硼酸半数致死量实验.docx
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硼酸半数致死量实验
药物半数致死量（LD50）实验设计
一、实验目的
1、通过实验了解LD50的测定方法、步骤、计算过程，并理解其药理学意义。
2、了解药物的浓度与毒性反应之间的关系，为新药筛选、临床安全用药及药物不良反应的监测提供参考。
二、方法与步骤
实验药品：
硼酸
实验动物：
大白鼠或小白鼠100只
器材：
电子秤，注射器，灌胃针（16号），注射器（0.25，1，2，5ml），吸管（0.1，0.2，0.5，1，2，10ml），容量瓶（10，25，50ml），烧杯（10，25，50ml），滴管，外科剪，镊子等
1、实验动物的选择
实验动物的体重、年龄、性别、生理状态、健康及营养状况等亦是影响外源化学毒性的重要因素，急性毒性实验时也必须认真选择。
要求选用初成年的动物，用于测定LD50的动物体重大鼠为180-200g/小白鼠18-22g左右，用于实验的同一批动物体重变异不得超过所用动物园平均体重的10%，否则势必影响实验结果的准确性。
原则要求雌雄动物各半，当外源化学物的毒性有明显的性别差异时，则要求选用雌、雄两种性别的动物分别进行实验，求出各自的LD50。
用于急性毒性实验的所有动物要求是未交配和未受孕的动物，实验前应进行1-2周的检疫。
按规定大/小鼠每组雌雄5只，经选择后用于实验的动物要有明显的标记，以便观察。
经口染毒时，为避免胃内容物干扰化学物的吸收有毒性，染毒前必须禁食，大鼠主要在夜间采食，应隔夜禁食，或停食6-8h，染毒后2-4h复食，禁食时间不宜过长，因动物饥饿也可影响实验结果。
2、实验动物的饲喂环境
环境因素对实验结果影响很大，饲养室内氨浓度对毒性实验结果有重要影响，一般要求室温控制在22±3℃,饲养密度适当，10只大鼠2-3m3，要求无对流风，人工昼夜（12h白昼，12h黑夜）环境。
3、实验动物的染毒途径
实验药物采用灌服，采用大（小）鼠专用灌胃针或20-24（16号注射针）号腰穿针，抓取动物固定成垂直体位，腹部面向操作者，使动物上消化道成一直线，大鼠进针4-6cm（小鼠进针2.5-4cm），灌胃容量1-4ml（小鼠0.2-1ml），特别防止插入气管。
给药顺序：
宜采取间隔跳组方法。
如共7组，先按2、4、6组顺序给药，然后逆行按7、5、3、1组的顺序给药这样可避免药物放置过久或动物饥饿造成的偏向性误差。
而且当第3组给药后，如第2组动物已经全死，则可省下第1组动物及1号药液。
如第7组已死亡，可补做第8组，争取做出0﹪死亡率的组来。
注：
大、小鼠按体表面积折算的等效剂量比为：
大鼠:
小鼠=1:
7
3.1小鼠经口灌胃给药方法
先保定动物,即用右手将小鼠尾巴提起，置于鼠笼或粗糙的平面上，当小鼠向前挣扎时，用左手的拇指和食指捏住小鼠两耳后颈背皮肤，翻转小鼠置于掌心，拉直后肢，以小指压住小鼠尾巴即可。
在保定小鼠过程中，不要用力过大，勿握其颈部，以免窒息死亡。
以灌胃器轻轻压其头部，使口腔与食道成一条直线，再将灌胃针沿上腭壁轻轻进入食道，当灌胃针进入约3cm左右时即达胃内。
如果灌胃针的位置插入正确，小鼠可自行吞服药，灌胃针插入位置不正确，小鼠会强烈挣扎，必须拔出重插，否则可能将药物灌入气管，造成小鼠死亡。
注完药液后轻轻抽出灌胃针。
小鼠一次最大灌胃量为：
0.4ml/10g.w。
3.2大鼠经口灌胃给药方法
大鼠的捕捉方法与小鼠基本相同。
根据长期的实践经验，我们发现如用一块湿的纱布盖在大鼠身上，既可以防滑，又可以给初学者一种安全感。
为了防止大鼠咬伤，应戴上帆布手套。
大鼠体型较大，所以不能象保定小鼠那样可以把尾巴压住。
同样在保定大鼠时不能用力过大和握其颈部，尤其在采取抓握保定大鼠时，要特别注意。
大鼠灌胃的关键是左手把大鼠头部固定好，使其头不能随意摆动。
其他操作方法与小鼠基本相同。
灌胃针进入深度为5cm左右。
大鼠一次灌胃最大容量2ml/100g.w。
注意事项：
保定动物时，一定要固定好动物，使动物头不要随意摆动，但不能挤捏颈部。
灌胃器针头弧度面向前从动物右角处插入，灌胃动作要轻柔。
不能虐待动物，尤其是大鼠，否则，容易被其咬伤。
插入灌胃针时，如果遇到阻力，不能用力继续进针，应停止进针，等待其自动吞咽时，迅速进针。
否则，容易损伤动物食道。
3．3人中毒临床表现
（1）急性中毒硼酸属低毒类物质，其溶液有弱杀菌能力，少量服用时呈现和缓的生理作用：
大量服用时可引起休克，损害中枢神经。
急性中毒多因误服或经破损皮肤吸收引起，通常在48h内发病。
主要表现有胃肠道症状：
恶心、呕吐、腹痛、腹泻、严重者呕吐物中带血，甚至发生血便，频繁腹泻至脱水、休克：
神经系统症状；头晕、头痛、烦躁不安、亦有患者出现高热、抽搐、角弓反张，甚至昏迷；肝、肾损害：
黄疸、肝功能异常，少尿、无尿或急性肾功能衰竭；皮肤损害；多数病例出现皮肤斑点疹，以四肢、足心、手掌、面部、颈部为主，少数可有剥脱性皮炎；尿硼：
含量增高。
（2）动物慢性中毒实验表明，硼酸能穿透胎盘，影响雌性动物性周期和生育功能，大剂量可导致不育。
4、实验流程
实验流程
前期准备：
查找资料，准备实验用品和饲养场地，熟悉实验动物的饲养环境包括消毒、温控、饮水、饲料等，实验组各人员要熟悉掌握整个实验过程，做好实验前一切准备。
实验动物的购买：
严格按照实验需要购买实验动物，并适应饲养一周左右。
预实验：
按实验用鼠标准将7大/小鼠分7组，每组2-4只，分别为实验一组、实验二组、实验三组、实验四组、实验五组、实验六组、实验七组，分别给药，摸索出0%最高致死量和100%最低致死量，以此为依据设计正式实验的剂量和分组。
正式实验：
大鼠70只，随机分7组→灌服不同浓度的硼酸→按要求记录组实验动物的活动情况。
并根据需要对实验动物进行剖检，取材和相应的检验。
实验结果：
根据需要从宏观和微观方面观察实验动物的病理变化，分析统计实验数据，撰写实验报告。
实验设计的原则是：
各组剂量按等比级数；各组动物数相等；大致有一半组数的动物死亡率在10-50%之间，另一半在50-100%之间，最好出现0和100%的剂量组。
药物急性毒性的强度：
根据化学物质的急性毒性的分级标准（WHO，1977）：
ig大、小鼠LD50（mg/kg），极毒（<1）、剧毒（1-50）中等毒（51-500）低毒（501-5000）实际无毒（>5000）。
急性毒性实验一般设5-7个剂量组。
6、实验记录
表1急性毒性实验原始记录
受试物名称：
受试物性状：
受试物来源：
动物种属品系：
动物来源及合格证号：
染毒途径：
室温：
日期：
剂量组别（mg/kg）
动物编号
性别
体重（g）
染毒量（ml）
染毒时间
体征及出现时间
死亡时间
体重记录
实验操作者：
实验记录者：
例表2剂量比值及分组组数选择表
剂量比值1:
k
k=
0.6
0.65
0.7
0.75
0.8
0.85
0.88
0.9
对数剂量差i=-lgk
i=
0.222
0.187
0.155
0.125
0.097
0.070
0.055
0.046
最高最低致死量相差的倍数b/a
2倍左右
---
---
---
3-4
4
5-6
6-7
7-8
3倍左右
---
3-4
4
4-5
6
7-8
9-10
---
4倍左右
3-4
4-5
5
5-6
7-8
9-10
---
---
6倍左右
4-5
5-6
6
7-8
9
---
---
---
9倍左右
5-6
6
7-8
8-9
10
---
---
---
10倍左右
6
6-7
8
9-10
---
---
---
---
14倍左右
6-7
7
8-9
10
---
---
---
---
实验期限及观察指标
急性毒性实验的观察期限为7-14d，实验中应观察记录发生各种中毒症状的时间、症状表现程度、发展过程、死亡前特征和死亡时间等。
实验期间，体重可以反应动物中毒后的整体变化，一般3-5d测量体重一次。
重点观察和记录各个剂量组动物的死亡数以及每只动物的死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间，分析中毒的规律，将对深入研究该化学物的毒理机制给予启迪。
病理学检查及其他指标：
应及时剖检死亡动物，肉眼观察主要脏器的大小、外观、色泽、有无充血、出血、水肿或其他改变，对有病理变化的组织及脏器应做组织病理学检查，实验结束后，对各剂量组存活动物都应做大体病理剖检，必要时做组织病理学检查。
急性毒性试验观察的动物（定性）反应指标
CNS及肌肉神经系统：
呆滞：
对刺激反应迟缓、减弱、消失；
不安：
对刺激反应过敏；兴奋：
强直：
行动姿势改变、叫声异常、震颤、共济失调。
植物神经系统：
瞳孔缩小、放大：
分泌增多如流涎、流泪、出汗。
呼吸系统：
流涕，呼吸缓慢、困难，潮式呼吸，速率加快，腹式呼吸等。
心血管系统：
心动过速、缓慢，心律失常，心跳过强，心跳微弱。
消化系统：
气胀，腹泻，便秘，粪便不成形，黑便等。
生殖系统：
阴部或乳腺肿胀，污秽分泌物，阴囊下垂，阴茎突出，遗精等。
皮毛：
皮肤发红、充血，紫绀，松弛，皮疹，毛竖起、污秽。
眼睛：
上睑下垂，眼球突出，角膜浑浊、充血，有分泌物。
其它：
肛温升高、降低，消瘦，拒食等。
4、LD50的计算
当实验的最大剂量死亡率为100%，最小剂量死亡率为0，各组动物数相等，各剂量组的组距等比或剂量对数等差时，用公式一计算LD50：
LD50=lg-1[Xm-i（∑p-0.5）]（公式一）
3-Pm-Pn
当不含0和100%死亡率时，且最低剂量组死亡率Pn<20%,最高剂量组死亡率Pm>80%时，用公式二计算LD50：
4
LD50=lg-1[Xm-i（∑p-————）]（公式二）
Sx50=i
如果Pn<20%或Pm>80%需用校正公式计算；如Pn>20%或Pm<80%：
校正公式：
lgLD50＝lgXm－lgi（∑P-
）
LD50的95%可信限=lg-1（lgLD50±1.96×Sx50）
以上各式中：
i——组距，即相邻两组剂量对数剂量之差
Xm——最大剂量对数
P——各剂量组死亡率（死亡率均用小数表示）
Pm——最高死亡率
q——各组剂量存活率，q=1-p
Pn——最低死亡率
∑p————各剂量组死亡率之和
n——各组动物数
Sx50——lgLD50的标准误
例表3九灵胃康在小鼠的经口急性毒性实验结果
组别
动物数（n）
剂量
死亡数（n）
死亡率（p）
存活率（q）
P·q
g/kg
对数
1
10
2.07
0.3160
0
0.0
1.0
0.00
2
10
2.69
0.4298
2
0.2
0.8
0.16
3
10
3.50
0.5441
3
0.3
0.7
0.21
4
10
4.55
0.6580
5
0.5
0.5
0.25
5
10
5.92
0.7723
8
0.8
0.2
0.16
6
10
7.69
0.8859
10
1.0
0.0
0.00
i=0.11∑p=2.8
以普鲁卡因为例描述实验过程
1、预试0和100%估计致死量（Dn，Dm）
小鼠20只，每组4只，10倍稀释普鲁卡因溶液，配制成不同浓度的一系列药液，在预试中以0.2ml/10g体重腹腔注射，求出一次给药后24小时死亡率为0的最大剂量（Dn）和100%的最小剂量（Dm）分别用0/4与4/4致死量，递增或递减一定比例的剂量，找出0和100%死亡剂量的所在范围
选择合理的剂量分组方案
经预试找到Dm和Dn值后，即可在此剂量范围内，按等比级数分成5－8个剂量组，并按下式计算各组剂量的公比（r或1/k）及分组组数（N）：
公比r或1/k=（N－1）
；一般k值多采取0.75－0.85，不宜超过0.6－0.9。
设本次实验分为6组，经计算k值为0.837，故各组剂量为Dmk1、Dmk2、Dmk3、Dmk4、Dmk5、Dmk6。
在预实验所获得的0和100%致死量范围内，选用几个剂量，尽可能使半数组的死亡率都在50%以上，另半数组的死亡率都在50%以下。
各组动物的只数应相等，每组10只，动物的体重和性别要均匀分配。
完成动物分组和剂量计算后，按组腹腔注射给药。
最好先从中剂量组开始，以便能从最初几组动物接受药物后的反应来判断两端的剂量是否合适，否则可随时进行调整。
随机分组
选体重20g左右小鼠60只，雌雄兼用，每组10只。
雌雄分开，分别称重标色，每一档体重即为一配伍组。
于不同部位标以颜色（如黄头、黄背等）根据随机单位组设计分组法将配伍组中的每只小鼠随机分配到各组中去。
并将各组编号。
同时可制作色标用药表，如黄头（20g）用0.4ml，黄背（21g）0.42ml.......，以后无论何组均按色标决定用药剂量。
4、配制等比药液：
低比系列稀释法
本法简便、快捷、准确，不易出错而且节省药物。
例：
已知Dmax＝100mg/kg，Dmin＝49mg/kg，r＝0.8387，动物体重为20±2g，每组10只，总重为200g，用药量为0.2ml/10g（腹腔）。
（1）一号药液浓度＝最高致死量/用药液量
＝100（mg/kg）/20（mg/kg）
＝5mg/ml＝0.5%
（2）每组药液量＝每组动物总量×用药液量
＝200g×0.02ml/g＝4ml（为留余地本例取5ml）
（3）一号药液需用量＝每组药液量/（1－r）
＝5ml/（1－0.837）＝30.67ml
（4）精确配制0.5%药液约31ml，从中吸取5ml为一号液，供第一组用药。
配二号药液：
在余下的26ml一号液中生理盐水5ml，混匀后吸出5ml为二号液，依次类推，配出一系列比值1：
0.837的药液。
5、随机确定各组给药剂量
将动物组别按甲、乙、丙、丁.......顺序排列
查阅随机数字表，以随机确定各组动物的给药剂量
药液容量均为0.2ml/10g，腹腔注射
正式实验
小鼠60只，随机分6组→腹腔注射不同浓度的普鲁卡因→记录24h内各组10只/组，雌雄各半0.2ml/10g的死亡数。
实验结果记录与分析
记录小白鼠的死亡情况。
试验结果，最大剂量组的反应率最好等于或接近100%，最小剂量组的反应率最好等于或接近0，若有两个剂量出现100%或0的反应率时，须将过大或过小的一剂量组剔除。
随后计算LD50及其95%可信限。
以药物剂量为横轴，小鼠死亡率为纵轴，在坐标纸上绘制普鲁卡因剂量与小鼠死亡率曲线。
LD50的计算方法
表4改良寇氏法
组别
动物数（n）
剂量（mg/kg）
对数剂量（X）
死亡率（P）
死亡率平方
1
10
161.00
2.207
0.1
0.01
2
10
179.00
2.253
0.1
0.01
3
10
197.00
2.294
0.3
0.09
4
10
216.00
2.334
0.6
0.36
5
10
238.00
2.377
0.9
0.81
6
10
262.00
2.418（Xm）
1.0
1.00
1、Xm:
最大剂量组剂量的对数值
i:
相邻两组剂量高剂量与低剂量之比的对数
P:
各组动物的死亡率，用小数表示
∑P:
各组动物死亡率
2、Xm=2.413i=0.042∑P=3.000∑P2=1.5927
3、公式:
LD50=lg-1[Xm-i（∑P-0.5）]
标准误Sx50=i[∑P-∑P2/（n-1）]
95%可信限=LD50±4.5LD50×Sx50
表5实验结果计算
组别
浓度（mg/kg）
浓度对数
动物总数
死亡动物数
死亡率（P）
死亡率平方（P2）
剂量一
262
2.418
10
10
1.000
1.000
剂量二
238
2.337
10
9
0.900
0.810
剂量三
216
2.334
10
6
0.600
0.360
剂量四
197
2.294
10
3
0.300
0.090
剂量五
179
2.253
10
1
0.100
0.010
剂量六
161
2.207
10
1
0.100
0.010
Xm=2.4183i=0.0417∑P=3.000∑P2=2.280
LD50=lg-1[2.4183-0.0417（3-0.5）]
=lg-12.308
=203.2mg/kg
补
例：
配制等比稀释药液系列
使每只小鼠给药容量相等，一般为0.1-0.25mL/10g。
母液浓度C=Dm/等容注射量，如某药的Dm=187.5mg/kg，等容注射量为0.2mL/10g，则母液浓度C=187.5（mg/kg）/0.2（mL/10g）=0.94%。
按此配制母液25mL放入5号小烧杯，即为5号液；从中吸出20mL放入4号小烧杯，加水至25mL，即为4号液；再吸出20mL4号液放入3号杯中，加水至25mL，即为3号液，如此类推，配制出2号液和1号液。
2）当最小剂量组的死亡率大于0％而又小于30％，或最大剂量组的死亡率小于100％而又大于70％时，可按下列校正公式计算：
式中Pm―最大剂量组的死亡率； Pn―最小剂量组的死亡率。
按体表面积折算的等效剂量比
用药剂量
大鼠
小鼠
升级会员 