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1、临床医学检验主管技师考试辅导221血栓与止血检验的基本方法一、一期止血缺陷筛查试验要点1：出血时间（bleeding time，BT）（1）原理：测定在皮肤受特定条件外伤后，出血自然停止所需的时间即为出血时间。BT反映了毛细血管与血小板的相互作用，包括内皮下组织与血小板黏附（通过vWF的作用）、血小板的聚集和释放等反应，以及PGI2与TXA2的动态平衡。（2）临床意义出血时间延长见于血小板减少症；先天性血小板功能异常，如血小板无力症、血小板贮存池病；获得性血小板功能异常，如尿毒症、药物影响、异常蛋白血症、骨髓增生性疾病；血管性血友病；遗传性血管周围结缔组织病如艾-唐综合征。一般凝血因子缺乏出血

2、时间不延长，但某些严重的因子缺乏（如因子和）及无纤维蛋白原血症可以延长。出血时间缩短见于某些严重的高凝状态和血栓性疾病。此外，出血时间还广泛用于外科手术前的出血筛选和抗血小板药物的监控，以免发生出血。（3）注意事项试验前一周患者应停服阿司匹林、噻氯吡啶等抗血小板的药物。要点2：束臂试验（tourniquet test或capillary fragility test，CFT）（1）原理通过前臂局部加压，使静脉血流受阻，给予毛细血管以负荷，观察前臂皮肤一定范围内新出现的出血点数目，来估计血管壁的完整性及其脆性。（2）参考值5cm直径圆圈内新出血点的数目：男性少于5个；女性及儿童少于10个。（3）

3、临床意义新出血点的数目超过正常为阳性，见于血管壁结构和（或）功能缺陷，如：遗传性出血性毛细血管扩张症、过敏性紫癜、单纯性紫癜及其他血管性紫癜。血小板的量和（或）质异常，如：原发性和继发性血小板减少症、血小板增多症、先天性（遗传性）和获得性血小板功能缺陷症。血管性血友病（vWD）。二、二期止血缺陷筛查试验要点3：凝血酶原时间测定（prothrombin time，PT）（1）原理：在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶（人脑、兔脑、胎盘及肺组织等制品的浸出液）和钙离子，使凝血酶原变为凝血酶，后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。观察血浆凝固所需时间即凝血酶原时间。该试验是反映外源凝血系统最常用的筛选试验。

4、（2）参考值及报告方式直接报告患者及正常对照的PT秒数。参考值为1114s，超过正常3s为异常。报告凝血酶原时间比值（prothrombin time ratio，PTR）：PTR受检者PT（s）/正常对照PT（s），宜用多份正常人血浆PT的几何均数，或其混合血浆的PT，参考值为10.15。报告国际标准化比值（international normalized ratio，INR）需先求得所用组织活酶的国际敏感度指数（internatinal sensitivity index，ISI），它是所用组织凝血活酶与ISI已知的国际参比品（international reference prepara

5、tion）或经其标定过的参比品之间敏感度相比较的一个参数。测定方法是用多份凝血因子水平不同的血浆（包括正常人和口服抗凝剂患者的血浆），用参比品测得它们的PT的对数（log PT），再用待标定的组织凝血活酶测得它们的log PT，以前者为纵坐标，后者为横坐标作图，经回归求得直线斜率。则待标定的组织凝血活酶的ISI=已知ISI斜率。ISI值越低，试剂对有关凝血因子降低的敏感度越高。再按下式求得INR：INRPTRISI（3）临床意义PT延长见于遗传性外源凝血系统的因子、和纤维蛋白原减低，但均很少见。肝脏疾病：由于外源性凝血因子主要在肝脏合成，因而肝脏疾病时，PT延长。维生素K缺乏症胆石症、胆道肿瘤

6、、慢性肠炎、偏食、27个月龄的新生儿以及长期服用广谱抗生素的患者等，由于维生素K吸收或合成障碍，导致肝脏合成异常的凝血酶原、F、F、F等分子，PT延长。血液循环中抗凝物质增加，如肝素或FDP增多等。DIC和原发性纤溶时，由于FDP生成增加，FDP有较强的抗凝能力，故使PT延长。用于香豆素类等口服抗凝剂的监控，一般认为以维持PT值在参考值的2倍左右（1.32.5倍）即2530s，或PTR为1.31.5（最大不超过2），INR以2.03.0为宜。PT缩短见于口服避孕药、高凝状态和血栓性疾病等。（4）注意事项HCT影响：不同患者HCT不同，导致血浆量多少不一，因此游离的Ca2浓度不同，从而导致PT结

7、果异常。对于HCT35%和55%的患者，采血量或抗凝剂用量按下述公式计算。采血量（ml）=抗凝剂用量（ml）9（10.45）/（1HCT）。血浆标本离心相对离心力1500g、离心10min制备乏血小板血浆，若血浆中富含有血小板，PT将假性缩短。溶血、脂血标本：若溶血，由于红细胞中有促凝成分，可使PT假性缩短；脂血干扰某些仪器检测过程中的浊度变化，因此会引起PT检测结果的异常。要点4：活化部分凝血活酶时间测定（activated partial thromboplastin time，APTT）（1）原理：37条件下，以白陶土激活因子和，以脑磷脂（部分凝血活酶）代替血小板第三因子，在Ca2参与下

8、，观察乏血小板血浆凝固所需的时间，即为活化部分凝血活酶时间，是内源凝血系统较敏感和常用的筛选试验。（2）参考值男性：（373.3）（31.543.5）s；女性：（37.52.8）（3243）s。受检者的测定值较正常对照延长超过10s以上才有病理意义。（3）临床意义：对内源凝血途径因子（、）缺乏较CT敏感（血小板异常不影响APTT），能检出：C小于25%的轻型血友病。对凝血酶原、纤维蛋白原缺乏则不够敏感，故APTT延长的最常见疾病为血友病。此时可作纠正试验，即于患者血浆中加入1/4量的正常新鲜血浆、硫酸钡吸附血浆或正常血清（试剂参见凝血酶原消耗试验的纠正试验），再作APTT，如正常血浆和吸附血浆

9、能纠正延长的结果而血清不能纠正，则为因子缺乏；如吸附血浆不能纠正，其余两者都能纠正，则为因子缺乏；如三者都不能纠正，则为有病理性循环抗凝物质。在使用肝素治疗时，多用APTT监测药物用量，一般以维持结果为基础值的2倍左右（1.53.0倍）为宜（75100s之间）。但应事先检测所用部分凝血活酶试剂是否对肝素敏感，即向正常人血浆中加入不同量肝素（从每毫升0.11.0IU），看其APTT是否相应延长。血管性血友病由于患者vWF缺陷，使F不稳定，导致F：C活性减低，故APTT延长。不同类型vWDF：C活性降低不一样，故APTT延长的程度也不同。异常抗凝物增多血友病A患者长期输注F，可产生F抑制物，引起A

10、PTT延长。一些患者存在狼疮抗凝物（LAC），使APTT延长。纤溶亢进：原发性和继发性纤溶亢进（如DIC），产生大量的FDP，使APTT延长。三、血管壁检验要点5：血管性血友病因子检测（vWF）vWF是一种大分子蛋白多聚体。vWF的测定包括含量测定、功能分析，必要时还可进行基因诊断。vWF瑞斯托霉素辅因子活性检测在瑞斯托霉素存在的条件下，vWF通过与血小板膜GPb-相互作用使正常血小板发生凝集。凝集的强度与被检血浆中vWF的含量和结构有关。临床意义（1）vWF减低：主要用于vWD的诊断和分型。（2）vWF增高：vWF是一种急性时相反应蛋白，很多情况下都增高，常见于血栓性疾病（如心肌梗死等）、肾

11、小球疾病、糖尿病（DM）、妊娠期高血压疾病及大手术后。要点6：血浆6-酮-前列腺素F1（6-Keto-PGF1）检测临床意义减低：见于血栓性疾病，如急性心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、糖尿病、动脉粥样硬化、肿瘤转移、肾小球病变、周围血管血栓形成及血栓性血小板减少性紫癜等。四、血小板检验要点7：血小板生存时间（platelet survival time，PST）本试验可反映血小板生成与破坏之间的平衡，但在血小板计数过低时本法的敏感性较差。血小板生存期缩短，见于：血小板破坏增多性疾病：如原发性血小板减少性紫癜、同种和药物免疫性血小板减少性紫癜、脾功能亢进、系统性红斑狼疮；血小板消耗过多性疾病：如D

12、IC、血栓性血小板减少性紫癜（TTP）、溶血尿毒症综合征（HUS）；血栓性疾病：如心肌梗死、心绞痛、糖尿病伴血管病变、深静脉血栓形成、肺梗死、妊娠期高血压疾病（妊高症）、恶性肿瘤。要点8：血小板相关免疫球蛋白（platele associated immunoglobulin，PAIg）检测PAIg增高：见于ITP，90%以上ITP患者的PAIgG增高，若同时测定PAIgM、PAIgA和PAC3，其灵敏度可高达100%。但其特异性较低，许多疾病如同种免疫性血小板减少性紫癜（多次输血、输血后紫癜）、药物免疫性血小板减少性紫癜、恶性淋巴瘤、慢性活动性肝炎、系统性红斑狼疮、慢性淋巴细胞性白血病、多发

13、性骨髓瘤、Evan综合征、良性单株丙球蛋白血症等也有不同程度的升高，因此，PAIg只能作为筛查指标。要点9：血小板聚集试验（platelet aggregation test，PAgT）（1）原理（浊度法）在富含血小板血浆（PRP）中加入致聚剂，血小板发生聚集，血浆浊度变化，透光度增加，血小板聚集仪将这种浊度变化转换为电信号并记录，形成血小板聚集曲线。根据血小板聚集曲线可了解血小板聚集的程度和速度。电阻法（阻抗法）是根据电阻抗原理，通过放大、记录浸泡在全血样品中电极探针间的微小电流或阻抗的变化来测定全血样品血小板聚集性的方法。近年来，出现了一种采用激光散射法进行血小板聚集检测的仪器。血小板聚集

14、图（2）参考范围ADP（1.Ommol/L）ADP（0.5mmol/L）肾上腺素（0.4mg/L）胶原（3mg/L）瑞斯托霉素（1.5g/L）2A（%）52.714.531.611.537.012.943.519.473.817.04A（%）60.717.834.615.361.018.970.619.687.511.4MA（%）62.716.137.414.367.817.871.719.387.511.4TMA（%）211.372.5146.287.5296.470.5250.234.5239.430.9T50（s）35.112.126.619.7109.453.8110.516.858.

15、023.5Dt（s）57.021.576.824.276.948.6S（度）60.68.849.713.143.89.756.013.963.410.7注：2A：2min的聚集率；4A：4min的聚集率；MA：最大聚集率；TMA达到最大幅度的时间；T50%：达到1/2最大幅度的时间；Dt：延迟时间；S：斜率（3）临床意义1）PAgT增高反映血小板聚集功能增强。见于高凝状态和（或）血栓前状态和血栓性疾病，如心肌梗死、心绞痛、糖尿病、脑血管病变、妊娠高血压综合征、静脉血栓形成、肺梗死、口服避孕药、晚期妊娠、高脂血症、抗原抗体复合物反应、人工心脏和瓣膜移植术等。2）PAgT减低反映血小板聚集功能减低

16、。见于获得性血小板功能减低，如：尿毒症、肝硬化、MDS、原发性血小板减少性紫癜、急性白血病、服用抗血小板药物、低（无）纤维蛋白原血症等。还见于遗传性血小板功能缺陷，不同的血小板功能缺陷病对各种诱导剂的反应不同。血小板无力症（Glanzmann病）：ADP、胶原和花生四烯酸诱导的血小板聚集减低和不聚集。巨大血小板综合征：ADP、胶原和花生四烯酸诱导的血小板聚集正常，但瑞斯托霉素诱导的血小板不凝集。贮存池病：致密颗粒缺陷时，ADP诱导的聚集常减低，无二相聚集；胶原和花生四烯酸诱导的血小板聚集正常；颗粒缺陷时，血小板凝集和聚集均正常。血小板花生四烯酸代谢缺陷：ADP诱导的聚集常减低，无二相聚集，胶原

17、和花生四烯酸诱导的血小板聚集均低下。（4）操作注意事项1）采血顺利，避免反复穿刺将组织液抽到注射器内，或将气泡混入。2）抗凝剂采用枸橼酸钠抗凝，不能以EDTA作为抗凝剂。3）阿司匹林、潘生丁、肝素、华法林等药物均可抑制血小板聚集，故采血前一段时间不应服用此类药物。4）测定应在采血后3h内完成，时间过长会导致聚集强度和速度降低。要点10：血小板释放反应产物测定-血小板球蛋白（-thromboglobulin，-TG）和血小板第四因子（platelet factor4，PF4）是血小板颗粒中特有的蛋白。当体内有多的血小板被激活，释放反应亢进时，两者血浆中的浓度升高，因此，-TG和PF4是血小板活化

18、的重要指标。采用免疫法测定（ELISA）。（1）增高：反映血小板被激活及其释放反应亢进，见于血栓前状态和（或）血栓性疾病，如心肌梗死、脑血管病变、尿毒症、妊娠期高血压疾病、糖尿病、肾病综合征、弥散性血管内凝血（DIC）、静脉血栓形成等。（2）减低：见于先天性或获得性贮存池病（颗粒缺陷症）。注意事项注意避免血小板体外被活化，否则导致假阳性。另外，当肾脏排泄功能异常、血小板破坏过多时，血浆-TG和PF4也可增高，因此，在评价其临床意义时应除外影响因素。要点11：血浆TXB2测定（1）增高见于血栓前状态和血栓性疾病，如心肌梗死、心绞痛、糖尿病，动脉粥样硬化、妊高症、深静脉血栓形成、肺梗死、肾小球疾病

19、、高脂血症、大手术后等。（2）减低见于环氧酶或TX合成酶缺乏症、服用抑制环氧酶或TX合成酶的药物如阿司匹林、苯磺唑酮、咪唑及其衍生物等。注意事项：注意避免血小板体外被活化，否则导致假阳性。要点12：血小板膜糖蛋白（platelet membrane glycoprotein，GP）测定血小板膜糖蛋白分为质膜糖蛋白和颗粒膜糖蛋白，前者包括GPb-、GPb-a、Gpa-a等，后者包括CD62P和CD63。CD62P又称P-选择素、GMP140，在未活化的血小板上，CD62P分子仅表达于颗粒膜上。活化后，CD62P分子在质膜呈高表达。CD63在静止血小板仅分布于溶酶体膜，血小板活化后随脱颗粒而表达在

20、血小板膜表面。因此CD62P和CD63在质膜上高表达被视为血小板活化的分子标志物。血小板膜糖蛋白平均分子数的参考范围种类静止血小板（个分子）TRAP活化血小板（个分子）GPb（CD42a）25 00043 0006 00022 000GPb/a（CD41a）30 00054 00046 00080 000GPa（CD61）42 00060 00052 00080 000CD62P（GMP140）50010 000临床意义1）血小板功能缺陷GPb缺乏，见于巨大血小板综合征；GPb/a缺乏，见于血小板无力症；活化后CD62P表达减低或缺乏，见于血小板贮存池缺陷病。2）血栓前或血栓性疾病CD62P、

21、CD63表达增加是血小板活化的特异性分子标志物。见于急性心肌梗死、心绞痛、急性脑梗死、糖尿病（DM）、高血压、外周动脉血管病均可见血小板活化显著增加。注意事项分析血小板活化时，必须注意血液标本采集与样本处理过程中可能导致的体外激活，避免出现假阳性结果。要点13：血块收缩试验（clot retraction test，CRT）（1）原理：在富含血小板血浆中加入Ca2和凝血酶，使血浆凝固形成凝块，血小板收缩蛋白使血小板伸出伪足，伪足前端连接到纤维蛋白束上。当伪足向心性收缩，使纤维蛋白网眼缩小，测定析出血清的体积可反映血小板血块收缩能力。（2）参考范围：血块收缩率48%64%。（3）临床意义1）减低

22、：见于原发性血小板减少性紫癜、血小板增多症、血小板无力症、红细胞增多症、低（无）纤维蛋白原血症、多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症等。2）增高：见于先天性（遗传性）因子缺乏症等。五、凝血因子的检测要点14：血浆纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）含量测定（1）原理：FIB检测有凝血酶凝固法（Clanss法）、比浊法（PT衍生法）以及免疫学方法等。Clauss法以凝血酶作用于待测血浆中的FIB，使其转变为纤维蛋白，血浆凝固。血浆中FIB的含量与凝固时间呈负相关，检测结果与参比血浆制成的标准曲线对比可得出纤维蛋白原的含量。PT衍生法当PT测定完成时，纤维蛋白原转变为纤维蛋白，其形成的浊度与FI

23、B的含量成正比，因此无需另加任何试剂，即可由产生的浊度，用终点法或速率法算出FIB含量。免疫学方法是利用抗FIB多克隆抗体与FIB特异性结合反应进行测定。方法有免疫浊度、单向免疫扩散和ELISA等。（2）参考范围：（24）g/L。（3）临床意义1）增高见于糖尿病、急性心肌梗死、急性传染病、结缔组织病、急性肾炎、多发性骨髓瘤、休克、大手术后、妊高症、急性感染、恶性肿瘤和应急状态等。2）降低见于先天性低或无FIB血症、遗传性FIB异常、DIC、原发性纤溶症、重症肝炎和肝硬化等。（4）方法学评价Clanss法和PT衍生法测定的是纤维蛋白原的功能，由于FIB的异质性，当FDP增高时，Clauss法测定

24、结果会受到影响；免疫学方法测定的是纤维蛋白原的含量。要点15：血浆因子、和的促凝活性测定临床意义（1）增高主要见于血栓前状态和血栓性疾病，如静脉血栓形成、肺栓塞、妊高症、晚期妊娠、口服避孕药、肾病综合征、恶性肿瘤等。（2）减低F：C减低见于血友病A、血管性血友病、血中存在因子抗体、DIC；F：C减低见于血友病B、肝脏病、维生素K缺乏症、DIC、口服抗凝药物；F：C减低见于因子缺乏症、肝脏疾病、DIC等；F：C减低见于先天性因子缺乏症、肝脏疾病、DIC和某些血栓性疾病等。注意事项1）F：C：在急性时相反应时可明显升高，在严重肝实质损伤时，F：C可明显升高。F：C减低时，需与vWF含量同时测定，以

25、筛选出vWF缺陷的可能。2）目前认为，凝血因子促凝活性测定不必等待逐级筛选和纠正试验的结果，可以在单纯APTT延长时检测。3）受检标本检测凝固时间不在标准曲线范围可稀释后检测。要点16：血浆因子、和的促凝活性测定临床意义（1）增高：见于血栓前状态和血栓性疾病。（2）减低见于维生素K缺乏症（F除外）、肝脏疾病、DIC、口服抗凝剂和血中存在相应的抑制物，先天性因子、和缺乏症较罕见。目前因子F：C、F：C、F：C和F：C的测定主要用于肝脏受损的检查，因子：C在肝脏早期可下降，因子的测定在肝损伤和肝移植中应用较多。要点17：血浆因子定性试验本实验简单、可靠，是十分有用的过筛试验。在临床上若发现伤口愈合

26、缓慢、渗血不断或怀疑有因子缺陷者，可首选本试验。若纤维蛋白在24h内，尤其是2h内完全溶解，表示因子缺乏，见于先天性因子缺乏或获得性因子缺乏，后者见于肝脏疾病、SLE、类风湿关节炎、恶性淋巴瘤、转移性肝癌、DIC、原发性纤溶等。六、抗凝物质测定要点18：抗凝血酶（antithrombin activity，AT-：A）测定1）血浆抗凝血酶活性测定：采用发色底物法：受检血浆中加入过量凝血酶，使AT-与凝血酶形成1：1复合物，剩余的凝血酶作用于发色底物S-2238，释出显色基因-对硝基苯胺（PNA），显色的深浅与剩余凝血酶呈正相关，而与AT-呈负相关。根据标准曲线计算出AT：A的含量。2）血浆抗凝

27、血酶抗原（AT：Ag）检测：采用免疫学方法。临床意义增高：见于血友病、白血病和再生障碍性贫血等的急性出血期以及口服抗凝药物治疗过程中。减低：见于先天性和获得性AT-缺乏症，后者见于血栓前状态、血栓性疾病和肝脏疾病、肾病综合征等。评价标本不能用肝素抗凝。AT-抗原和活性测定最好同时检测，以利于进行先天性AT-缺乏的分型。在疑难DIC诊断时，AT-水平下降具有诊断价值；急性白血病时AT-水平降低更可看作是DIC发生的信号；抗凝治疗中，如怀疑肝素抵抗，可测定AT-来确定；抗凝血酶代替治疗时，也应首选AT-检测来监测。要点19：血浆蛋白C（protein C，PC）测定包括血浆蛋白C活性（protei

28、n C activity，PC：A）测定和血浆蛋白C抗原（protein C antigen，PC：Ag）测定。临床意义：减低见于先天性PC缺陷：根据PC：A和PC：Ag可分为型（PC：Ag与PC：A均减低）和型（PC：Ag正常而PC：A减低）；获得性PC缺陷：DIC、肝功能不全、手术后、口服双香豆素抗凝剂、呼吸窘迫综合征等。要点20：血浆蛋白S测定包括血浆总蛋白S测定和血浆游离蛋白S（free protein S，FPS）测定。临床意义减低见于先天性和获得性PS缺陷症，后者见于肝脏疾病、口服抗凝药物等。七、病理性抗凝物检测要点21：狼疮抗凝物质（lupus anticoagulants，LAC）测定（1）筛检试验1）原理：在脑磷脂和激活剂存在的条件下，检测血浆凝固时间（APTT）。若被检血浆中有狼疮抗凝物质存在，则血浆凝固时间（APTT）延长。2）参考值：（37.54.5）s3）临床意义：筛检试验的血浆凝固时间延长（筛检试验阳性）见于：有狼疮抗凝物质存在的患者、先天性凝血因子缺乏、口服抗凝剂、肝素治疗以及DIC等。（2）确诊试验1）原理：筛检是阳性的血浆，若属于有狼疮抗凝物质存在者，则在加入血小板溶解物后，延长的APTT被纠正。2）结果判断：筛选试验测定值/确诊试验测定值0.81.2.若筛查试验和确诊试验的凝固时间都延长