

0.060

0.048

0.043

阴性血清

0.056

0.057

0.052

0.047

0.046

0.0386

由上图可知，庆大霉素GDA血清通过添加药物和不加药物的对照实验，另外通过阴性血清的检测排除系统误差，发现两者的吸光值有差距，但是由于吸光值都不是很大，最大只有0.713，而且加药物和不加药物的差距并不是很大，有可能是系统误差，因此不能确定血清中是否含有庆大霉素GDA抗体。

从以上3种制备庆大霉素抗体方法的数据和直观图可以看出，通过EDC方法制备的庆大霉素抗原在动物（小鼠）体内获得了免疫反应，在血清鉴定当中有较明显的效果。

但是GDA、ACC两种方法并没有取得很好的效果，需要进一步检测。

因此，初步判断EDC方法是可行的，下一步工作将是EDC方法的重复验证和和优化。

2.3.2链霉素血清检测

2.3.2.1检测1μg/ml的药物（用1μg/ml的包被浓度）

表4链霉素EDC血清检测结果（1μg/ml）

血清稀释倍数

500×

1000×

2000×

4000×

8000×

16000×

32000×

64000×

加药物（1μg/ml）

0.235

0.189

0.138

0.111

0.118

0.084

0.058

0.052

不加药物

0.259

0.224

0.205

0.125

0.101

0.081

0.073

0.047

阴性血清

0.053

0.056

.050

0.045

0.044

0.048

0.054

由上图可知，链霉素EDC血清通过添加药物和不加药物的对照实验，另外通过阴性血清的检测排除系统误差，发现两者的吸光值有一定的差距，不加药物的血清吸光值前4个点比加药物的强，但是后4个点反而比加药物的弱，而且吸光值都不是很大，最大只有0.235，而且加药物和不加药物的差距并不是很大，完全可以认为是系统误差造成的，说明血清中可能含有链霉素EDC抗体，即需要改善各种条件，作进一步检测，如果检测结果均没有很好的效果即可判定此方法不可行。

2.3.2.2检测1μg/ml的药物（用1μg/ml的包被浓度）

表5链霉素GDA血清检测结果（1ug/ml）

血清稀释倍数

500×

1000×

2000×

4000×

8000×

16000×

32000×

64000×

加药物（1μg/ml）

1.522

1.443

1.146

0.908

0.528

0.468

0.261

0.067

不加药物

1.637

1.466

1.332

1.072

0.581

0.549

0.357

0.067

阴性血清

0.053

0.056

.050

0.045

0.044

0.048

0.054

由上图可知，链霉素GDA血清通过添加药物和不加药物的对照实验，另外通过阴性血清的检测排除系统误差，发现两者的吸光值有一定的差距，不加药物的血清吸光值均比加药物的强，吸光值最大有1.637，总体吸光值较大，而且加药物和不加药物有一定差距，说明血清中可能含有链霉素EDC抗体，但仍需要改善各种条件，作进一步检测。

2.3.2.3检测1μg/ml的药物（用1μg/ml的包被浓度）

表6链霉素acc血清检测结果（1μg/ml）

血清稀释倍数

500×

1000×

2000×

4000×

8000×

16000×

加药物（1μg/ml）

0.369

0.288

0.169

0.133

0.098

0.083

不加药物

0.456

0.378

0.210

0.125

0.096

0.069

阴性血清

0.065

0.055

0.051

0.052

0.060

0.052

由上图可知，链霉素acc血清通过添加药物和不加药物的对照实验，另外通过阴性血清的检测排除系统误差，发现两者的吸光值有一定的差距，不加药物的血清吸光值前2个点比加药物的强，但是后6个点反而比加药物的弱，而且吸光值都不是很大，最大只有0.456，而且加药物和不加药物的差距并不是很大，完全可以认为是系统误差造成的，说明血清中不一定含有链霉素EDC抗体，即需要改善各种条件，作进一步检测，如果检测结果均没有很好的结果即可判定此方法不可行。

从以上3种制备链霉素抗体方法的数据和直观图可以看出，通过GDA方法制备的庆大霉素抗原在动物（小鼠）体内获得了免疫反应，在血清鉴定当中有较明显的效果。

但是EDC、ACC两种方法并没有取得很好的效果，需要进一步检测。

因此，初步判断GDA方法是可行的，下一步工作将是GDA方法的重复验证和和优化。

3总结

从本实验结果来说，基本上达到了预期目的，基本上掌握了如何开展科学研究的方法，为以后的研究奠定了基础。

但由于各方面原因，没有取得可喜的成绩，现总结如下：

1、要坚持认真的实验态度。

对遇到的问题不能操之过急，应该仔细分析问题出现的原因，查阅有关资料，提高解决问题的能力，知难而上，而不是遇难而退。

2、开始试验前要掌握一定的实验研究方法和技巧，这样就可以在实验开始阶段能马上进入状态。

另外最重要的是查阅相关文献，吸取别人的研究经验，少走弯路，在别人的研究基础上加以创新。

3、由于这是个新颖的课题，只能一步一步地走，难度相当大，最终所得抗体性能不够理想。

4、整个实验过程应该都是专业学习和实际相结合的综合运用，但是我们并没有做到这一点，在以后的研究当中需要加强这一点。

经过半年多的实验，的确使我们获益良多，在各方面包括学习和做事等能力获得了很大的提升，回顾一步一步地走过来的实验历程，每走一步就是一点提升，这就是付出与回报。

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