急性脑梗死患者外周血单个核细胞Toll样受体4的表达与临床的相关性.docx

1、急性脑梗死患者外周血单个核细胞Toll样受体4的表达与临床的相关性急性脑梗死患者外周血单个核细胞Toll样受体4的表达与临床的相关性（作者:_单位: _邮编: _） 【摘要】 目的: 探讨急性脑梗死患者外周血单核细胞Toll样受体4(TLR4)的表达及其与患者的临床亚型及病情严重程度的相关性。方法: 采用流式细胞仪分析技术和实时定量RT PCR技术分别测定66例急性脑梗死患者外周血单核细胞Toll样受体4的表达水平, 于入院3 d内病情稳定后对患者进行临床神经功能缺损程度评分, 并按照Oxford Community Stroke Project完成脑梗死患者的临床分型。结果: 与健康对照组相

2、比, 急性脑梗死患者外周血单个核细胞(PBMC)中TLR4蛋白表达的阳性率(66.8716.27)%及表达量(即荧光强度, 11.624.39)均显著升高, 差异有统计学意义(P0.01)。66例脑梗死按照Oxford Community Stroke Project临床分型, 分为TACI 9例、 PACI 39例、 POCI 7例和LACI 11 例, PBMC中TLR4蛋白和mRNA的表达量在各组间的差异均无统计学意义; 按神经功能缺损程度评分标准将66例患者分为轻型27例、 中型30例和重型9例, 各组PBMC中TLR4蛋白和mRNA的表达量差异有统计学意义 (P0.05)。PBMC中

3、TLR4蛋白和mRNA的表达量与病情的严重程度均呈正相关(P0.05)。结论: 外周血单核细胞Toll样受体4的表达增高与急脑梗死的发生和严重程度有密切关系, 是脑梗死发病的一个危险因素。 【关键词】 Toll样受体4; 急性脑梗死; 脑梗死临床分型; 神经功能缺损程度Abstract AIM: To investigate the expression of Toll like receptor 4 (TLR4) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients with acute cerebral infarction an

4、d its correlation with clinical subtypes and the severity of the disease. METHODS: The levels of mRNA and protein of TLR4 in PBMC of 66 patients with acute cerebral infraction were examined by real time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR) and flow cytometry (FCM), r

5、espectively. Clinical neurological deficit score and OCSP (Oxford Community Stroke Project) clinical subtype were performed in the patients within 3 days after admission. RESULTS: The expression of TLR4 in PBMC of patients with acute cerebral infraction (positive rate: 66.8716.27%, fluorescence inte

6、nsity: 11.62 4.39) was significantly higher than normal controls (P0.01, respectively). 66 patients were divided into 4 groups based on OCSP. There were 9 patients with TACI, 39 patients with PACI, 7 patients with POCI, and 11 patients with LACI. The differences in the expression levels of TLR4 prot

7、ein and mRNA in these groups have no statistic significance. Meanwhile, there were 27 mild cases, 30 median cases, and 9 severe cases according to the neurological deficit score. The differences in the expression levels of TLR4 protein and mRNA in these groups have statistic significance (P0.05). Th

8、e expression of TLR4 protein and mRNA were correlated positively with the severity of the disease (r=0.85, 0.87; P=0.01, 0.01). CONCLUSION: The increased expression of TLR4 may be associated with the progression of acute cerebral infarction. It may be a risk factor of acute cerebral infarction.Keywo

9、rdsToll like receptor 4; acute cerebral infarction; cerebral infarction clinical subtype; neurological deficit score急性脑梗死(acute cerebral infarction, ACI)是神经系统的常见病和多发病, 其病理生理改变主要有细胞能量代谢障碍、 细胞内钙超载、 自由基、 兴奋性氨基酸毒性作用、 炎症反应和部分细胞凋亡等1, 2。Toll样受体(Toll like receptor, TLR)分布广泛, 主要表达于单核细胞、 巨噬细胞、 树突细胞等细胞膜上, 是与微生

10、物识别有关的天然免疫受体家族, 属模式识别受体3。TLRs最突出的生物学功能是促进细胞因子的合成与释放, 引发炎症反应; 另一项功能是促进抗原提呈细胞的成熟, 从而诱导机体的获得性免疫反应4。因此, TLRs是机体介导天然免疫转向获得性免疫的桥梁。1997年, TLR4首次被发现, 随后经研究证实, TLR4在抗细菌、 抗病毒的炎症反应中, 以及在应激状态下均发挥重要作用5。我们对TLR4在急性脑梗死患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中的表达及其与患者临床亚型及病情严重程度的相关性进行研究, 探索急性脑梗死患者体内炎症的调节

11、机制。1 对象和方法1.1 对象 2006-10/2009-02收集我院神经内科的急性脑梗死患者66例, 其中男38例, 女28 例, 年龄63.16 9.45岁。临床诊断标准参见1995 年全国第4 届脑血管病学术会议制定的标准。排除既往有脑卒中、 短暂性脑缺血发作、 心肌梗死、 糖尿病、 甲状腺疾病、 肝肾功能不全、 自身免疫性疾病、 使用激素或免疫抑制剂者、 胃部疾病及巨幼细胞贫血病史者。入院3 d内病情稳定后完成脑血栓形成患者临床神经功能缺损程度评分6和按OCSP (Oxford Community Stroke Project)7完成脑梗死临床分型。对照组为同期体检证实的健康者, 共

12、60例, 其中男36例, 女24例, 年龄(61.0811.26)岁。1.2 方法1.2.1 标本采集及处理 取禁食12 h以上、 清晨空腹肘静脉血5 mL, 以EDTA 二钾盐抗凝。0.4 mL用于流式细胞仪检测, 其余样品250 g/min 离心5 min, 吸出血浆, 加入与血浆等体积的生理盐水, 旋涡器上混匀, 以Ficoll分层液(为中国医学科学研究院血液学研究所产品)分离收获单个核细胞, 加入RNAlater 200 L, 打散细胞沉淀, 4保存23 h, 转-20下冷冻保存备用。1.2 2 流式细胞仪检测PBMC中TLR4蛋白的表达量 标本收集完毕后, 复苏PBMC, 以PBS

13、液调整细胞密度为2109/L, 取细胞悬液100 L, 加入5 L藻红蛋白(phycoerythrin, PE) 交联的小鼠抗人TLR4 单克隆抗体(mAb)(eBioscience, San Diego, CA, USA), 以PE交联小鼠IgG2a 抗体(eBioscience, San Diego, CA, USA) 作为阴性对照。室温避光孵育30 min后, 与适量的红细胞裂解液混合, 然后用含有牛血清白蛋白和叠氮化钠的去污液洗涤2 次, 用500 L 去污液重悬细胞后上流式细胞仪(Becton Dickinson FACS Calibur) 检测, 测定PBMC的TLR4蛋白的表达量

14、。1.2.3 实时定量RT PCR检测PBMC 中TLR4 mRNA的表达量 (1)总RNA提取: 采用TRIzol一步法快速提取细胞总RNA并测定A260和A280值, 计算总RNA浓度。(2)cDNA 合成: 采用AMV逆转录酶法。反应总体积10 L, 总RNA 模板250 ng, 25 mmol/ L MgCl2 2 L, 10逆转录反应缓冲液1 L, 各10 mmol/L的dNTPs 混合物1 L, RNA 酶抑制剂0.25 L, 5 U/L AMV逆转录酶0.5 L, Oligo dT2 Adaptor 0.5 L, 以无RNA 酶的灭菌水补充体积到10 L, 混均后离心。PCR仪上

15、42反应30 min, 然后99加热5 min, 冰浴保存备用。(3)实时定量RT PCR: Bio Rad iCycler 实时定量PCR 仪检测PBMC中TLR4 mRNA的表达量, 以 acin作内参。引物、 FAM标记的探针由上海生工公司合成。引物序列如下: TLR4, 上游引物5 AGA GCT GAA ATG GAG GCA CC 3, 下游引物5 AGG ACC GAG GCA GCT CTT G 3, 扩增产物长325 bp; acin, 上游引物5 CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA CGA 3, 下游引物5 CAG CGG AAC CGC TCA TTG

16、 CCA ATG 3, 扩增产物长300 bp。反应总体积25 L: 10 mol/L 上下游引物各0.5 L, 5 mol/L探针0. 6 L, 逆转录物1 L, 5Real time PCR Buffer 5 L, 各10 mmol/L dNTPs Mixtrue 0. 75 L, 250 mmol/L Mg2+ Solution 0.5 L, 以无RNA 酶的灭菌水补充体积到25 L。PCR反应条件: 94 1 min, 然后95 15 s , 65 25 s, 共循环45 次。计算方法: 以同一份标本的TLR4 拷贝数/ acin 拷贝数表示TLR4 基因表达量。1.2.4 统计学分析

17、 所有数据用SPSS13.0处理, 计量资料均用xs形式表示; 采用2检验、 t检验、 方差分析。P0.05为差异具有统计学意义。2 结果2.1 急性脑梗死患者PBMC中TLR4蛋白的表达水平 与健康对照组相比, 急性脑梗死患者PBMC中TLR4蛋白表达的阳性率及表达量(即荧光强度)均显著升高, 差异有统计学意义(P0.01, 表1 )。表1 急性脑梗死患者PBMC中TLR4蛋白表达流式细胞仪检测结果 2.2 急性脑梗死患者PBMC中TLR4mRNA的表达水平 实时定量RT PCR 法检测急性脑梗死患者PBMC中TLR4 mRNA 的表达。标准曲线的相关系数为0. 998, 表明标准曲线可靠。

18、结果显示: 在ACI 组TLR4mRNA的相对表达量为2.060.28, 明显高于健康对照组(0.270. 06), 差异有统计学意义(P0.05), 与TLR4 蛋白表达的检测结果一致。2.3 急性脑梗死患者PBMC中TLR4的表达量与脑梗死临床亚型的相关性 66例脑梗死患者按照Oxford Community Stroke Project完成脑梗死患者的临床分型, 分为TACI 9例、 PACI 39例、 POCI 7例和LACI 11 例, 各组PBMC中TLR4蛋白和mRNA的表达量见表2, 组间差异无统计学意义(P0.05)。可见, PBMC中TLR4的表达水平与脑梗死临床分型无关。

19、2.4 急性脑梗死患者PBMC中TLR4的表达量与脑梗死病情严重程度的相关性 66例脑梗死患者按神经功能缺损程度评分标准将病例组患者分为轻型27例、 中型30例和重型9例, 各组PBMC中TLR4蛋白和mRNA的表达量见表3, 组间差异有统计学意义 (P0.05)。PBMC中TLR4蛋白和mRNA的表达量与病情的严重程度均呈正相关(r=0.85, 0.87; P0.05)。表2 急性脑梗死患者PBMC中TLR4的表达量与脑梗死临床亚型的相关性表3 急性脑梗死患者PBMC中TLR4的表达量与脑梗死病情严重程度的相关性3 讨论有研究发现8, 小鼠缺血再灌注后, TLR4 缺陷小鼠的脑含水量、 脑梗

20、死面积及神经功能缺损评分均明显低于TLR4 功能正常的小鼠, 说明TLR4在脑缺血再灌注损伤中发挥着重要作用, 同时发现TLR4 缺陷降低了脑缺血再灌注的损伤可能是通过降低炎性细胞因子的产生而降低再灌注后脑组织的炎性损害。另有研究显示9, 中枢神经系统表达TLR4 的主要细胞是小胶质细胞。脑梗死时缺血缺氧所促发的血管内皮通透性改变, 脑组织坏死物质释放, 吸引外源性的单核/巨噬细胞、 淋巴细胞趋化聚集, 成为加剧炎性损伤的效应细胞, 这些细胞均有丰富的TLR4表达。前期的研究发现脑梗死患者急性期外周血单核细胞TLR4 mRNA表达上调, 由此通过促使炎性因子产生分泌增多来介导脑缺血炎性损伤10

21、。本研究我们分析了急性脑梗死患者外周血单核细胞中TLR4的表达情况, 及其与疾病临床亚型和病情严重程度的相关性。与健康对照组相比, 急性脑梗死患者PBMC细胞TLR4 蛋白及mRNA明显增高, 并与病情的严重程度呈正相关。此结果与目前TLR4在动脉阻塞疾病、 心肌缺血再灌注损伤、 肝脏缺血再灌注损伤的结果基本一致, 即TLR4参与了急性脑梗死后的缺血性炎症损伤。综上所述, 外周血单核细胞TLR4的表达增高与急性脑梗死的发生和严重程度有密切关系, 是脑梗死发病的一个危险因素, 通过检测外周血单核细胞TLR4的表达水平可以识别脑梗死的高危患者, 有利于采取积极措施对疾病进行合理的控制和监测。【参考

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